Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. современное состояние проблемы
1.1. Общие сведения о наночастицах и наноматериалах 14
1.2. Применение наноматериалов в товарах народного потребления 19
1.3. Законодательная и нормативно-методическая база по оценке и контролю за безопасностью нанотехнологий и наноматериалов в РФ и за рубежом 23
1.4. Современные методы оценки и безопасности наноматериалов 28
1.5. Обзор современных токсикологических данных по токсичности наночастиц серебра, титана, цинка 35
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Характеристика исследуемых образцов наноразмерных частиц серебра, титана, цинка 44
2.2. Исследование общетоксического действия in vivo на лабораторных животных 46
2.3. Исследование общетоксического действия in vitro на модели спермы крупного рогатого скота 50
2.4. Исследование общетоксического действия in vitro на модели люминесцентных бактерий «Эколюм» 53
2.5. Исследование раздражающего действия in vivo на кожу и слизистые оболочки лабораторных животных 56
2.6. Исследование раздражающего действия in vitro методом ультразвуковой допплерографии на хориоаллантоисную
оболочку куриного эмбриона 61
Глава 3. Сравнительная оценка общетоксического и раздражающего действия НЧ серебра IN vivo и in vitro
3.1. Оценка общетоксического действия в опытах in vivo 65
3.2. Оценка общетоксического действия в опытах in vitro 67
3.3. Оценка раздражающего действия в опытах in vivo 73
3.4. Оценка раздражающего действия в опытах in vitro 74
3.5. Результаты сравнительной оценки общетоксического
и раздражающего действия in vivo и in vitro 75
Глава 4. Сравнительная оценка общетоксического и раздражающего действия нч цинка in vivo и in vitro
4.1. Оценка общетоксического действия в опытах in vivo 81
4.2. Оценка общетоксического действия в опытах in vitro 83
4.3. Оценка раздражающего действия в опытах in vivo 88
4.4. Оценка раздражающего действия в опытах in vitro 89
4.5. Результаты сравнительной оценки общетоксического
и раздражающего действия in vivo и in vitro 90
Глава 5. Сравнительная оценка общетоксического и раздражающего действия нч титана диоксида in vivo и in vitro
5.1. Оценка общетоксического действия в опытах in vivo 95
5.2. Оценка общетоксического действия в опытах in vitro 97
5.3. Оценка раздражающего действия in в опытах vivo 101
5.4. Оценка раздражающего действия in в опытах vitro 102
5.5. Результаты сравнительной оценки общетоксического
и раздражающего действия in vivo и in vitro 103
Заключение 109
Выводы 125
Литература 1
- Законодательная и нормативно-методическая база по оценке и контролю за безопасностью нанотехнологий и наноматериалов в РФ и за рубежом
- Исследование общетоксического действия in vitro на модели люминесцентных бактерий «Эколюм»
- Оценка раздражающего действия в опытах in vivo
- Оценка раздражающего действия в опытах in vivo
Законодательная и нормативно-методическая база по оценке и контролю за безопасностью нанотехнологий и наноматериалов в РФ и за рубежом
По происхождению различают наноструктуры природные и искусственные. К природным относятся вирусы малых размеров, молекулы ДНК. Искусственные наноструктуры создаются на основе современных технологических процессов: конденсации из газовой фазы, осаждения из коллоидного раствора и дезинтеграции твёрдого вещества.
Событием международного масштаба стала публикация Технического отчета ISO / TR 11360:2010 «Нанотехнологии - Методология классификации и категоризации наноматериалов». В отчете представлена система классификации, условно названная "нанодрево". Данная методология предлагает 4 вида классификации (по размеру, по структуре и типу, по химической природе и свойствам). НМ могут быть трёхмерными (фуллерены, нанокристаллы), двухмерными (нанотрубки), одномерными (наноплёнки). НМ могут разительно отличаться, как по технологии изготовления, так и по функциональным признакам.
НМ обладают комплексом физических, химических свойств и биологическим действием, которые часто радикально отличаются от свойств этого же вещества в форме сплошных фаз или макроскопических дисперсий.
