Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Репарация ДНК, мутагенез и антимутагенез 9
1.1. ДНК-повреждающие и мутагенные факторы 9
1.2. Репарация ДНК и мутагенез у бактерий 16
1.3. Механизмы антимутагенеза 22
Глава 2. Флавоноиды: структура, классификация, свойства, биологическая активность 28
2.1. Природные фенольные соединения 28
2.1. Классификация и общая характеристика флавоноидов 30
2.2. Биологическая активность флавоноидов 36
Глава 3. Объекты и методы исследования 48
3.1. Рабочая коллекция бактериальных культур 48
3.2. Характеристика использованных флавоноидов 49
3.3. Питательные среды и растворы 50
3.4. Условия культивирования и определение количества бактерий 51
3.5. Методы исследования мутагенного, антимутагенного и ДНК-повреждающего действия 52
3.6. Полимеразная реакция in vitro с ДНК-полимеразой I 54
3.7. Анализ активности антиоксидантных ферментов 55
3.8. Статистическая обработка 55
Глава 4. Влияние флавоноидов на рост бактерий 56
4.1. Зависимость роста S. typhimurium от концентрации морина 57
4.2. Влияние морина на рост и частоту мутаций грамположительных бактерий Rhodococcus sp. и В. mycoides 60
4.3. Минимальные ингибирующие концентрации флавоноидов 63
4.4. Подавление флавоноидами роста штаммов Е. coli, дефектных по репарации ДНК 65
4.5. Влияние морина на репликацию ДНК in vitro 67
Глава 5. Влияние флавоноидов на частоту мутаций у S. typhimurium и Е. coli 68
5.1. Мутагенное действие флавоноидов на S. typhimurium 68
5.2. Совместное действие флавоноидов и 9-аминоакридина на частоту мутаций и выживаемость S. typhimurium ТА 1537 72
5.3. Совместное действие флавоноидов и бихромата калия на частоту мутаций и выживаемость S. typhimurium 83
5.4. Совместное действие М-метил-М'-нитро-Ы-нитрозогуанидина и морина на частоту мутаций и выживаемость S. typhimurium ТА535 86
5.5. Мутагенное действие флавоноидов и налидиксовой кислоты на штаммы Е. coli WP2, WP2s, WP6 и СМ561 90
Глава 6. Модуляция генетических эффектов морина солями двухвалентных металлов 92
6.1. Минимальные ингибирующие концентрации солей ряда металлов для S. typhimurium ТА537 93
6.2. Модулирующее действие соли магния 94
6.3. Модулирующее действие соли марганца 96
6.4. Модулирующее действие соли цинка 98
6.5. Модулирующее действие соли железа 99
6.6. Модулирующее действие соли кобальта 101
6.7. Модулирующее действие соли меди 102
Глава 7. Обсуждение результатов 103
Выводы 116
Список литературы 117
- ДНК-повреждающие и мутагенные факторы
- Классификация и общая характеристика флавоноидов
- Методы исследования мутагенного, антимутагенного и ДНК-повреждающего действия
- Влияние морина на рост и частоту мутаций грамположительных бактерий Rhodococcus sp. и В. mycoides
Введение к работе
Актуальность проблемы
В естественной среде генетическая изменчивость и рост микроорганизмов подвержены влиянию различных химических факторов. Достаточно глубоко исследовано влияние некоторых простых ростовых субстратов и необходимых элементов на физиологические процессы модельных штаммов бактерий. В то же время, in vivo клетки микроорганизмов подвержены влиянию ряда веществ, не являющихся необходимыми составляющими питательной среды, но проявляющих различную биохимическую и генетическую активность [24, 89]. Некоторые из этих соединений имеют большое значение в стимуляции или ограничении роста бактерий, в формировании, стабилизации и изменении микробных сообществ. Однако экологическая роль подобных компонентов среды мало изучена [11, 18, 20,24].
Растительный мир - огромное по разнообразию, численности и общей биомассе царство автотрофных организмов, продуцирующих и поставляющих в среду подавляющую часть природных органических соединений [18,34]. Растения являются источником разнообразных биологически активных веществ, которые могут быть эффективными экологическими факторами в микроценозах [18, 89].
