Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. современное состояние проблемы
1.1. Общие сведения о наночастицах и наноматериалах 14
1.2. Применение наноматериалов в товарах народного потребления 19
1.3. Законодательная и нормативно-методическая база по оценке и контролю за безопасностью нанотехнологий и наноматериалов в РФ и за рубежом 23
1.4. Современные методы оценки и безопасности наноматериалов 28
1.5. Обзор современных токсикологических данных по токсичности наночастиц серебра, титана, цинка 35
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Характеристика исследуемых образцов наноразмерных частиц серебра, титана, цинка 44
2.2. Исследование общетоксического действия in vivo на лабораторных животных 46
2.3. Исследование общетоксического действия in vitro на модели спермы крупного рогатого скота 50
2.4. Исследование общетоксического действия in vitro на модели люминесцентных бактерий «Эколюм» 53
2.5. Исследование раздражающего действия in vivo на кожу и слизистые оболочки лабораторных животных 56
2.6. Исследование раздражающего действия in vitro методом ультразвуковой допплерографии на хориоаллантоисную оболочку куриного эмбриона 61
Глава 3. Сравнительная оценка общетоксического и раздражающего действия нч серебра IN VIVO и IN VITRO
3.1. Оценка общетоксического действия в опытах in vivo 65
3.2. Оценка общетоксического действия в опытах in vitro 67
3.3. Оценка раздражающего действия в опытах in vivo 73
3.4. Оценка раздражающего действия в опытах in vitro 74
3.5. Результаты сравнительной оценки общетоксического
и раздражающего действия in vivo и in vitro 75
Глава 4. Сравнительная оценка общетоксического и раздражающего действия нч цинка IN VIVO и IN VITRO
4.1. Оценка общетоксического действия в опытах in vivo 81
4.2. Оценка общетоксического действия в опытах in vitro 83
4.3. Оценка раздражающего действия в опытах in vivo 88
4.4. Оценка раздражающего действия в опытах in vitro 89
4.5. Результаты сравнительной оценки общетоксического
и раздражающего действия in vivo и in vitro 90
Глава 5. Сравнительная оценка общетоксического и раздражающего действия нч титана диоксида IN VIVO и IN VITRO
5.1. Оценка общетоксического действия в опытах in vivo 95
5.2. Оценка общетоксического действия в опытах in vitro 97
5.3. Оценка раздражающего действия in в опытах vivo . 101
5.4. Оценка раздражающего действия in в опытах vitro 102
5.5. Результаты сравнительной оценки общетоксического и раздражающего действия in vivo и in vitro 103
Заключение . 109
Выводы . 125
Литература 127
- Законодательная и нормативно-методическая база по оценке и контролю за безопасностью нанотехнологий и наноматериалов в РФ и за рубежом
- Исследование общетоксического действия in vitro на модели спермы крупного рогатого скота
- Оценка общетоксического действия в опытах in vitro
- Оценка раздражающего действия в опытах in vivo
Введение к работе
Актуальность темы
Нанотехнологии в настоящее время рассматриваются как новая промышленная революция. Создание структур в нанометровом диапазоне позволяет придать им принципиально новые свойства, такие как уникальная механическая прочность, особые спектральные, электрические, магнитные, химические и биологические характеристики. Области применения наноматериалов (НМ) в современной науке и технике чрезвычайно разнообразны [Онищенко Г. Г. 2010]. Преобладающее место в структуре потребительской продукции наноиндустрии занимает косметическая продукция - 73%; пищевая продукция и упаковка для пищевых продуктов -10%; строительные материалы и бытовая химия - 8%; медицинские изделия -2% [Хотимченко С.А., Гмошинский И.В., Казак А.А., 2014].
В связи с тем, что в число наиболее приоритетных нановеществ, используемых в различных товарах народного потребления, входят серебро, соединения цинка и титана (парфюмерно-косметическая, пищевая и лакокрасочная продукция, медицинские изделия, упаковка для пищевых продуктов) вопросы оценки их опасности для здоровья человека становятся особенно актуальными.
В соответствии с «Концепцией токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов», утверждённой Постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 31 октября 2007 г. N 79, перед Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека стоит чрезвычайно важная задача по экспертной оценке токсичности и безопасному регулированию НМ и наносодержащей продукции, обращающейся на территории РФ и других стран ЕврАзЭС.
