Содержание к диссертации
Глава I.
Обзор литературы 10
Вводная часть 10
1.1. Цинк в контроле созревания и регуляции функциональной
активности клеток иммунной системы 13
п. 1.1.1. Клеточные иммунные реакции 14
п. 1.1.2. Гуморальные иммунные реакции 15
п. 1.1.3. Апоптоз 15
п. 1.1.4. Проблема дефицита цинка в функционировании иммунной
системы 17
1.2. Катионы цинка в физиологии организма и основных
метаболических процессах. Вопросы транспорта катионов 19
п. 1.2.1. Общие сведения об обмене цинка в организме 19
п. 1.2.2. Транспортеры цинка в поддержании его гомеостаза 21
1.3. Возможности обмена цинком между биомакромолекулами.
Клеточные функции в условиях обмена катионами металла в
микроокружении 23
п. 1.3.1. Металлосвязывающие сайты и встроенные катионы в
структурировании и функционировании белковых молекул 24
п. 1.3.2. Аминокислотные последовательности IgG - основа
формирования металлосвязывающих сайтов в структуре молекулы белка
п. 1.3.3. Шарнирная область молекулы IgG и ее роль в связывании
металлов 29
п. 1.3.4. Олигосахариды талии молекулы IgG и их возможное участие в
хелатировании катионов металлов 31
п. 1.3.5. Fc рецепторы как связующее звено в передаче сигнала от
молекул антител клеткам-эффекторам 34
п. 1.3.6. Обмен металлов в микроокружении клетки. Подходы к
исследованию 36
Краткое заключение. Постановка экспериментальной задачи 39
Глава П.
Материалы и методы исследования 41
2.1. Изучение взаимодействия pi связывания катионов цинка с
человеческим сывороточным у-глобулином 41
2.2. Получение и иммунохимическая характеристика образцов у-
глобулина, модифицированного катионами цинка 43
2.3 Оценка эффекторных функций модифицированного цинком у-
глобулина 46
Глава III.
Результаты собственных исследований и их обсуждение 51
3.1. Взаимодействие человеческого сывороточного у-глобулина с
катионами цинка в растворе 51
3.2. Связывание катионов цинка с человеческим сывороточным у-
глобулином 64
3.3. Получение образцов человеческого сывороточного у-глобулина, модифицированного цинком, и их иммунохимическая характеристика ... 70
п.3.3.1. Исследование образцов у-глобулина, модифицированного
значительным молярным избытком цинка 70
п.3.3.2. Исследование образцов у-глобулина, модифицированного
умеренным молярным избытком цинка 77
п.3.3.3. Исследование образцов у-глобулина, модифицированного
эквимолярным связыванием катионов цинка 84
3.4. Оценка эффекторных функций модифицированного цинком у-
глобулина 93
п.3.4.1. Индукция интерферона человеческим сывороточным у-
глобулином, модифицированным цинком 95
п.3.4.2. Первичная характеристика индуцируемого ИФН
(чувствительность к обработке кислотой) 97
п. 3.4.3. Установление типоспецифичности индуцируемого ИФН
(реакция нейтрализации) 100
п.3.4.4. Возможность десорбции катионов цинка молекулами
связавшего металл белка 102
Заключение 108
Выводы 118
Практические рекомендации 120
Список литературы 121
Благодарности 139
Введение к работе
Актуальность работы.
Работы последнего времени позволяют предполагать, что иммуноглобулины, как и другие белки плазмы крови, способны связывать, транспортировать, донорствовать катионы металлов и влиять таким образом на эффекторные функции других макромолекул [3, 55, 60-62].
Известно, что цинк активно связывается белками, гликопротеинами и аминокислотами плазмы крови, что определяет достаточно стабильный уровень присутствия этих катионов в биологических жидкостях и тканях организма [1, 48, 69, 85, 88, ПО, 118, 126, 152]. При этом образование белковых металлокомплексов с цинком приводит к существенным изменениям в реализации функциональных свойств биополимеров [85, 92, 109, 110,113,131, 152].
Катионы цинка входят в состав металлоферментов, где образуют поперечные связи в активных центрах, участвуют в формировании структуры активного центра и его конформационной динамики [6, 8, 20, 36, 38,73, 166].
Многообразна роль цинка в иммуногенезе. Он определяет биологическую активность тимулина, контролирует ранние стадии созревания Т-лимфоцитов, апоптоз, играет важную роль в обеспечении выработки и рецепции цитокинов, непосредственно участвует в основных иммунных реакциях [75, 89, 92, 103, 115, 125, 137, 152, 168].
