Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1. Особенности биотестирования в морской среде 6
2. Источники поступления загрязняющих веществ в морские водоемы 7
3. Солоноводные организмы как тест-объекты в биотестировании морской среды 8
3.1. Виды беспозвоночных, применяемые в качестве тест-объектов 8
3.2. Проблема доступности тест-объектов и задачи культивирования 11
3.3. Экологические особенности Brachionusplicatilis 13
3.4. Экологические особенности Artemia salina 14
3.5. Сравнительная чувствительность тест-объектов. Фактор возраста организма и уровня организации тест-системы 17
4. Показатели токсичности 19
5. Факторы среды, влияющие на токсичность загрязняющих веществ в морской среде 29
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 33
1. Объекты исследования
2. Культивирование Brachionus plicatilis и Artemia salina 33
2.1. Условия культивирования 33
2.2. Приготовление искусственной морской воды 34
2.3. Получение культуры микроводорослей 35
3. Условия проведения экспериментов 35
3.1. Токсиканты 35
3.2. Соленость воды 37
3.3. Постановка эксперимента 38
3.3.1. Постановка экспериментов с Brachionus plicatilis. 38
3.3.2. Постановка экспериментов с Artemia salina 39
4. Обработка результатов 42
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 43
1. Особенности биологии Brachionus plicatilis в культуре при разных условиях 43
1.1. Влияние состава среды на рост популяций Brachionus plicatilis 43
1.2. Влияние осмотичносга среды на рост популяций Brachionus plicatilis 44
2. Исследование эффекта бихромата калия на Brachionus plicatilis 45
2.1. Определение острого эффекта бихромата калия на Brachionus plicatilis при разной солености 45
2.2. Определение эффекта бихромата калия на Brachionus plicatilis в течение поколения при разной солености 47
2.3. Определение эффекта бихромата калия на Brachionus plicatilis в серии поколений 49
2.4. Определение эффекта бихромата калия на модельные популяции Brachionus plicatilis 51
Исследование эффекта хлорида меди на Brachionus plicatilis 55
Определение острого эффекта хлорида меди на Brachionus plicatilis при разной солености
Определение эффекта хлорида меди на Brachionus plicatilis в течение поколения 56
Определение эффекта хлорида меди на Brachionus plicatilis в серии поколений 58
Определение эффекта хлорида меди на модельные популяции Brachionus plicatilis 60
Исследование эффекта спиртов на Brachionus plicatilis 63
Определение острого эффекта спиртов на Brachionus plicatilis 63
Определение эффекта спиртов на Brachionus plicatilis в течение поколения 64
Определение эффекта метанола на модельные популяции Brachionus plicatilis 65
Исследование эффекта буровых препаратов на Brachionus plicatilis 67
Определение острого эффекта буровых препаратов на Brachionus plicatilis 67
Определение эффекта буровых препаратов на Brachionus plicatilis в течение поколения 68
Определение эффекта буровых препаратов на Brachionus plicatilis в серии поколений 69
Определение эффекта бурового препарата на модельные популяции Brachionus plicatilis 73
Обсуждение результатов 75
Сравнение относительной токсичности веществ различной химической природы для Brachionus plicatilis. 75
Сравнение относительной чувствительности показателей жизнеспособности и размножения в выборках и популяциях Brachionus plicatilis 76
Сравнение чувствительности Brachionus plicatilis на уровне особи и популяции 77
Влияние солености на токсичность хрома и меди в выборках и популяциях Brachionus plicatilis 80
Заключение 81
Особенности биологии Artemia salina в культуре при разных условиях... 83
Влияние состава среды на Artemia salina 83
Влияние осмотичности среды на Artemia salina 84
Исследование эффекта бихромата калия на Artemia salina 85
Определение острого эффекта бихромата калия на Artemia salina при разной солености 85
Определение эффекта бихромата калия на Artemia salina в течение одного поколения 86
Последствия кратковременного воздействия бихроматом калия на Artemia salina в поколениях 88
Последствия кратковременного воздействия бихроматом калия на цитологические показатели тканей Artemia salina 90
Исследование эффекта хлорида меди на Artemia salina 94
Определение острого эффекта меди на Artemia salina при разной солености 94
Определение эффекта хлорида меди на Artemia salina в течение одного поколения УЭ
10. Исследование острого эффекта спиртов на Artemia salina 95
11. Исследование эффекта буровых препаратов на Artemia salma Уо
11.1. Определение острого эффекта буровых препаратов на Artemia salina, 96
11.2. Определение эффекта бурового препарата на Artemia salina в течение одного поколения 98
12. Обсуждение результатов 99
12.1 Заключение 102
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 104
ВЫВОДЫ 107
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 109
- Особенности биотестирования в морской среде
- Культивирование Brachionus plicatilis и Artemia salina
- Особенности биологии Brachionus plicatilis в культуре при разных условиях
Введение к работе
Актуальность исследования. Проблема исследования загрязнения морской среды приобрела актуальность в связи с расширением хозяйственной деятельности человека в прибрежных районах, а также с развитием морского транспорта и нефтедобычи на шельфе. Кроме того, за последние десятилетия увеличился объем сточных вод, содержащих промышленные и бытовые стоки. В связи с этим возникла необходимость разработки методик биотестирования для морской среды.