Флавоноиды - биогенные фенольные вещества, производные флавана или флавона, содержащиеся в тканях высших растений. В настоящее время известно более четырех тысяч индивидуальных флавоноидов и их производных. Разнообразие флавоноидов достигается за счет комбинации заместителей (-ОН, -ОСНз, -СНз и др. групп) в ароматических кольцах, гликозилирования и димеризации [142]. Как и другие фенольные вещества, флавоноиды связывают свободные радикалы, хелатируют катионы металлов. Эти соединения обладают широким спектром физиологического и биохимического действия на живые организмы различных таксономических групп: участвуют в процессах дыхания, онтогенеза, окислительно 5
восстановительных и защитных системах растений [10, 32] влияют на проницаемость мембран [208], являются эффекторами или субстратами ряда ферментов различных организмов [161]. Известны антиоксидантные [74], антирадикальные [73], противоопухолевые [206], антимутагенные [235] и противовирусные [92] свойства флавоноидов, Р-витаминная активность [208].
Ежегодно растительный мир Земли продуцирует миллионы тонн флавоноидов, которые в существенных количествах поступают из растительных тканей в почву и водоемы, во все пищевые цепи, являются постоянными компонентами среды обитания значительной части живых организмов [10, 32,128]. В отличие от многоклеточных организмов, бактерии имеют максимальный контакт клеточной поверхности с внешней средой, поэтому присутствие флавоноидов должно быть для них особенно значимо [20].
Флавоноиды являются постоянными компонентами продуктов питания человека [4, 21, 22]. Некоторые из них, например кверцетин и его гликозид рутин, используются в медицине. В то же время известно, что кверцетин мутагенен для эукариот [214]. Поэтому исследование генетических эффектов флавоноидов актуально для профилактической медицины [161].
Состояние вопроса
Известны антиоксидантные [201] и антирадикальные свойства флавоноидов [6, 12], цитопротекторное действие на клетки эукариот в различных стрессовых условиях, основанное на связывании свободных радикалов [95, 119,132].
Активно исследуются медицинские аспекты антирадикальных [167], ангиопротекторных [161,180,189], гепатопротекторных [55,119,165], антибактериальных [89], противовоспалительных и иммуномодулирующих [160, 161] свойств препаратов флавоноидов, их цитостатическое действие в отношении злокачественных клеток [99,170,238]. Сообщается об их мутагенном и антимутагенном действии на эукариоты, а также в микробных тест-системах в условиях метаболической активации ферментами микросомальной фракции печени животных [21,70,170]. Обнаружено антибактериальное действие кверцетина, хризина и катехина [89]. Ф В то же время, влияние флавоноидов на изменчивость и рост бактерий
мало изучено. Сведения об их прямом мутагенном действии, антимутагенной активности, антибактериальных свойствах фрагментарны и противоречивы. Опубликованные статьи не дают полного представления о значении флавоноидов как экологического фактора для бактерий. До настоящего времени не проводилось комплексного исследования влияния флавоноидов на рост, жизнеспособность и изменчивость симбиотической и патогенной для человека микрофлоры. Отсутствует оценка баланса мутагенных и антимутагенных свойств этих соединений, их совместного действия с химическими мутагенами и солями металлов [22,44,47].
Цель настоящего исследования - изучение влияния ряда флавоноидов
на частоту мутаций и рост штаммов Escherichia coli и Salmonella typhimurium.
щ
Основные задачи исследования:
1. Изучить влияние различных концентраций флавоноидов на рост энтеробактерий и грамположительных бактерий Rhodococcus sp. и Bacillus mycoides.
2. Определить влияние флавоноидов на частоту замен оснований и фреймшифт - мутаций у штаммов S. typhimurium.
3. Оценить зависимость мутагенной активности флавоноидов от структуры их молекул.
4. Изучить совместное действие флавоноидов и стандартных мутагенов (9-аминоакридина, Ы-метил-М-нитро-Ы-нитрозогуанидина, бихромата, налидиксовой кислоты) на частоту мутаций у энтеробактерий.
5. Исследовать генетические эффекты флавоноидов в присутствии Ж?
солей двухвалентных металлов. Научная новизна
Показано цитостатическое действие флавоноидов, относящихся к группам флавонов, флавон-3-олов, катехинов и флаванонов на клетки грамотрицательных бактерий Е. coli и typhimurium, а также грамположительных бактерий Rhodococcus sp. и В. mycoides. Впервые обнаружено мутагенное действие флавоноидов в культурах грамположительных бактерий Rhodococcus sp. и В. mycoides. Установлено, что флавоноиды без метаболической активации индуцируют у бактерий мутации различных типов, наиболее эффективно - мутации типа сдвига рамки считывания генетической информации. Впервые экспериментально показано антимутагенное действие флавоноидов на штаммах S. typhimurium против прямого мутагена акридинового ряда - 9-аминоакридина и оксиданта - бихромата калия. Выявлена модуляция генетического действия флавоноидов в присутствии солей двухвалентных металлов.