Можно выделить следующие физико-химические особенности поведения НМ: - Увеличение химического потенциала, вследствие чего существенно изменяется растворимость, реакционная и каталитическая способность. - Большая удельная поверхность (в расчете на единицу массы), увеличивающая их адсорбционную емкость, химическую реакционную способность и каталитические свойства, которые могут служить пусковым механизмом пока еще неизвестных химических реакций или, соединяясь с токсинами позволять им входить в клетки, к которым они иначе не имели бы никакого доступа. - Возможность связываться с нуклеиновыми кислотами, белками, встраиваться в мембраны, проникать в клеточные органеллы и, тем самым, изменять функции биоструктур. - Высокая адсорбционная активность, способность поглощать на единицу своей массы во много раз больше адсорбируемых веществ, чем макроскопические дисперсии. Например, адсорбция различных контаминантов на наночастицах (далее НЧ) облегчает их транспорт внутрь клетки, что может увеличить их токсичность. - Высокая способность к аккумуляции. Возможно, из-за малого размера НЧ могут не распознаваться защитными системами организма, не подвергаться биотрансформации и накапливаться в организме. Это может привести к накоплению НЧ в растительных, животных организмах, с последующей передачей по пищевой цепи к человеку. В литературе имеются многочисленные публикации о накоплении и стабильности НЧ в водной среде, а также о способности на протяжении длительного времени сохранять свои токсические свойства [58,100,141,157].
Имеющиеся научные данные позволяют утверждать, что токсичность наночастиц определяется не только размером, но и их формой. Наночастицы дендрической и веретенообразной формы обладают более высокой цитотоксичностью, нежели частицы сферической формы [52].
Совокупность выше изложенных факторов свидетельствует о том, что НМ могут обладать совершенно иными, в том числе и более токсическими свойствами, чем их аналоги в макроформе.
В частности, было выявлено, что НЧ серебра обладают способностью осаждаться в печени, проникать в результате аксонального транспорта в обонятельную луковицу головного мозга [130], нарушать функции митохондрий, оказывать токсичное действие на клетки печени, увеличивать проницаемость клеточной мембраны и накопление продуктов перекисного окисления [84]. Исследования Baan [61] и его группы из Международного агентства по исследованию рака (IARC) показали, что НЧ титана диоксида, в отличие от его макроформы, могут обладать канцерогенным действием для человека. В экспериментах in vivo наблюдали увеличение массы печени и некроз гепатоцитов при воздействии НЧ титана диоксида размером 80 нм, а также длительный период их полувыведения, поскольку он практически не выводится почками. В работах Saquib Q., Al-Khedhair A. [134] было показано, что НЧ титана диоксида ухудшают способность клетки к репарации ДНК путем дезактивации нуклеотидов, оказывают цитотоксические и генотоксические эффекты на человеческие эпителиальные клетки, что не характерно для макроформ данного вещества.
При изучении токсического действия нано, микрочастиц цинка оксида и сульфата цинка на представителя планктонных ракообразных Ceriodaphnia affinis Lillijeborg по показателям LC50 при 48- часовой и 7- суточной экспозиции была отмечена более высокая токсичность микро- и наночастиц оксида цинка (15 НМ), по сравнению с растворами сульфата цинка [12]. В то время как оксид цинка в макроформе, в виду малой растворимости, менее опасен, чем макроразмерный сульфат цинка.
Выраженное цитостатическое действие и повреждение ДНК было выявлено при воздействии НЧ цинка в концентрациях 1-100 мкг/мл на фибробласты, альвеолярные клетки A549, клетки гепатокарциномы HepG2 и кератиноциты человека, а также на нервные клетки крысы [68].
Исследование общетоксического действия in vitro на модели люминесцентных бактерий «Эколюм»
Так как наиболее чувствительным при кожном нанесении в видовом отношении животным является морская свинка при исследовании раздражающего действия вещества на кожу использовали молодых морских свинок светлой масти обоих полов (масса тела 250—300 г) с чистой здоровой кожей без механических повреждений (80 животных). Все животные содержались при 12-ти часовом цикле освещения, температурном режиме 20-26 C, влажности воздуха 50-65 %, 8-10-ти кратной смене объема воздуха комнаты в час, получали полусинтетический рацион в соответствии с суточными нормами кормления (Приказ министра здравоохранения от 10 марта 1966 г. № 163). Животных акклиматизировали в условиях лаборатории в течение 7 дней до начала эксперимента.
Для исследования кожно-раздражающего действия за 1-2 дня до эксперимента тщательно выстригали шерсть на участке аппликации по обе стороны от позвоночника. Правый бок служил для аппликации изучаемого вещества, левый для контроля (Рис. 7).
Образцы исследовали, нанося открытым способом непосредственно на кожные покровы при температуре окружающей среды 23С. Продолжительность контакта 2 часа. После окончания экспозиции остатки продукта удаляли теплой водой с мылом. Время наблюдения – 14 дней.