Количество промышленно производимых НМ и наносодержащей продукции ежегодно существенно увеличивается [Гмошинский И.В., Смирнова В.В., Хотимченко С.А., 2010; Попов Н.И., Филиппов А.П., Хуршудян С.А., 2009], что затрудняет проведение оценки безопасности всех важнейших НМ обычными классическими токсикологическими методами, т.к. для этого необходимы время, большие трудозатраты и материальные ресурсы. Поэтому одним из путей интенсификации испытаний и снижения их себестоимости является применение ускоренных токсикологических
исследований на простых биологических системах, позволяющих проводить испытания in vitro.
Всё возрастающая на рынке страны номенклатура продукции, содержащей нановещества и НМ, и стоящие перед Роспотребнадзором задачи обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения требуют при проведении экспресс-оценки инновационных продуктов наноиндустрии использования альтернативных методов in vitro, наиболее эквивалентных методам in vivo. В связи с этим возникает проблема необходимости выбора среди разнообразных методик и тест-систем таких, которые были бы наиболее информативны, стандартизованы, имели объективную цифровую оценку результатов и хорошо коррелировали с данными, полученными на животных.
В соответствии с требованиями Технических Регламентов Таможенного Союза - ТР ТС 009/2011 «О безопасности парфюмерно-косметической продукции», ТР ТС 008/2011 «О безопасности игрушек», утвержденных 23 сентября 2011г. и Единых санитарно-эпидемиологических и гигиенических требований к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) раздел 5. Требования к товарам бытовой химии и лакокрасочным материалам и раздел 20. Требования к дезинфицирующим средствам, утвержденных 28 мая 2010 г. для оценки токсикологических показателей безопасности органами и организациями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека активно применяются такие альтернативные модели, как фотобактерии «Эколюм», сперма КРС и сосуды ХАО куриного эмбриона.
Степень разработанности проблемы
Несмотря на большое количество в отечественной и зарубежной литературе публикаций о токсичности некоторых НМ, значительная часть из них посвящена исследованиям на животных [Распопов Р.В., 2011; Шумакова А. А., 2011; Смирнова В .В., 2012; Бочарова Л .Ю., 2014; Rahman М. F., 2009; Kim Y .S., 2010; Pasupuleti S., 2012].
Следует отметить, что классические токсикологические исследования, проводимые на животных, трудоёмки, дорогостоящи и не позволяют справиться с всё возрастающими объёмами токсикологической экспертизы продукции, обращающейся как на мировом рынке, так и на территории
Российской Федерации. Поэтому разработка и внедрение альтернативных методов in vitro стали одним из ведущих направлений токсикологических исследований в мире.
Необходимо отметить, что имеющиеся результаты исследований на гидробионтах [Гремячих В. А., Томилина И. И. 2013; Skjolding L .М. 2014; Rosenfeldt R. R. 2014; Mwaanga Р. 2014] более приемлемы в области экологической токсикологии, а исследования на культурах клеток [Chiang Н. М. 2012; Demir Е. 2013; Tilton S. С. 2013; Sahu D. 2013] позволяют оценить лишь узкоспецифическое действие, что не всегда отвечает задачам Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по экспертной оценке токсичности НМ и наносодержащей продукции.
В доступной литературе отсутствует информация о сравнительной оценке токсичности наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида в экспериментах in vitro и in vivo. Данные обстоятельства определили цель настоящего исследования.
Цель исследования: Сравнительная оценка эффективности экспресс-методов исследования токсических свойств наноматериалов.
Задачи исследования:
-
Оценить чувствительность к наноматериалам моделей in vitro на основе параметров функционального состояния тест объектов (двигательная активность сперматозоидов (т), интенсивность биолюминесценции фотобактерий, линейная скорость кровотока).
-
Изучить общетоксическое действие наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида в экспериментах in vivo и in vitro.
-
Изучить раздражающее действие наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида в экспериментах in vivo и in vitro.
-
Провести сравнительную оценку эффективности использования экспресс-методов при исследовании токсических свойств наноматериалов.