Теоретическое и практическое значение работы
Полученные данные, свидетельствующие о мутагенных и антимутагенных эффектах флавоноидов, расширяют представление о воздействии флавоноидов на рост и генетическую стабильность бактерий, и их значении, как экологического фактора в микроценозах. Результаты исследования имеют практическое значение для профилактической медицины. Обнаруженное явление усиления в присутствии флавоноидов эффективности мутагенеза, индуцированного нитрозогуанидином, может быть использовано в методах химического мутагенеза и селекции.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Флавоны (6-гидроксифлавон, 7-гидроксифлавон, хризин), флавон-3-олы (кверцетин, морин, 3-гидроксифлавон, 3,6-дигидроксифлавон, 3,7-дигидроксифлавон), флаваноны (б-гидроксифлаванон, нарингенин, нарингин) и катехин в концентрации свыше 0,1 мМ оказывают бактериостатическое действие. 2. Флавоноиды являются мутагенами прямого действия и индуцируют в клетках бактерий преимущественно мутации типа сдвига рамки считывания.
3. Флавоноиды оказывают антимутагенное и цитопротекторное действие в условиях мутагенеза, индуцированного 9-аминоакридином и бихроматом калия.
4. Генетические эффекты флавоноидов изменяются в присутствии ионов двухвалентных металлов и трехвалентного железа.
Апробация работы и публикации
Основные положения диссертационной работы доложены на Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды-98», Москва; Областной научно-технической конференции молодых ученых "Химия и экология", Пермь, 1999; V Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды-2001», Волгоград; IX и XI Межвузовских конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых "Экология: проблемы и перспективы", Пермь, 2001, 2003.
По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.
Список принятых сокращений
9-АА - 9-аминоакридин;
АФК - активные формы кислорода;
днДНК - двунитевая ДНК;
онДНК - однонитевая ДНК;
КОЕ - колониеобразующие единицы;
МИК - минимальная ингибирующая концентрация;
МННГ - N- метил -N1- нитро -N- нитрозогуанидин;
МПА - мясо-пептонный агар;
СОД - супероксиддисмутаза;
LB - среда Луриа-Бертани
ДНК-повреждающие и мутагенные факторы
Среди разнообразных повреждений ДНК, приводящих к мутациям, можно выделить несколько распространенных типов. Ошибочное спарывание оснований при репликации является распространенным источником мутаций. Основания ДНК в результате таутомерных изменений конформации и энергетических переходов способны к образованию неканонических пар с частотой IO -ІО 2 (кето-енольные переходы гуанина или тимина и амино-иминные переходы аденина или цитозина) [26, 54]. За счет высокой точности и корректирующей активности. ДНК-полимераз, и других механизмов, ошибочное включение оснований при репликации ДНК происходит на несколько порядков реже, чем это потенциально возможно [40, 111]. Например, ДНК-полимераза І Е.соїі в норме способна допускать ошибки с частотой 10"5-10"6. Мутации в результате ошибочного включения непарных оснований в физиологических условиях происходят еще реже, с вероятностью около 10"10 [40]. Это связано с работой механизмов репарации неспаренных нуклеотидов [111]. К неправильному спариванию оснований могут приводить и некоторые типы химической модификации оснований ДНК [26]. Дезаминирование оснований вызывают, например, гидроксиламин, модифицирующий цитозин, и азотистая кислота, дезаминирующая цитозин и аденин с превращением их в урацил и гипоксанитин, соответственно. Это приводит к заменам оснований в ходе репликации ДНК [23,48].
Алкилирование оснований ДНК, например метилирование, происходит при воздействии многих мутагенов и канцерогенов. Наиболее частые продукты этих реакций - О -метилгуанин, 7-метилгуанин и 3-метиладенин [23]. Первый из этих продуктов мутагенен, а два других делают более лабильной гликозидную связь между основанием и сахаром, способствуя апуринизации. Иногда в результате алкилирования может происходить размыкание пуринового кольца. Многие продукты алкилирования блокируют репликацию [23, 111].