В исследовании использовали растворы наноразмерных частиц серебра в концентрациях: нативный раствор, 50 г/л, 10 г/л, 2 г/л; наноразмерных частиц цинка в концентрациях: нативный раствор, 50 г/л, 10 г/л и наноразмерных частиц титана в концентрациях 500 г/л и 250 г/л.
Оценивали реакцию кожи каждый раз после удаления исследуемого материала и через 14 дней после первого воздействия по таким показателям функционального состояния кожи экспериментальных животных, как интенсивность эритемы и выраженность отёка (табл.6). Сравнивали состояние кожи животных опытной и контрольной групп. Баллы каждого наблюдения делили на общее число наблюдений, чтобы получить среднее значение в опытной и контрольной группах. Таблица 6 Оценка функционального состояния кожи экспериментальных животных а) Оценка степени эритемы по С.В. Суворову и В.В. Чернышевой
Очень резко положительный ++++ В месте аппликации эритема, отёк, папулы, сливающиеся везикулы Исследование раздражающего действия на слизистую оболочку глаза проводили на кроликах-альбиносах одной линии обоего пола (40 животных). Не позднее, чем за 24 ч до начала исследования визуально оценивали состояния глаз каждого кролика, в опыт брали животных без патологических изменений. Изучаемый продукт закапывали в коньюктивальный мешок глаза в количестве 1 капли. В исследовании использовали растворы наноразмерных частиц серебра в концентрациях: 50 г/л, 10 г/л, 2 г/л; наноразмерных частиц цинка в концентрациях: 50 г/л, 10 г/л и наноразмерных частиц титана в концентрациях 500 г/л и 250 г/л.
Для постановки пробы одну каплю водного раствора испытуемого вещества вводили глазной пипеткой с вытянутым тонким концом под верхнее веко кролика, во второй глаз (контрольный) вводили 1 каплю воды. После внесения вещества прижимали на 1 минуту слезноносовой канал у внутреннего угла глаза. В условиях данного эксперимента применяли острое (однократное введение) растворов наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида.
Реакции коньюктивальной пробы учитывали через 15 мин (быстрая реакция) и через 24-48 часов (гиперчувствительность замедленного типа), ежедневно в течение 14 дней проводили наблюдение за состоянием коньюктивы и роговицы.
Регистрировали появление и выраженность гиперемии и отека слизистой оболочки глаз, инъекцию сосудов склеры и роговицы. Оценку повреждающего действия на слизистую оболочку глаза кролика проводили по степени гиперемии и отёка, количеству выделений, выраженной в бальной системе A. Majda и K. Chuscielska (таблица 8).
Сравнивали состояние слизистой оболочки глаза подопытных животных и животных контрольной группы. Баллы каждого наблюдения делили на общее число наблюдений, чтобы получить среднее значение в опытной и контрольной группах.
Оценка раздражающего действия в опытах in vivo
Для изучения раздражающего действия наноразмерных частиц цинка на кожу и слизистые оболочки в экспериментах in vivo проводились токсикологические исследования на кожных покровах морских свинок и слизистой оболочке глаз кроликов. При исследовании раздражающего действия наноразмерных частиц цинка на выстриженный участок кожи боковой поверхности туловища морских свинок наносили раствор наноразмерных частиц цинка в концентрациях: нативный раствор, 50 г/л, 10 г/л, 2 г/л.
При ежедневном наблюдении в течение 14 дней у подопытных животных не были выявлены признаки раздражающего действия вещества на кожу. Общая суммарная оценка раздражающего действия на кожные покровы составила 0 баллов.
Для изучения раздражающего действия на слизистую оболочку глаз кроликам в коньюктивальный мешок глаза закапывали нативный раствор наноразмерных частиц цинка.
Результаты исследований однократного раздражающего действия наноразмерных частиц цинка не выявили повреждающего действия на слизистые оболочки. Такие признаки раздражения как гиперемия коньюктивы и роговицы, отёк век и выделения не отмечались ни через 15 минут после воздействия (быстрая реакция), ни через 24-48 часов (гиперчувствительность замедленного типа), ни по окончании периода наблюдения (14 дней).
Таким образом, в результате проведенных исследований в экспериментах in vivo было установлено, что наноразмерные частицы цинка не оказывают раздражающего действия на кожные покровы и слизистые оболочки
В целях оценки возможности использования альтернативного метода для установления характера и степени выраженности раздражающего действия наноразмерных частиц цинка на слизистые оболочки в экспериментах in vitro проводились исследования на сосудах ХАО 10 -дневных куриных эмбрионов кур породы белый леггорн.