Методики исследования токсичности загрязняющих веществ на морских тест-организмах начали разрабатываться сравнительно недавно. В основе этих разработок лежат схемы проведения токсикологических исследований на пресноводных организмах, получившие широкое распространение благодаря большей востребованности по сравнению с морскими биотестами.
Для биотестирования морской среды в качестве тест-объектов обычно используют организмы, собранные в природных водоемах и адаптированные к лабораторным условиям. Однако предпочтительнее использование лабораторных культур гидробионтов, что позволяет проводить биотестирование независимо от доступности выборок природных тест-объектов и их состояния.
К числу немногих культивируемых солоноводных тест-объектов принадлежат коловратка Brachionusplicatilis Muller и жаброногий рачок Artemia salina L.
Способность тест-объектов переносить токсические нагрузки при загрязнении среды зависит от сопутствующих условий существования. В частности, считается признанным повышение токсичности тяжелых металлов для морских беспозвоночных при понижении солености воды, зачастую без учета экологических особенностей организма.
В связи с изложенным очевидна актуальность исследования хронического действия токсикантов различной химической природы, а также влияния факторов среды (солености) на токсический эффект тяжелых металлов для солоноводных организмов, относящихся к разным систематическим группам, Brachionus plicatilis и Artemia salina.
Цель исследования:
Выявить особенности хронических эффектов действия токсикантов различной химической природы на солоноводные организмы Brachionus plicatilis и Artemia salina в ряду поколений и в модельных популяциях, при разных условиях токсического воздействия.
Задачи исследования:
Исследовать закономерности развития Artemia salina и роста популяций Brachionus plicatilis в лабораторных условиях;
Исследовать влияние факторов среды (разной солености) на токсический эффект тяжелых металлов (хрома и меди) на Brachionus plicatilis и Artemia salina;
Исследовать действие органических веществ (буровых препаратов и спиртов) на Brachionus plicatilis и Artemia salina в остром и хроническом эксперименте;
Исследовать особенности токсического действия хрома на цитологические показатели тканей Artemia salina;
Исследовать отдаленные последствия кратковременного действия высоких концентраций хрома на Artemia salina.
Научная новизна работы.
Впервые проведены исследования токсического эффекта металлов и органических веществ (используемых при нефте- и газодобыче) на серии поколений Brachionus plicatilis, а также отдаленных последствий хронического воздействия хрома на Artemia salina с учетом морфологических изменений и цитологических характеристик тканей артемии.
Установлен разный исход токсического эффекта на выборки и модельные популяции гидробионтов и исследованы возможные причины этого.
Выявлено различие влияния солености на токсическое действие тяжелых металлов на Brachionus plicatilis и Artemia salina, которое объясняется, в частности, особенностями естественных условий обитания этих видов.
Показана опасность значительных экологических последствий, проявляющихся в ряду поколений после кратковременных воздействий токсических веществ, не вызывающих заметных эффектов непосредственно в период экспозиции.
Практическая значимость работы.
Установлены условия, при которых Brachionus plicatilis и Artemia salina могут применяться для целей биотестирования и экологического нормирования в хроническом режиме.
Разработаны методики исследования хронического действия веществ на Brachionus plicatilis в серии поколений и в условиях модельных популяций, на Artemia salina в серии поколений, а также методика оценки последствий кратковременного действия токсикантов на Artemia salina. Данные методики применяли при разработке ПДК препаратов, используемых при бурении.