Включение мутагена в ДНК. Ряд нестандартных азотистых оснований и их производных могут включаться в ДНК вместо нормальных оснований. Некоторые из них мутагенны. Так, аналог аденина - 2-аминопурин в составе ДНК способен образовывать пары как с тимином, так и с цитозином, что ведет к образованию транзиций А Т G C и G C А Т. Аналог тимина 5-бромурацил при репликации способен к образованию комплементарных пар как с аденином, так и, в редкой енольной форме, с гуанином, также вызывая транзиций [26,48].
Ряд аддуктов оснований (апуриновые и апиримидиновые сайты, пиримидиновые димеры, сшивки оснований в противоположных цепях ДНК и др.) представляют собой непреодолимые препятствия для матричных процессов, в том числе для репликации ДНК [153]. Подобные повреждения вызываются многими факторами: ионизирующим и УФ-излучением, алкиляторами, окислителями. Нерепарированные повреждения, блокирующие матричные процессы, несовместимы с жизнью [23, 40, 111].
Потеря оснований ДНК (апуринизация и апиримидинизация) происходит сравнительно часто. Спонтанная потеря оснований легко протекает в кислой среде. Скорость апуринизации при физиологических значениях рН и ионной силы при 37С составляет около 3 10 п/с [152]. In vivo такой уровень соответствует потере примерно одного пурина на геном Е. coli за генерацию при времени удвоения ДНК 1 час [153]. Апуринизация происходит в 20 раз чаще, чем потеря пиримидинов. Результатом апуринизации (апиримидинизации) является АР-сайт - дезоксирибоза, лишенная основания. Остаток дезоксирибозы после потери основания находится в равновесии между закрытой фуранозной и открытой альдегидной формами. В последнем случае З -фосфодиэфирная связь лабильна и может подвергаться гидролизу при реакции р- элиминации [153].
Повреждения сахарофосфатного остова ДНК разнообразны. Ионизирующее излучение, окислители, ряд химических агентов и ошибки ферментных систем нуклеинового обмена могут вызывать различные повреждения сахарофосфатного остова ДНК: алкилирование фосфата или дезоксирибозы, окисление дезоксирибозы, сшивки, разрывы нитей и др. [23, 54, 111]. Некоторые виды модификации сахара или фосфата мало влияют на процессы обмена нуклеиновых кислот, не являются причиной мутаций или гибели клеток. Другие повреждения блокируют матричные процессы. Однонитевые разрывы могут быть легко воссоединены ДНК-лигазой, или ликвидированы с участием эндонуклеаз, полимеразы и лигазы. Для репарации ряда повреждений требуется рекомбинация с неповрежденными гомологичными участком [23,33,40,51, 111,149].
Ионизирующая радиация. Основным поражающим фактором ионизирующего излучения являются радикалы кислорода, возникающие в результате фотолиза воды и окисляющие растворенные вещества [20, 28]. Ионизирующее излучение вызывает денатурацию и коагуляцию белков в разбавленных растворах. Наиболее распространенными повреждениями ДНК при облучении являются одно- и двунитевые разрывы [27,48].
Ионы металлов, как и другие катионы, активно влияют на структуру и функции нуклеиновых кислот. В естественных условиях основными противоионами к полианиону ДНК являются ионы калия, натрия и аммония. Данное взаимодействие необходимо для сохранения нативной структуры двойной спирали. Ионы щелочных (Li+, К+, Na ) и щелочноземельных (Mg+, Са+) металлов взаимодействуют преимущественно с фосфатными группами ДНК. Ионы переходных металлов (Mn, Zn, Со, Ni, Cd, Си, Ag, Hg) непосредственно ИЛИ через гидратную оболочку активно взаимодействуют также с основаниями [7,8,9,26]. Катионы имеют большее сродство к фосфатам нативной, чем денатурированной ДНК, вследствие более высокой плотности отрицательного заряда на поверхности двуспиральной молекулы. Азотистые основания более доступны для образования координационных связей с ионами металлов в однонитевой ДНК. Щелочные и щелочноземельные металлы образуют комплексы также с гидроксильными группами Сахаров. У других катионов кроме кадмия такие взаимодействия не обнаружены [9,26].