-
Оценить возможность использования альтернативных моделей спермы КРС и сосудов ХАО куриного эмбриона для установления характера и выраженности общетоксического и раздражающего действия наноматериалов.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Установлено совпадение результатов изучения общетоксического и раздражающего действия наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида, полученных в классических токсикологических экспериментах на животных и альтернативных моделях in vitro, что свидетельствует о возможности использования альтернативных методов при оценке токсичности наноразмерных частиц, в том числе на предварительном этапе токсиколого-гигиенических исследований при проведении санитарно-эпидемиологической экспертизы наносодержащей продукции.
-
Доказана высокая чувствительность альтернативных моделей и их способность в остром эксперименте улавливать токсический эффект доз, вызывающих подобный общетоксический эффект на животных лишь в условиях длительных экспериментов, что позволяет рекомендовать использование альтернативных моделей спермы КРС для скрининговой оценки общетоксического и сосудов ХАО куриного эмбриона для раздражающего действия наноматериалов.
-
Выявлено, что наиболее выраженное общетоксическое и раздражающее действие как на моделях in vivo, так и на моделях in vitro оказывают наноразмерные частицы серебра, в меньшей степени наноразмерные частицы цинка и титана диоксида. В тестах альтернативных моделей установлены параметры их цитотоксического действия.
Научная новизна и теоретическая значимость работы
Впервые проведена сравнительная оценка общетоксического и раздражающего действия наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида в опытах на животных и на альтернативных моделях in vitro.
Установлены параметры цитотоксического действия наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида на альтернативные модели: сперма КРС и фотобактерии «Эколюм».
Проведенные исследования в экспериментах на животных и альтернативных моделях: фотобактериях «Эколюм», сперме КРС и сосудах ХАО куриного эмбриона позволили выявить, что наиболее выраженное общетоксическое и раздражающее действие как в опытах in vivo, так и на моделях in vitro оказывают наноразмерные частицы серебра, в меньшей степени наноразмерные частицы цинка и титана диоксида.
Научно обосновано использование высокочувствительных альтернативных моделей для выявления различных видов токсического действия наноразмерных веществ и наноматериалов на организм.
Практическая значимость работы и внедрение результатов
! исследования в практику
Обоснована прогнозирующая способность альтернативных методов
при оценке токсичности наноразмерных веществ и их применение в качестве
скрининга на предварительном этапе токсиколого-гигиенических
! исследований при проведении санитарно-эпидемиологической экспертизы
наносодержащей продукции.
Материалы проведённых исследований использованы при разработке Руководства Р. 1.2.3156-13 «Оценка токсичности и опасности химических веществ и их смесей для здоровья человека» в рамках выполнения Ведомственной программы Федеральной службы по надзору в сфере защиты и благополучия человека по реализации принципов надлежащей лабораторной практики в области неклинических лабораторных исследований в деятельности испытательных центров.
Результаты диссертационной работы применяются в практической деятельности ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве» при проведении санитарно-эпидемиологической экспертизы наносодержащей продукции (парфюмерно-косметическая продукция) для оценки общетоксического и раздражающего действия на альтернативных биологических моделях in vitro.
Работа выполнена в рамках государственного задания по науке ГБОУ ДПО РМАПО на 2012-2014 гг. «Изучение токсичности НМ в эксперименте на лабораторных животных in vivo, in vitro и ex vivo». Полученные материалы используются в учебном процессе кафедры общей гигиены и медицины труда факультета профилактической медицины и организации здравоохранения ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
В соответствии с формулой специальности 14.02.01- «Гигиена», охватывающей проблемы изучения влияния факторов окружающей среды на здоровье человека, в диссертационном исследовании доказана высокая чувствительность альтернативных моделей спермы КРС и сосудов ХАО куриного эмбриона и возможность использования данных методов для
скрининговой оценки общетоксического и раздражающего действия при проведении экспертной оценки токсичности наносодержащей продукции, что соответствует области исследований п.№1 (общая гигиена).
Тема и предмет диссертации, материалы и методы исследования обсуждены на заседании Комитета по этике научных исследований ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России 24 июня 2014 года (протокол №6).