Физиологическое содержание цинка в плазме оценивают на уровне 10-20 мкМ, а концентрация свободных, биологически активных катионов составляет порядка 0.2-1.0 нМ [85, 101, 109, ПО, 152]. Поэтому, хелатирование даже незначительных количеств катионов белками сыворотки может создавать дефицит цинка в микроокружении, изменяя тем самым интенсивность и динамику зависимых от присутствия металла гуморальных и клеточных иммунных реакций.
С другой стороны, сами белки, хелатирующие металл в ходе нормальных межмолекулярных взаимодействий, могут претерпевать конформационные и антигенные преобразования и обретать новые эффекторные свойства — не реализуемые ими в нативной конформации [38, 43,57,73,85, 109,110].
С этих позиций взаимодействие белков плазмы крови с катионами цинка ранее не рассматривалось, а структурное обеспечение, динамика и исход подобных процессов в клеточных системах остаются неизученными.
Целью работы явилась конформационная и ангигенная
характеристика человеческого сывороточного у-глобулина,
модифицированного связыванием катионов цинка, а также оценка эффекторных функций трансформированного металлом белка.
Решались следующие конкретные задачи.
1. Изучить конформационные преобразования человеческого
сывороточного у-глобулина при взаимодействии с катионами цинка в
растворе.
Оценить параметры связывания цинка с у-глобулином сыворотки крови человека.
Получить и охарактеризовать образцы модифицированного цинком у-глобулина, оценить конформационное состояние белка.
Провести иммунохимическое исследование модифицированного у-глобулина с использованием реакций радиальной иммунодиффузии и иммуноферментного анализа (ИФА).
5. Оценить способность модифицированного цинком у-глобулина
индуцировать выработку интерферона (ИФН) клетками периферической
крови человека.
Научная новизна исследования.
В работе впервые получены и исследованы образцы человеческого сывороточного у-глобулина, модифицированного присоединением катионов цинка. Описаны конформационные преобразования молекулы белка, вызываемые связыванием металла. Оценены оптические эффекты взаимодействия у-глобулина с катионами цинка в растворе, рассчитаны количественные характеристики этого взаимодействия - константы и число сайтов связывания. Установлено, что встраивание катионов цинка в молекулу белка происходит по нескольким группам неэквивалентных, различающихся пространственной локализацией и зависимых друг от друга участков связывания, заполнение которых металлом подчиняется динамике, определяемой количеством присоединенных катионов.
Обнаружено, что в результате связывания металла изменяется спектр экспрессируемых белком специфических антигенных детерминант. При этом установлено, что в условиях, приближенных к физиологическим, образования новых антигенных детерминант белка и формирования новой антигенной специфичности, которая могла бы индуцировать в организме выработку антител к собственному, модифицированному цинком, у-глобулину, с большой вероятностью, не происходит.
Впервые показано, что модифицированный цинком у-глобулин индуцирует выработку ИФН лейкоцитами периферической крови здоровых доноров in vitro. Уровень индукции ИФН - ниже, чем в присутствии контрольного белка и катионов цинка, примененных изолированно. По совокупности оцененных свойств, ИФН, вырабатываемый в условиях индукции связавшим металл у-глобулином, правомочно относить к ИФН-у.
В работе впервые обоснованы представления о первичной трансформации в результате связывания катионов цинка Fc фрагментов молекул антител (запускающих внутриклеточную сигнализацию с активируемых лигандом Fc рецепторов).
Теоретическая значимость работы определяется получением данных
об изменениях конформации и антигенных характеристик молекул антител,
которые могут происходить за счет хелатирования катионов цинка в ходе
нормального, физиологического обмена металлом между
биомакромолекулами плазмы крови. Указанные изменения правомочно рассматривать как основу реализации новых эффекторных свойств белков у-глобулиновой фракции в отношении регулируемых ими функций клеток иммунной системы. Сказанное подтверждается результатами, свидетельствующими об изменении функционирования клеток-продуцентов ИФН в условиях индукции модифицированным цинком у-глобулином.
Практическая значимость результатов состоит в обосновании принципиальной возможности разработки алгоритмов для получения (путем модификации катионами цинка) иммуноглобулинов с заданными эффекторными свойствами.
Результаты исследования указывают на ограничение возможностей
использования в диагностической практике реакции Манчини: в условиях
изменения транспорта и обмена катионов металлов или белкового спектра
плазмы крови показатели содержания связавших цинк белков (в частности -
антител), определяемые методом одномерной радиальной
иммунодиффузии, могут не соответствовать их реальному количеству в сыворотке крови обследуемого. Учет результатов реакции Манчини должен тогда осуществляться с использованием поправочных коэффициентов.