Классификация и общая характеристика флавоноидов
Один из наиболее значимых процессов, приводящих к повреждениям клеточных мембран - перекисное окисление липидов (ПОЛ). Живые организмы имеют несколько эффективных механизмов защиты от реактивных форм кислорода [127]. Механизмы антиоксидантной защиты клеток включают ферменты супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазу и другие пероксидазы, а также низкомолекулярные соединения: глутатион, аскорбиновую кислоту и токоферол. Повышенное производство реактивных форм кислорода приводит к потреблению эндогенных соединений, связывающих радикалы. Флавоноиды могут вносить дополнительный эффект как экзогенные антирадикальные соединения [170].
Связывая свободные радикалы флавоноиды могут ингибировать окисление липопротеинов низкой плотности [239]. Поэтому флавоноиды могут иметь профилактическое действие против атеросклероза [148]. Показано, что флавоноиды кверцетин и рутин способны ингибировать ферментативное и аскорбат - зависимое перекисное окисление липидов в микросомах и митохондриях печени [31, 79, 107, 197].
В инициировании свободнорадикальных реакций в модельных системах и при некоторых патологических процессах существенную роль играют соединения железа. Ионы железа - известный индуктор окислительного стресса и формирования реактивных форм кислорода. Патологии, вызванные перегрузкой железом, связаны с продукцией реактивных видов кислорода и с высоким риском развития рака печени [233]. Известно, что кверцетин и другие флавоноиды способны к образованию комплексных соединений с ионами железа [35]. Показано, что эти соединения предотвращают ПОЛ, вызванное в клетках хелатами железа [165, 166, 167]. Ингибирование перекисного окисления липидов может объясняться как антиоксидантними, так и хелатирующими свойствами флавоноидов. Установлено, что кверцетин и рутин ингибируют как NADPH-, так и СС14 - зависимое ПОЛ в микросомах печени крыс. При этом флавоноиды не вступают в прямое взаимодействие с гидроперекисями липидов. В ССІ4 - зависимом варианте рутин обладает значительно менее выраженным антиоксидантным действием. На основании изучения реакции окисления флавоноидов продуктами разрушения гидроперекиси линолевой кислоты, катализируемого цитохромом с, предположено, что разное антиоксидантное действие кверцетина и рутина может быть обусловлено различной способностью обрывать цепные свободнорадикальные реакции. Таким образом, антиокислительное действие рутина может быть в значительной степени обусловлено его хелатирующими свойствами [31,154]. Показана способность четырех флавоноидов подавлять реакцию Фентона, индуцируемую комплексом Fe -АТФ. Кверцетин и лютеолин более эффективно подавляют реакцию Фентона, чем нарингенин и байкалеин [82].
Антиоксидантными и антирадикальными свойствами флавоноидов объясняется их значение для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний [134,136, 143,147, 150,203].
Кроме антиоксидантного действия обнаружен другой механизм цитопротекторного действия флавоноидов: мирицетин стимулирует процессы эксцизионной репарации повреждений, индуцированных хелатами железа [55].
Флавоноиды могут защищать клетки от окислительного стресса, устраняя реактивные интермедиаты кислорода [31, 129, 140, 201, 210] и хелатируя железо [166]. В то же время известно прооксидантное действие флавоноидов [154]. Например, кверцетин при взаимодействии с ионами переходных металлов генерирует свободные радикалы [154, 173]. Продукты окисления флавоноидов также могут генерировать свободные радикалы [13]
К настоящему времени из нескольких тысяч флавоноидов менее 100 соединений исследовались на предмет мутагенности [103]. У ряда этих соединений обнаружена мутагенная активность [70, 156, 168, 225]. Например, кверцетин и кемпферол, способны индуцировать мутации у штаммов S. typhimurium ТА 98 и ТА 100 [214]. Кверцетин содержится во многих пищевых продуктах: фруктах, чае, красных винах. Поэтому изучению его генотоксичности уделяется много внимания [135, 214].
В обзоре J.P. Brown систематизированы собственные исследования авторов и сведения из ранних работ, посвященных генетическим эффектам флавоноидов, [77]. Приведены данные тестирования 63-х флавоноидов, относящихся к группам флавонов, изофлавонов, флавонолов и их гликозидов, флаванонов и их гликозидов, катехина, дигидрохалконов и их гликозидов, антоцианидинов, в тесте Эймса (Salmonella/микросомы) на штаммах S. typhimurium ТА1535, ТА1537, ТА1538, ТА100 и ТА98. Мутагенное действие отмечено только у 10 флавонолов на штаммах ТА 1537, ТА100 и ТА98, а у кверцетина также и на штамме ТА1538. Отмечено также мутагенное действие кверцетина на штаммах Е. coli WP2, СМ611 и рої А без метаболической активации, а также на штаммах В. subtilis и & cerevisiae [77].