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на III и V конференциях молодых учёных ГБОУ ДПО РМАПО (Москва, 2012, 2014); IV Всероссийской Научно-практической конференции молодых учёных и специалистов «Окружающая среда и здоровье. Молодые учёные за устойчивое развитие страны в глобальном мире» (Москва, 2012); лабораторном совете ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве» (Москва, 2013); IV съезде токсикологов России с международным участием (Москва, 2013).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 3 публикации в периодических изданиях рекомендованных ВАК, 1 международная публикация на 9 Всемирном конгрессе по альтернативным методам (Prague, 2014) и соавторство в Руководстве Р. 1.2.3156-13 «Оценка токсичности и опасности химических веществ и их смесей для здоровья человека».
Личный вклад автора
Автором совместно с научным руководителем разработана основная идея работы, для выполнения поставленных задач и достижения цели выбраны современные методы исследования токсичности наноразмерных веществ, обоснованы полученные результаты и практические рекомендации, вытекающие из выводов. При планировании, организации, проведении исследований по всем разделам работы доля личного вклада автора составляет не менее 80%.
Объем и структура диссертации:
Законодательная и нормативно-методическая база по оценке и контролю за безопасностью нанотехнологий и наноматериалов в РФ и за рубежом
По происхождению различают наноструктуры природные и искусственные. К природным относятся вирусы малых размеров, молекулы ДНК. Искусственные наноструктуры создаются на основе современных технологических процессов: конденсации из газовой фазы, осаждения из коллоидного раствора и дезинтеграции твёрдого вещества.
Событием международного масштаба стала публикация Технического отчета ISO / TR 11360:2010 «Нанотехнологии - Методология классификации и категоризации наноматериалов». В отчете представлена система классификации, условно названная "нанодрево". Данная методология предлагает 4 вида классификации (по размеру, по структуре и типу, по химической природе и свойствам). НМ могут быть трёхмерными (фуллерены, нанокристаллы), двухмерными (нанотрубки), одномерными (наноплёнки). НМ могут разительно отличаться, как по технологии изготовления, так и по функциональным признакам.
НМ обладают комплексом физических, химических свойств и биологическим действием, которые часто радикально отличаются от свойств этого же вещества в форме сплошных фаз или макроскопических дисперсий.
Можно выделить следующие физико-химические особенности поведения НМ: - Увеличение химического потенциала, вследствие чего существенно изменяется растворимость, реакционная и каталитическая способность. - Большая удельная поверхность (в расчете на единицу массы), увеличивающая их адсорбционную емкость, химическую реакционную способность и каталитические свойства, которые могут служить пусковым механизмом пока еще неизвестных химических реакций или, соединяясь с токсинами позволять им входить в клетки, к которым они иначе не имели бы никакого доступа. - Возможность связываться с нуклеиновыми кислотами, белками, встраиваться в мембраны, проникать в клеточные органеллы и, тем самым, изменять функции биоструктур. - Высокая адсорбционная активность, способность поглощать на единицу своей массы во много раз больше адсорбируемых веществ, чем макроскопические дисперсии. Например, адсорбция различных контаминантов на наночастицах (далее НЧ) облегчает их транспорт внутрь клетки, что может увеличить их токсичность. - Высокая способность к аккумуляции. Возможно, из-за малого размера НЧ могут не распознаваться защитными системами организма, не подвергаться биотрансформации и накапливаться в организме. Это может привести к накоплению НЧ в растительных, животных организмах, с последующей передачей по пищевой цепи к человеку.
В литературе имеются многочисленные публикации о накоплении и стабильности НЧ в водной среде, а также о способности на протяжении длительного времени сохранять свои токсические свойства [58,100,141,157].
Имеющиеся научные данные позволяют утверждать, что токсичность наночастиц определяется не только размером, но и их формой. Наночастицы дендрической и веретенообразной формы обладают более высокой цитотоксичностью, нежели частицы сферической формы [52].
Совокупность выше изложенных факторов свидетельствует о том, что НМ могут обладать совершенно иными, в том числе и более токсическими свойствами, чем их аналоги в макроформе.