Разработана и утверждена «Методика определения токсичности
высокоминерализованных поверхностных и сточных вод, почв и отходов по выживаемости солоноватоводных рачков Artemia salina L» ФР 1.39.2006.02505.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на научной конференции «Водные экосистемы и организмы - 2» (Москва, 2000), на съезде токсикологов России (Москва, 2003), на Международной конференции «Современные проблемы водной токсикологии (Борок, 2005).
Публикации. По результатам исследований опубликовано 8 печатных работ, в том числе 1 зарегистрированная методика.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста и состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», заключения, выводов, списка литературы. Список литературы содержит 137 источников, из которых 103 иностранных. Работа иллюстрирована 33 рисунками и 49 таблицами.
Особенности биотестирования в морской среде
Развитие направлений биотестирования в токсикологических исследованиях связано как с исторически обусловленными направлениями и методами (промысловые виды служили первыми тест-объектами), так и с развитием тех или иных отраслей промышленности, являющимися основными источниками поступления токсических веществ и ксенобиотиков в окружающую среду.
Токсикологические исследования в морской среде, и в том числе биотестирование, сталкиваются с теми же проблемами, что и пресноводная токсикология, такими как проблема взаимодействия токсикантов (аддитивность, синергизм и т. д.), выбор чувствительных и информативных показателей токсичности, адаптации гидробионтов к токсическому воздействию, способы экстраполяции данных одновидовых биотестов на экосистемы и др. Так, изучение острого эффекта Си, Сг и их смесей на самок Carcimts maenas показало, что тестированные смеси металлов имели более выраженный эффект, чем отдельные металлы (Elumalai et al.. 200zi. исследователи указывают на важную оольа оценке токсичности таких аспектов, как неустойчивость веществ и смесей в окружающей среде (Chapman, 2000).
Но, помимо этого, в токсикологических исследованиях в морской среде возникают специфические проблемы, связанные, с одной стороны, с особенностями морской среды (к основным экологическим факторам, действующим в пресных водах, добавляется фактор солености воды), а с другой стороны - связанные с проблемой доступности и культивирования тест-объектов.
Существующие методические разработки по биотестированию в морской среде ссылаются на недостаточность соответствующих методических разработок и материалов и преобладание токсикологических исследований, относящихся к пресноводным тест-объектам, из-за чего использование морских биотестов для оценки состава и вредности сточных и природных вод до сих пор не получило широкого распространения (Методические указания..., 1978, Временные методические рекомендации..., 1999).
Авторы подчеркивают, что в связи с остротой современной ситуации химического загрязнения мооеи необходимы не только всесторонние исследования биологического действия и последствий антропогенного нарушения состава морской среды, но и широкое использование токсикологических методов в практике предотвращения загрязнения, методы биотестиоования качества ПРИРОДНЫХ и сточных вод позволяют решать важные вопросы прикладной экологии и токсикологии: сравнительные испытания и контроль токсичности сточных вод и их отдельных компонентов; установление предельно-допустимых концентраций вредных веществ в воде водоемов; выбор наиболее безопасных В экологическом плане препаратов, применяемых при нефтедобыче, ликвидации нефтяных разливов и т.д. (Методические указания..., 1978).
Основные требования, предъявляемые к системе морских токсикологических биотестов, включают следующие:
- высокая чувствительность реагирования тест-объектов на низкие уровни токсических воздействий;
- относительна простота и доступность освоения на методически унифицированной основе в большинстве лабораторий;
- возможность круглогодичной работы со всеми объектами;
- относительно небольшой срок выполнения опытов;
- возможность быстрого проведения в случае необходимости сравнительных испытаний токсичности любого препарата;
- выполнение опытов с сообществами в условиях, максимально приближенных к естественным (Методические указания.,,, 1978).
Культивирование Brachionus plicatilis и Artemia salina
Объектами исследования служили коловратка Brachionus plicatilis Muller и жаброногий рачок Artemia salina L.
В работе использовали лабораторные партеногенетические популяции Brachionus plicatilis, адаптированные к разной солености (10, 20 и 30%о) в течение длительного времени. Исходным материалом для экспериментов на особях служили коловратки в возрасте до 24 часов, на модельных популяциях - культура коловраток плотностью около 20-30 особей/мл, состоящая в основном из молодых особей.
Исходным материалом в опытах на Artemia salina служили наушши в возрасте до 24 часов, полученные в лаборатории из покоящихся яиц. Кроме того, для изучения жизненных показателей рачков, таких как сроки созревания, вели синхронную культуру артемии параллельно при солености 20 и 40%о.