При изучении раздражающего действия в опытах in vitro на сосуды ХАО куриного эмбриона наносили нативный раствор наноразмерных частиц цинка. Результаты исследований раздражающего действия на слизистые наноразмерных частиц цинка на сосудах ХАО куриного эмбриона представлены в таблице 20. (Vs)n - линейная скорость кровотока в динамике измерений (Vs)0 - линейная скорость кровотока на нулевой минуте Х(%) -изменение линейной скорости кровотока - среднее квадратическое отклонение Данные эксперимента показали, что наноразмерные частицы цинка не оказывают раздражающего действия на слизистые оболочки, показатель изменения линейной скорости кровотока (Х) составил 3,4±2,1%, при допустимом нормативном интервале 15%. Статистически достоверно значимых различий межу контрольной и опытной группой по показателю изменения линейной скорости кровотока не отмечалось (P 0,05).
При изучении общетоксического действия в экспериментах in vivo было установлено, что при остром воздействии доза 5000 мг/кг (150 мг/ на одно животное) не оказывает общетоксического эффекта и не вызывает признаков интоксикации и патоморфологических нарушений. По показателям среднесмертельной дозы при однократном внутрижелудочном пути поступления наноразмерные частицы цинка относятся к малоопасным веществам (4 класс опасности, DL 5000 мг/кг).
Вместе с тем, в литературе имеются сведения о проявлении общетоксического действия наноразмерных частиц цинка при введении более низких доз в исследованиях субхронической токсичности.
По данным Shrivastava R., Raza S., Yadav A. et al. [144] при введении мышам дозы 500 мг/кг (15 мг/ на одно животное) отмечались признаки окислительного стресса в виде повышения уровня активных форм кислорода (АФК) и антиоксидантых ферментов, дофамина и норадреналина в мозговой коре головного мозга. Анализ результатов трансмиссионной электронной микроскопии (ПЭМ) выявил присутствие наночастиц цинка в цитоплазме и ядре клеток печени и мозга.
В работах Jo E., Seo G., Kwon J.T. et al. [88] при изучении субхронической токсичности при введении крысам за 2 недели до спаривания дозы 500 мг/кг (15 мг/ на одно животное) отмечалось снижение количества и массы тела их потомства. Наночастицы цинка были обнаружены в молочной железе, матке, печени взрослой особи и в почках детенышей. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что наночастицы цинка могут представлять риск для здоровья беременных женщин и их плода.
В литературе имеются сведения о возможности наноразмерных частиц цинка оказывать общетоксическое действие на организм при еще более низких дозах, но уже в условиях хронических экспериментов. По данным исследований Yang Y.l., Jing X.P., Zhang S.P. et al. [172] при введении мышам в течение 90 дней дозы 15-60 мг/кг (0,45-1,8 мг/ на одно животное) наблюдались признаки токсического действия на центральную нервную систему в виде ухудшения памяти и способности к обучению. Это было обусловлено снижением в гипокампе уровня нейтрофического фактора (brain derived neurotrophic factor -BDNF), который поддерживает выживание существующих нейронов и влияет на рост и дифференцировку новых нейронов, а также снижением уровня целого ряда синаптических белков (NMDA-NR2A, NR2B, AMPA-GluR1, PSD-93, PSD-95), участвующих в передаче нервных импульсов.
Оценка раздражающего действия в опытах in vivo
Как показывает сравнительный анализ (табл. 31), признаки общетоксического действия наноразмерных частиц серебра в опытах in vivo отмечались в дозах 30-150 мг/животное при изучении острой токсичности, в дозах 0,9-2,7 мг/животное в опытах по субхронической токсичности и в дозах 0,005 мг/мл при проведении длительных экспериментов на животных.
Общетоксическое действие наноразмерных частиц серебра в опытах in vitro было выявлено в концентрациях 0,001- 0,005 мг/мл на одну пробу культуры (табл. 30), что показывает очень высокую чувствительность используемых моделей. Аналогичные величины эффективных токсических концентраций (0,002-0,005 мг/мл) были получены Gliga R., Skoglund S. в экспериментальных исследованиях по изучению токсичности наноразмерных частиц серебра в опытах in vitro и на клетках человеческого лёгкого [77].
Следующим этапом научной работы было изучение общетоксического действия наноразмерных частиц цинка на экспериментальных животных in vivo и альтернативных моделях in vitro. При изучении общетоксического действия наноразмерных частиц цинка в экспериментах in vivo было установлено, что при остром воздействии доза 5000 мг/кг (150 мг/ на одно животное) не оказывает общетоксического эффекта и не вызывает признаков интоксикации и патоморфологических нарушений. Вместе с тем, в литературе имеются сведения о проявлении общетоксического действия наноразмерных частиц цинка в экспериментах in vivo при введении более низких доз, но в исследованиях по изучению субхронической токсичности.