В частности, было выявлено, что НЧ серебра обладают способностью осаждаться в печени, проникать в результате аксонального транспорта в обонятельную луковицу головного мозга [130], нарушать функции митохондрий, оказывать токсичное действие на клетки печени, увеличивать проницаемость клеточной мембраны и накопление продуктов перекисного окисления [84]. Исследования Baan [61] и его группы из Международного агентства по исследованию рака (IARC) показали, что НЧ титана диоксида, в отличие от его макроформы, могут обладать канцерогенным действием для человека. В экспериментах in vivo наблюдали увеличение массы печени и некроз гепатоцитов при воздействии НЧ титана диоксида размером 80 нм, а также длительный период их полувыведения, поскольку он практически не выводится почками. В работах Saquib Q., Al-Khedhair A. [134] было показано, что НЧ титана диоксида ухудшают способность клетки к репарации ДНК путем дезактивации нуклеотидов, оказывают цитотоксические и генотоксические эффекты на человеческие эпителиальные клетки, что не характерно для макроформ данного вещества.
При изучении токсического действия нано, микрочастиц цинка оксида и сульфата цинка на представителя планктонных ракообразных Ceriodaphnia affinis Lillijeborg по показателям LC50 при 48- часовой и 7- суточной экспозиции была отмечена более высокая токсичность микро- и наночастиц оксида цинка (15 НМ), по сравнению с растворами сульфата цинка [12]. В то время как оксид цинка в макроформе, в виду малой растворимости, менее опасен, чем макроразмерный сульфат цинка.
Выраженное цитостатическое действие и повреждение ДНК было выявлено при воздействии НЧ цинка в концентрациях 1-100 мкг/мл на фибробласты, альвеолярные клетки A549, клетки гепатокарциномы HepG2 и кератиноциты человека, а также на нервные клетки крысы [68].
Таким образом, учитывая физико-химические особенности поведения НМ, они относятся к новым видам материалов и продукции, характеристика потенциального риска которых для здоровья человека и состояния среды обитания в соответствии с законодательством Российской Федерации и международными стратегическими подходами к безопасному регулированию химических веществ (СПМРХВ, ВОЗ, МОТ, ОЭСР) является обязательной.
Исследование общетоксического действия in vitro на модели спермы крупного рогатого скота
По итогам исследований, проведенных в 2013 году международным научным центром имени Вудро Вильсона 1628 зарегистрированных товаров личного и бытового назначения содержат наночастицы серебра, титана диоксида, цинка, фуллерены [112].
Как показывают аналитические исследования, в настоящее время лидерство по применению в потребительской продукции принадлежит наноразмерным частицам серебра. Коллоидное серебро (КС) активно используется как дезинфицирующее, антимикробное, антисептическое средство в косметической и пищевой продукции, в производстве упаковки для пищевых продуктов и системах водоочистки. Применение его в системах очистки воды из источников централизованного и нецентрализованного водоснабжения для обеззараживания от микробиологических загрязнений (в т.ч. вирусов и бактерий), гуминовых кислот, коллоидных частиц, широкого спектра органических и неорганических растворенных загрязнений, в т.ч. хлора и хлорорганических загрязнений, пестицидов, устраняет неприятный запах воды и улучшает ее вкусовые качества.
В качестве дезинфицирующего, антимикробного и антисептического средства наноразмерные частицы серебра также применяются и в медицинских перевязочных материалах, изделиях для ухода за больными, отдельных предметах одежды, различных видах бытовой посуды и инструментах, моющих средствах и т.д. Кроме того, коллоидное (наноразмерное) серебро используется в составе продукции пищевого назначения (БАД).
Благодаря уникальным физико-химическим характеристикам и пролонгированному антибактериальному эффекту наноформы титана диоксида являются также одним из самых востребованных наноматериалов[112]. Наноразмерные частицы титана (TiO2) широко применяются при производстве косметики и зубной пасты, лекарственных средств, упаковки для продуктов питания, красок, шпатлевок, пластмассы, бумаги и в медицине в качестве компонента для формирования протезных имплантатов и суставов.
Необходимо отметить, что достаточно часто используемым в потребительской продукции наноматериалом являются также наноразмерные частицы цинка. Наноразмерные частицы цинка используют в пищевой, фармацевтической, парфюмерно-косметической и лакокрасочной промышленности, изделиях медицинского назначения (в составе дезинфицирующих средств). Широкое применение наночастицы цинка имеют в строительной индустрии при оцинковке поверхностей конструкционных материалов и покрытий с целью придания им антикоррозионных свойств.