М. Nagio и соавторы [168] опубликовали результаты измерения мутагенной активности 61 флавоноида и 11 структурно близких соединений на штаммах S. typhimurium ТАЇ00 и ТА98. Среди 22 тестированных флавонов только вогонин (3,5- дигидрокси, 8-метоксифлавон) показал высокую мутагенную активность на штамме ТА 100 в присутствии микросомальной фракции S-9. Без добавления S-9 мутагенная активность вогонина была значительно ниже, но имела более линейную зависимость от его концентрации. Из 16 флавонолов для штаммов ТА 100 и ТА98 были мутагенны 3-гидроксифлавон, кверцетин и его производные, кемпферол и рамнетин. Отмечено, что для проявления мутагенной активности флавоноидов важна 3-гидроксигруппа. Без метаболической активации высокую мутагенную активность показал рамнетин. Флаваноны были слабо мутагенны только для штамма ТА 100, но не для ТА98. При этом добавление фракции S-9 не повышало, а снижало их мутагенный потенциал. Изофлавоны были слабо мутагенны для штамма ТА 100 в условиях метаболической активации, но не влияли на частоту реверсий штамма ТА98, а также ТА 100 без фракции S-9 [168].
J.Rueff с соавторами, сравнивали мутагенную и ДНК - повреждающую активность кверцетина, рутина и красного вина. Для этого использовали тест Эймса, а также методы учета индукции SOS-функций в клетках Е. coli и сестринских хроматидных обменов (СХО) в лимфоцитах человека in vitro [207]. Показано, что в условиях метаболической активации мутагенность кверцетина в тесте Эймса усиливается, но его активность в SOS-хромотесте снижается. Также при активации снижается, хотя в меньшей степени, способность кверцетина индуцировать СХО в лимфоцитах человека.
Методы исследования мутагенного, антимутагенного и ДНК-повреждающего действия
Для оценки роста культуры энтеробактерий выращивали в 100 мл LB-бульона в колбах Эрленмейера объемом 250 мл при 37С. Штаммы Rhodococcus sp. gtl и В. mycoides В5 культивировали при 30С. Начальная концентрация бактерий в колбах составляла 1-2x10б кл/мл. Рост бактерий оценивали по изменению оптической плотности суспензии, а также по количеству жизнеспособных клеток. Оптическую плотность культуры измеряли на фотометре КФК-3 при длине волны 540 нм (ОП54о).
Количество жизнеспособных клеток определяли путем подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл среды методом серийных разведений с последующим высевом на чашки Петри, содержащие агаризованную среду LB. Чашки инкубировали в термостате в течение 2 суток при 37С, а затем вели подсчет количества выросших колоний [39].
Минимальные ингибирующие рост бактерий концентрации (МИК) флавоноидов измеряли в суспензионном тесте [61] на иммунологических планшетах следующим образом: клетки Е. coli подращивали в колбах Эрленмейера на LB-бульоне при 37С до середины логарифмической фазы. В каждую лунку иммунологического планшета вносили по 100 мкл свежей питательной среды. В рядах планшета последовательно готовили серийные двукратные разведения тестируемых флавоноидов в диапазоне концентраций от 10 мкМ до 10 мМ. После этого в каждую лунку добавляли тест-культуры соответствующего штамма Е. coli до рабочей концентрации 105 клеток/мл. В отдельных лунках готовили контроли роста без флавоноида и контроли стерильности среды. Спот-тест для оценки мутагенности [1, 50]. Культуру бактерий с чашки МГЛА переносили петлей в 10 мл LB бульона и инкубировали без перемешивания в течение 18 часов при 37С. 1 мл культуры засевали в 19 мл LB бульона и инкубировали на шейкере при 37С до плотности ок. 5х 108 клеток/мл. Полученную культуру центрифугировали на центрифуге Опн-8 при 5000 об/мин в течение 15 минут. Осадок ресуспендировали в жидкой минимальной среде до концентрации 2х109кл/мл. По 0,25 мл суспензии клеток вносили в пробирки с расплавленным и термостатированным при 46С верхним полуобогащенным 0,7% агаром, перемешивали и выливали на чашки Петри, залитые 25 мл минимального агара.