Стабильность условий культивирования обеспечивали в термолюменостате в соответствии с методическими рекомендациями (Временные методические рекомендации..., 1999). Продолжительность светового дня составляла 10 часов (при искусственном освещении). Температуру поддерживали в пределах 23+2С для артемий и 24-26С для коловраток.
Культуры Brachionus plicatilis вели параллельно при солености 10, 20 и 30%о методом накопительного культивирования.
Для поддержания амиктичности коловраток и обеспечения быстрого прироста культуру каждые 7-10 дней разбавляли свежей средой в соотношении 100 мл старой культуры на 200-300 мл среды.
Культуру Artemia salina получали из покоящихся яиц. Сухие яйца артемий заливали предварительно отстоянной и аэрированной водопроводной водой (1-3 г яиц на 500 мл воды). Через 30 минут сливали слой воды над осевшими яйцами, при этом удалялись всплывшие нежизнеспособные яйца и пустые оболочки яиц. Очистку повторяли несколько раз. Затем яйца несколько раз промывали морской водой. Промытые яйца помещали в термолюменостат для выклева. При температуре 23±2С науплии появлялись через 24-36 часов.
Синхронные культуры артемии вели параллельно при солености 20 и 40%о. Плотность посадки составляла 12-15 взрослых рачков на аквариум емкостью 2 л. Смену раствора проводили 1 раз в неделю, заменяя около 1А воды.
Для культивирования коловраток искусственную морскую воду готовили на основе синтетической морской соли марки Tropic marine, для культивирования артемии - на основе hw-Marinemix (фирмы Wiegandt). Выбор соли был обусловлен специфичностью требований к среде артемии и коловраток.
Обе соли близки по составу макро- и микроэлементов, их элементный состав соответствует составу морской воды, опубликованному в Academic Press, London (Bruland, Chemical Oceanography, Vol 8).
Соль hw-Marinemix обогащена микроэлементами, биоэлементами (энзимы, гормоны, витамины) и естественными коллоидами (таб. 2.2.).
В воду, приготовленную на основе соли Tropic marine добавляли витамин В (2-3 капли на 1 л).
Особенности биологии Brachionus plicatilis в культуре при разных условиях
Исследовали рост модельных популяций коловраток в искусственной морской воде, приготовленной на основе морской соли Tropic marine и hw-Marinemix, результаты представлены на рис. 1.1. В двух средах динамика плотности модельных популяций коловраток практически не отличалась. Эти соли сходны по составу макро- и микроэлементов, и отличаются наличием органических добавок (витаминов и др.) в hw-Marinemix. Очевидно, коловратки Brachionus plicatilis не требовательны к содержанию в воде органических «биодобавок». Учитывая экологические особенности этого вида (обитание как в морской среде, так и в соленых озерах, различающихся по минеральному составу), и отмеченную в литературе пластичность коловратки Brachionus plicatilis в отношении химического состава солей (Кутикова, 1970), среда для культивирования и биотестирования на Brachionus plicatilis может быть ограничена минимальным набором элементов, соответствующих составу природных вод. Такой средой может служить искусственная морская соль для аквариумов, обеспечивающая простоту приготовления и постоянный состав.
На рис. 1.2. представлен рост модельных популяций коловраток при солености 10,20 и 30%о.
Сравнение динамики плотности модельных популяций коловраток, адаптированных к соответствующей солености, не выявило различий по скорости прироста и максимальной плотности. Наибольшие отличия наблюдали на начальных этапах роста (первые 3 суток), когда популяции различались длительностью лаг-фазы (от 1 до 3 суток), а после перехода в фазу активного роста (лог-фаза) эти различия нивелировались. В начале лог-фазы наблюдали максимальные значения доли половозрелых самок в популяции (43-88%), после чего эта величина снижалась за счет рождения молоди. Максимальный уровень половозрелых особей достигался в течение 1-3 суток. Значения максимальной доли половозрелых самок в модельных популяциях коловраток характеризовались большой вариабельностью, причем разброс в пределах одного месяца (например, в марте - 46, 62 и 77%) сопоставим с общим разбросом этого параметра в течение года (таб. 1.2.). Различие средних значений максимальной доли половозрелых особей при солености 10, 20 и 30%о статистически недостоверно.
Таким образом, динамика роста модельных популяций коловраток практически не зависела от солености среды, а различия на начальных этапах роста определялись скоростью созревания и накопления половозрелых особей в популяции.