В парфюмерно-косметической продукции чаще всего используют НЧ титана диоксида (TiO2) и цинка в солнцезащитных кремах, благодаря их непроницаемости для ультрафиолетовых лучей и высокой антибактериальной активности. Наноразмерные частицы титана, цинка активно используют в автокосметике. При нанесении гидрофобных наноструктурных влаго- и грязеотталкивающих защитных плёнок на лаковые, текстильные, металлические поверхности в автомобилях они оказывают защитный эффект для этих поверхностей. Одной из ведущих областей использования уникальных свойств НМ является производство упаковочных материалов для пищевых продуктов [66,79,90,113,122]. Введение в состав упаковки наноразмерных частиц титана, серебра и цинка позволяет придать ей новые полезные характеристики, включая газобарьерные свойства, непроницаемость для ультрафиолетовых лучей, антибактериальную активность. В роли основного наноразмерного компонента фотобарьерных упаковочных материалов используются наноразмерные частицы титана диоксида в кристаллической модификации анатаза, имеющие сферическую форму и средний диаметр порядка 20 - 25 нм. В качестве антимикробных упаковочных материалов используются НЧ металлического серебра, имеющие сферическую форму и средний размер от 5 до 20 нм. Имеются также разработки по использованию в антимикробной упаковке НЧ цинка оксида (ZnO).
Анализ использования наноматериалов в продукции представляет большой интерес, поскольку позволяет наметить перспективы приоритетных токсиколого-гигиенических исследований и оценки риска их воздействия на организм человека, целью которых является гигиеническое нормирование наноматериалов в продукции и объектах окружающей среды.
Широкое применение наноразмерных частиц серебра, титана и цинка в производстве различных видов продукции для всех категорий населения страны указывает на чрезвычайную актуальность их токсиколого-гигиенической оценки.
Оценка общетоксического действия в опытах in vitro
Экспериментальное изучение поведенческих реакций проводили комплексно с интегральной оценкой поведенческих параметров, основанной на применении методов «открытого поля» и «норкового рефлекса». Оценка двигательной активности проводилась по количеству пересечённых при движении секторов и числу вертикальных стоек животного; ориентировочно-исследовательская деятельность по количеству заглядываний в норки-отверстия и заходы в домик; эмоциональная реактивность по числу фекальных шариков за время опыта. При нейротоксическом действии наиболее чувствительным является «вертикальный» компонент двигательной активности и параметры исследовательского поведения, горизонтальная активность отличается стабильностью. Поэтому рекомендуется наряду с интегральной оценкой активности животных учитывать соотношение активности, которое позволяет установить определение закономерности и выраженность токсического действия химических соединений [25]. Статистическая обработка данных проводилась с помощью программ Excel, Probit Analys, Statistica. Достоверность различий определялась по непараметрическому критерию Манна-Уитни, t – тесту Стьюдента [1,45,49,53]. Различия между группами признавались достоверными при уровне значимости P 0,05.
Исследование общетоксического действия in vitro на альтернативной модели сперма крупного рогатого скота В целях определения возможности использования экспресс- методов in vitro для изучения общетоксического действия наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида была выбрана модель сперма крупного рогатого скота (ГОСТ 26030-83). Сперматозоиды - единственные клетки млекопитающих, эволюционно приспособленные к временному существованию вне организма. Тест - функцией данного клеточного объекта является подвижность половых клеток.
Сперматозоиды обладают высокой чувствительностью к воздействию испытуемых химических веществ и смесей сложного состава, а подвижность характеризует фундаментальные процессы их жизнедеятельности.
Данный тест-объект имеет ряд преимуществ перед другими альтернативными моделями: стандартизованное производство спермы, достаточная чувствительность для оценки общей токсичности, удобство транспортировки и хранения (жидкий азот), неограниченный срок хранения, отсутствие стерильности при хранении и проведении анализа, низкая стоимость испытания, высокая технологичность анализа (процесс автоматизирован) и возможность получить результат в течение одного дня. Экспериментально установлено, что между результатами оценки общей токсичности на целостном организме млекопитающих и цитотоксичностью для спермы быка имеет место высокая степень корреляции (r=0,83) [13]. Высокая прогностическая способность суспензии сперматозоидов быка была также выявлена в рамках международного исследовательского проекта по тестированию методов in vitro MEIC (Multicentre Evaluation of In Vitro Cytotoxicity). Анализ полученных данных позволил сделать вывод о том, что сперматозоиды быка могут использоваться для прогноза общетоксического действия на организм человека.