В центр чашек Петри с селективной средой, засеянной газоном тест-культуры помещали 20 мкл раствора исследуемого соединения на стерильном диске фильтровальной бумаги. Вокруг дисков с соединениями, обладающими мутагенной активностью, возникало кольцо колоний ревертантов. Тест Эймса без метаболической активации. Определение частоты реверсий к прототрофности проводили модифицированным методом Эймса без метаболической активации [1,46, 50].
Культуру из колонии, выращенной на LB - агаре, засевали петлей в 10 мл LB - бульона и инкубировали 18 часов при 37С. 1 мл полученной культуры засевали в 19 мл LB-бульона и инкубировали при 37С с перемешиванием до плотности 5x10 кл/мл. Затем культуру переносили в стерильные пробирки и центрифугировали при 5 тыс. об./мин в течение 15 минут. Осадок ресуспендировали в фосфатно-солевом растворе STM 3:1 до плотности 2x109 кл/мл.
Чашки Петри заливали слоем нижнего агара (по 25 мл) и выдерживали при комнатной температуре в течение 2 часов. Пробирки с 2 мл селективного полуобогащенного 0,7% агара помещали на кипящую водяную баню до расплавления агара, а затем в термостатированную водяную баню с температурой 45-46С. В каждую пробирку вносили инкубационную смесь в соответствии с условиями эксперимента и по 0,25 мл суспензии бактерий.
Содержимое пробирки быстро перемешивали, выливали на чашку с нижним агаром и легкими покачиваниями распределяли ровным слоем по поверхности нижнего агара. После застывания верхнего агара чашки помещали в термостат и инкубировали при 37С. Учет результатов на селективной среде проводили через 48 часов инкубации.
Для оценки выживаемости из всех вариантов инкубационной смеси готовили ряд последовательных 10-кратных разведений в STM 3:1 до 10"6. Затем из 5 и 6 (а при необходимости из 3 и 4) разведений всех вариантов по 0,1 мл вносили в пробирки с расплавленным и термостатированным при 45-46С 0,6% LB-агаром. Содержимое каждой пробирки перемешивали, выливали на чашки с LB-агаром и равномерно распределяли по поверхности. После застывания верхнего агара чашки инкубировали при 37С. Количество выживших клеток подсчитывали через 18-20 часов роста. Частоту мутаций определяли как соотношение количества ревертантов к количеству жизнеспособных клеток в единице объема среды инкубирования.
Суспензионный тест для оценки ДНК-повреждающего действия [1,49]. Тестерные штаммы засевали в среду LB до концентрации 105 клеток/мл. Полученную суспензию разливали в колбы по 50 мл. В ряд пробирок добавляли серию двукратных или трехкратных разведений тестируемого вещества. Пробы инкубировали при 37С. Чувствительность штаммов к тестируемым соединениям оценивали по оптической плотности клеточной суспензии при длине волны 540 нм (ОП54о), измеряемой с интервалом в 30 минут.
Полимеразную реакцию in vitro с ДНК-полимеразой I (фрагмент Кленова) проводили по протоколу приготовления высокомеченных зондов [37, 38], модифицированному для определения влияния флавоноидов на полимеразную реакцию. В качестве матрицы использовали однонитевую ДНК бактериофага М13тр18, в качестве затравки - универсальный 17-мерный секвенирующий праймер. Ночную культуру Е. coli JM109 разводили двойной средой Луриа-Бертани, инфицировали бактериофагом и инкубировали при 37С в течение 8 часов. После этого клетки удаляли центрифугированием. К супернатанту добавляли 0,3 объема ПЭГ/NaCl, выдерживали 10 мин и осаждали бактериофаг центрифугированием. Фаговую ДНК выделяли фенольным методом [38]. Реакцию проводили в два этапа: 1. Смешивали в полипропиленовой микропробирке типа "эппендорф" 4 мкл однонитевой ДНК М13 (1 мг/мл), 2 мкл 10-кратного реакционного буфера, 4 мкл раствора праймера (100 пмоль/мл). Смесь выдерживали 30 при 55С. 2. После охлаждения добавляли 2 мкл смеси dNTP (2 мМ), 2 мкл фрагмента Кленова ДНК- полимеразы І Е. coli (10 ед.), бидистиллированную воду до 20 мкл. Инкубировали при 37С 1 час. В вариантах опыта в инкубационную среду на 1 или 2 этапе вносили флавоноид в исследуемой концентрации. Результаты реакции анализировали путем электрофореза в 1%агарозном геле при напряженности поля 1 В/см с последующим окрашиванием геля бромистым этидием.