В исследованиях Shrivastava R., Raza S., Yadav A. et al. [144] при введении мышам дозы 500 мг/кг (15 мг/ на одно животное) отмечались признаки окислительного стресса в виде повышения уровня активных форм кислорода (АФК) и антиоксидантых ферментов, дофамина и норадреналина в мозговой коре головного мозга. Анализ результатов трансмиссионной электронной микроскопии (ПЭМ) выявил присутствие наночастиц цинка в цитоплазме и ядре клеток печени и мозга.
В работах других авторов Jo E., Seo G., Kwon J.T. et al. по изучению субхронической токсичности, при введении крысам за 2 недели до спаривания дозы 500 мг/кг (15 мг/ на одно животное) отмечалось снижение количества и массы тела их потомства. Наночастицы цинка были обнаружены в молочной железе, матке, печени взрослой особи и в почках детенышей. Результаты проведенных исследований показали, что наночастицы цинка могут представлять риск для здоровья беременных женщин и их плода [88].
В результате экспериментальных исследований по изучению общетоксического действия в опытах in vitro было установлено, что наноразмерные частицы цинка оказывают дозозависимое действие на альтернативные модели сперма КРС и фотобактерии «Эколюм». Подвижность сперматозоидов снижали концентрации 20 г/л, 30 г/л, 40 г/л, 50 г/л и тушение свечения биосенсора по сравнению с контролем вызывали концентрации 210-3 г/л, 310-3 г/л, 410-3мг/л, 510-3 мг/л. В соответствии с классификацией токсичности наноразмерные частицы цинка относятся к высокотоксичным соединениям для данной альтернативной модели.
Проведенный сравнительный анализ общетоксического действия наноразмерных частиц цинка в опытах in vivo показал, что изучаемое вещество в дозе 150 мг/животное не обладает острой токсичностью, тем не менее, в условиях субхронического эксперимента признаки интоксикации отмечались в дозе 15 мг/животное (табл. 31).
Сравнительный анализ изучения общетоксического действия в опытах in vitro показал, что эффективная токсическая концентрация наноразмерных частиц цинка для альтернативной модели фотобактерий «Эколюм» составила 0,005 мг/мл на одну пробу культуры, а для модели спермы КРС - 20 мг/мл на одну пробу сперматозоидов (табл. 30). Полученные результаты указывают на более высокую чувствительность альтернативной модели фотобактерий «Эколюм». По имеющимся литературным данным аналогичные эффективные токсические концентрации (0,005 мг/мл) были получены при 119 исследовании токсичности наноразмерных частиц цинка на пневмоцитах человека [131]. На следующем этапе изучения общетоксического действия наноразмерных веществ в опытах in vivo и in vitro проводили исследование токсичности наноразмерных частиц титана диоксида. При изучении общетоксического действия наноразмерных частиц титана диоксида в экспериментах in vivo было установлено, что при остром воздействии доза 5000 мг/кг (150 мг/ на одно животное) не вызывает общетоксического эффекта: отсутствуют признаки интоксикации и патоморфологических нарушений. Тем не менее, в литературе имеются сведения о признаках общетоксического действия наноразмерных частиц титана диоксида, вызванных более низкими концентрациями, в субхроническом эксперименте.
В исследованиях Shrivastava R., Raza S., Yadav A. et al. при пероральном введении мышам в течение 28 дней дозы 500 мг/кг (15 мг/ на одно животное) отмечались признаки окислительного стресса в виде повышения уровня активных форм кислорода (АФК) и антиоксидантых ферментов, дофамина и норадреналина в мозговой коре головного мозга. Анализ результатов трансмиссионной электронной микроскопии (ПЭМ) выявил наличие наночастиц титана диоксида в цитоплазме и ядре клеток печени и мозга [144].
![Гигиеническое обоснование и оценка эффективности применения УФ-излучения в комплексной технологии обеззараживания питьевой воды [Электронный ресурс]](/i/i/4428/178934.png "Гигиеническое обоснование и оценка эффективности применения УФ-излучения в комплексной технологии обеззараживания питьевой воды [Электронный ресурс] Фридман Роман Кириллович")
![Гигиеническая оценка эффективности профилактики йодного дефицита йодированной солью на примере Оренбургской обл. [Электронный ресурс]](/i/i/4380/212998.png "Гигиеническая оценка эффективности профилактики йодного дефицита йодированной солью на примере Оренбургской обл. [Электронный ресурс] Бурлуцкая Ольга Ивановна")