Ход исследования интегральной токсичности с использованием спермы КРС проводили в соответствии с методическими указаниями по биотестированию продукции из полимерных и других материалов – МУ 1.1.037-95 на приборе «Анализатор изображений АТ-05», принцип действия которого основан на получении изображения сперматозоидов быка в проходящем свете на матрице цифровой видеокамеры. Полученный цифровой сигнал передаётся в электронный блок, где формируется дискретное изображение и осуществляется дальнейший анализ (измерение линейных размеров) с целью реализации методик оценки токсичности.
Экстракты из испытуемых образцов наноразмерных частиц готовили путём экспозиции в течение 24 часов в дистиллированной воде. После завершения экстракции экстракты подвергали фильтрации через бумажный фильтр с целью удаления взвешенных частиц.
В исследовании использовали растворы наноразмерных частиц серебра в концентрациях: 110-5 г/л, 110-4 г/л, 110-3 г/л, 110-2 г/л, 110-1 г/л, 1 г/л, 2 г/л, 5 г/л; наноразмерных частиц цинка – 10 г/л, 20 г/л, 30 г/л, 40 г/л, 50 г/л и наноразмерных частиц титана диоксида- 250 г/л, 300 г/л и 400 г/л.
В качестве контрольного раствора использовали глюкозо-цитратную среду (глюкоза-4 г, цитрат натрия- 1 г, вода дистиллированная -100 мл). Такая среда одновременно является разбавителем для оттаивания спермы. Введение глюкозы в разбавитель необходимо для поддержания содержания АТФ в подвижных сперматозоидах с целью обеспечения гликолиза и дыхания клетки.
В каждую пробирку с модельной средой и опытным экстрактом приливали 0,1 мл спермы. Полученную смесь экстрактов и спермы из каждой пробирки переносили в капилляры (по 5 на один образец) и устанавливали в каретку прибора. Проводили измерения согласно инструкции к прибору. Схема проведения эксперимента представлена в приложении 1. Обработка экспериментальных данных осуществлялась автоматически. Результаты оценивали по изменению суммарной двигательной активности сперматозоидов (S) контрольной и опытной проб s= mi где nii- значение показателя подвижности и вычислению индекса токсичности (It), представляющего собой отношение усредненной суммарной двигательной активности сперматозоидов опытной и контрольной проб, выраженное в процентах
Оценка раздражающего действия в опытах in vivo
В целях оценки возможности использования альтернативного метода для установления характера и выраженности раздражающего действия наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида на слизистые оболочки в экспериментах in vitro использовали метод высокочастотной допплерографии на сосудах ХАО 10- дневных куриных эмбрионов кур породы белый леггорн.
ХАО куриного эмбриона - эмбриональный орган дыхания и орган для осуществления обмена веществ у зародыша. Представляет собой тонкую прозрачную оболочку, пронизанную большим количеством кровеносных сосудов и капилляров.
Выбор этого метода был обусловлен его высокой чувствительностью, простотой выполнения, объективной цифровой оценкой результатов, повышающей его достоверность, воспроизводимостью, а также экономичностью и быстротой получения результатов. Этот метод является альтернативой одного из самых болезненных тестов на лабораторных животных – окулярному тесту Драйза [Draize et al., 1944], т.е. аналогичный глазу человека.
Основой данного метода исследования является ХЕТ-КАМ тест, применяемый для визуальной оценки раздражающего действия веществ на сосудах ХАО куриного эмбриона, дополненный методом высокочастотной допплерографии, позволяющей определять количественные характеристики изменения скорости кровотока.