Влияние морина на рост и частоту мутаций грамположительных бактерий Rhodococcus sp. и В. mycoides
Известно, что флавоноиды проявляют антиоксидантные, антирадикальные и, в ряде случаев, прооксидантные свойства [154]. В связи с этим, актуально изучение совместного действия флавоноидов с мутагенами -окислителями.
Исследовано совместное действие морина и окислителя бихромата калия на выживаемость и мутагенез тестерных штаммов Salmonella typhimurium ТА1537 (hisC3076, rfa, uvrB) и TA1535 (hisG46, rfa, uvrB) ауксотрофных по гистидину, несущих дефекты клеточной стенки и эксцизионной репарации. Штамм ТА 1537, несущий фреймшифт-мутацию +1 (/j/sC3076), регистрирует мутации типа сдвига рамки считывания, штамм ТА 1535 несет миссенс-мутацию hisG46 и регистрирует, в основном, замены оснований.
Клеточную суспензию инкубировали в фосфатно-солевом буфере без морина или с морином в концентрации 1,3 и 10 мМ, без бихромата, а также в сочетании с бихроматом калия в концентрации 200 мкг/мл. Частоту реверсий рассчитывали как отношение количества ревертантов в единице объема к количеству жизнеспособных клеток (колониеобразующих единиц).
На рис. 20 показана зависимость количества жизнеспособных клеток S. typhimurium ТА1537 от концентрации морина и добавления бихромата калия. Бихромат в условиях эксперимента в два раза снижал количество жизнеспособных клеток по сравнению с контролем. В вариантах с морином в концентрации 1 и 3 мМ наблюдалось еще большее подавление роста, а 10 мМ морин снижал количество жизнеспособных клеток на три порядка. При добавлении бихромата в инкубационную смесь с 1 и 3 мм морином не происходило значительного снижения количества жизнеспособных клеток. Но при совместном действии 10 мМ морина с бихроматом наблюдался аддитивный токсический эффект.
Морин в концентрации 1 и 3 мМ незначительно повышал частоту реверсий обоих штаммов. В концентрации 10 мМ морин увеличивал частоту мутаций более чем на 2 порядка. Морин в концентрации 1 и 3 мМ снижал частоту реверсий, индуцированных бихроматом. При обработке клеток ТА 1537 бихроматом совместно с 10 мМ морином наблюдалось повышение частоты реверсий на порядок по сравнению с вариантом, содержащим один бихромат. Таким образом, бихромат, морин и их сочетания способны эффективно индуцировать реверсии к прототрофности как на штамме S. typhimurium ТАЇ535, так и ТА 1537. В концентрации до 3 мМ морин оказывал небольшое антимутагенное действие в отношении бихромата калия. При концентрации 10 мМ морин с высокой частотой индуцировал как фреймшифт, так и миссенс - мутации. Аналогичные эффекты наблюдалось в опытах с другими флавоноидами: нарингенином и кверцетином. Ы-метил-К-нитро-М-нитрозогуанидин (МННГ), алкилирующий агент из группы N-нитрозаминов, является одним из самых высокоэффективных известных мутагенов прямого действия. Это соединение индуцирует главным образом замены оснований, которые хорошо регистрируются на тестерном штамме S. typhimurium ТА1535. Известно, что флавоноиды могут вызывать модулирующее действие на мутагенез, индуцированный МННГ у штамма S. typhimurium ТА 100NR, производного S. typhimurium ТАЇ535 с усиленной функцией SOS-мутагенеза [109]. Нами исследовано совместное действие морина в концентрации 1 и 5 мМ и МННГ в концентрации 50 мкг/мл на выживаемость и мутагенез штамма S. typhimurium ТА1535 (рис.22). Высев на минимальную среду проводили после 40-минутной инкубации. В вариантах сравнения 7 и 8 морин добавляли в инкубационную смесь после 40-минутной инкубации с МННГ. Как видно из рис. 22, при совместной 40-минутной инкубации с МННГ морин в концентрации 1 мМ (вар. 5) и 5 мМ (вар. 6) снижал частоту мутаций, индуцируемых МННГ в 2,2 и 2,7 раз, при этом выживаемость повышалась на 37 и 80 % соответственно. В то же время, добавление морина в инкубационную смесь после 40-минутной инкубации с МННГ незначительно влияло на мутагенез и жизнеспособность бактерий по сравнению с действием одного МННГ (вар.2).