Принцип метода заключается в том, что при возникновении раздражающего действия происходит сужение кровеносных сосудов без остановки или с временной остановкой тока крови, тромбоз, кровоизлияния и т.п., что вызывает изменение скорости кровотока и фиксируется с помощью ультразвукового датчика. Исследование проводили в соответствии с МР 1.2.0025-11 на приборе «Минимакс-Допплер-К», оснащенным датчиком с частотой 25 МГц. С помощью программы Minimax Dopler v.1.7. автоматически вычислялись количественные параметры скорости кровотока: линейная скорость кровотока Vs (см/сек), объёмная скорость кровотока Qs (мл/сек), средневзвешенная скорость кровотока по кривой средней скорости Vam (см/сек). По изменению линейной скорости кровотока (X) контрольной и опытной проб оценивали местно раздражающее действие.
В работе использовали 10 дневные куриные эмбрионы домашних кур породы белый леггорн. До начала эксперимента яйца выдерживали тупым концом вверх, при температуре 38,0 ±0,50С. Для поддержания влажности в термостат помещали ёмкость с водой, объемом 500 см3.
Экстракты из испытуемых образцов готовили путём настаивания в физиологическом растворе (0,9% NaCl). Продолжительность экстракции составляла 1 час в термостате, при температуре 37 С. Соотношение веса образца и объёма модельной среды соответствовало условиям приготовления экстрактов. В исследовании использовали растворы наноразмерных частиц серебра в концентрации 50 г/л; наноразмерных частиц цинка в нативном виде и наноразмерных частиц титана в концентрации 250 г/л.
Перед началом эксперимента вскрывали воздушную камеру, поверхность подскорлуповой оболочки смачивали физиологическим раствором, на ХАО наслаивали 400 мм3 физиологического раствора (для предотвращения высыхания) и помещали яйцо в термостат на 20 минут для снятия травматического шока. Если происходило повреждение ХАО или возникало кровотечение, такое яйцо отбраковывалось. Выбрав кровеносный сосуд на поверхности ХАО, датчик располагали под углом 60о к исследуемому сосуду, добиваясь при этом слабых по амплитуде пульсаций без острых пиков (медленно меняющаяся волна) допплерограмм, отображающихся на мониторе прибора. После измерения скорости кровотока в выбранном сосуде на 0 минуте проводилось наслаивание экстракта из исследуемого образца в количестве 400 мм3. Нулевая минута соответствовала интактному состоянию сосудов ХАО эмбриона. Через 80 секунд оценивали изменение скорости кровотока сосудов ХАО под влиянием исследуемого образца. За результат анализа принимали среднее арифметическое 10 параллельных измерений. В качестве негативного контроля использовали физиологический раствор, в эквивалентных объемах, в качестве позитивного - раствор КОН (2,5 %).
Оценка результатов испытаний проводилась по раздражающему действию на слизистую оболочку глаза, которая соответствует изменению скорости кровотока (X), выраженному в процентном соотношении относительно нулевой точки измерения и высчитывается по формуле: ХJVsXzVsX.m где (Vs)n - линейная скорость кровотока в динамике измерений; (Vs)о - линейная скорость кровотока на нулевой минуте. При интерпретации результатов вещество, вызывающее раздражающее действие (изменение скорости кровотока) относительно контрольной группы менее, чем на 15% относится к соединениям с невыраженным раздражающим действием и исключается из дальнейших исследований по данному эффекту на лабораторных животных.
Статистическую обработку данных проводили с помощью программ Excel, Probit Analys, Statistica. Достоверность различий определяли по непараметрическому критерию Манна-Уитни, t – тесту Стьюдента. Различия между группами признавали достоверными при уровне значимости P 0,05.
![Гигиеническое обоснование и оценка эффективности применения УФ-излучения в комплексной технологии обеззараживания питьевой воды [Электронный ресурс]](/i/i/4428/178934.png "Гигиеническое обоснование и оценка эффективности применения УФ-излучения в комплексной технологии обеззараживания питьевой воды [Электронный ресурс] Фридман Роман Кириллович")
![Гигиеническая оценка эффективности профилактики йодного дефицита йодированной солью на примере Оренбургской обл. [Электронный ресурс]](/i/i/4380/212998.png "Гигиеническая оценка эффективности профилактики йодного дефицита йодированной солью на примере Оренбургской обл. [Электронный ресурс] Бурлуцкая Ольга Ивановна")