Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Проблемы и методы определения видового состава бактериопланктона: обзор литературы 7
1.1. Основные подходы к изучению водной микрофлоры 7
1.2. Развитие методов идентификации бактерий 10
1.3. Использование рРНК для создания молекулярной филогенетической систематики прокариот 13
1.4. Основные методы анализа последовательностей рРНК для изучения некультивируемых водных бактерий 18
1.4.1. Определение нуклеотидной последовательности рРНК 18
1.4.2. Гибридизация рРНК с олигонуклеотидными зондами 20
1.4.3. Различные варианты ПЦР для качественного и количественного анализа бактериальных сообществ 21
1.4.4. Методы мониторинга динамики структуры бактериального сообщества 22
1.4.5. Ограничения методов, использующих рРНК-подход 25
1.5. Применение методов молекулярно-генетического анализа для изучения бактериальных сообществ водных экосистем 28
Глава 2. Объекты и методы исследований. 41
2.1. Характеристика района исследований 41
2.2. Материал и методика 45
2.2.1. Методика гидробиологических исследований пруда Бугач 45
2.2.2. Методика отбора и обработки проб воды для анализа видового состава бактериопланктона 46
2.2.3. Выделение геномной ДНК бактерий 48
2.2.4. Амплификация и клонирование генов 16S рРНК бактерий 49
2.2.5. Определение нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов гена 16S рРНК 52
2.2.6. Анализ сезонной динамики видового состава бактериопланктона методом денатурирующего градиентного гель-электрофореза...52
2.2.7. Схема постановки и проведения эксперимента по изучению субстратов некультивируемого бактериопланктона пруда Бугач 55
2.2.8. Анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК 56
2.2.9. Статистическая обработка результатов 56
Глава 3. Бактериопланктон пруда Бугач и его связь с гидробиологическими и гидрохимическими показателями экосистемы 57
Глава 4. Определение видового состава зимнего бактериопланктона двух эвтрофных прудов по последовательностям гена 16S рРНК 68
Резюме 77
Глава 5. Изучение сезонной динамики видового состава бактериопланктона прудов Бугач и Лесной методом денатурирующего градиентного гель-электрофореза 79
Обсуждение 89
Резюме 92
Глава 6. Идентификация видового состава водных бактерий, потребляющих полигидроксиалканоаты 93
Заключение 99
Выводы 101
Литература 102
- Развитие методов идентификации бактерий
- Применение методов молекулярно-генетического анализа для изучения бактериальных сообществ водных экосистем
- Методика отбора и обработки проб воды для анализа видового состава бактериопланктона
- Схема постановки и проведения эксперимента по изучению субстратов некультивируемого бактериопланктона пруда Бугач
Введение к работе
В.И. Вернадский (1978) писал в 20-е годы, что человек как масштаб явлений бесконечно мал по сравнению с живой природой и легко постигает свойства ее элементов - организмов, но лишь путем трудной и долгой абстракции может подняться до понимания свойств их совокупности — живого вещества. Таким образом, осознание необходимости системного подхода в экологии произошло уже давно, фактически с момента зарождения ее как самостоятельной науки. Но если теоретико-философские представления о целостности экологических систем, их интегральном функционировании достаточно развиты, то решение конкретных задач описания динамики частных экосистем, установление количественных закономерностей и законов их функционирования сталкивается с трудностями, имеющими принципиальный методологический характер.
Необходимым компонентом любых экологических исследований является измерение интегральных функций экосистем, их изучение в воспроизводимых экспериментах и формализация в прогностических и оптимизационных математических моделях. Для достижения подобных целей необходима специальная аппаратура, работающая с объектами, масштабы которых существенно больше масштабов индивидуального человеческого восприятия, и методы практической абстракции: физическое и математическое моделирование. Именно это и является областью биофизики экосистем как научной дисциплины, развивающейся на стыке экологии и биофизики. Задачи и предмет экологической биофизики состоят в следующем (Гительзон и др., 1993): 1) изучение физических процессов, являющихся отражением интегральных свойств экосистем, и создание соответствующих методов мониторинга; 2) осуществление практической абстракции — физическое и математическое моделирование; 3) изучение роли живых организмов в физических процессах экосистемного масштаба.
5 В экологической биофизике функциональная (биогеохимическая) роль видов в экосистеме формализуется в виде численных значений кинетических ростовых характеристик: ji(S) и Ks. Они количественно выражают интегральную скорость биохимических реакций, которая заложена в генотипе организмов. Эти биохимические константы с учетом температурных и других поправок могут быть включены в модели любого водоема, где обитают данные виды (Гладышев, 1999). Важно отметить, что кинетические характеристики не могут быть достоверно определены на основании изучения одних лишь временных рядов (Дегерменджи, Гладышев, 1995). Они определяются в независимых от сезонной и годовой динамики численности лабораторных экспериментах на чистых культурах организмов (например, Болсуновский и др., 1990; Гладышев и др., 1994; Гладышев и др., 1996; Губанов и др., 1996). Однако, если для фито- и зоопланктона полученные значения констант - это действительно видовые характеристики, бактериопланктон практически во всех моделях природных водоемов представлен агрегированной компонентой (Адамович, Межевикина, 1986; Адамович, 1992). В то же время, хорошо известно, что природные сообщества водных бактерий представляют собой чрезвычайно гетерогенную систему отдельных видов, выполняющих различные геохимические функции и по-разному взаимодействующих с другими звеньями экосистемы (Горленко и др., 1977; Романенко, 1985). Исследователи неоднократно указывали на необходимость дезагрегации бактериального звена с целью повышения адекватности описания трофического взаимодействия бактерий с компонентами экосистем (Адамович, 1992; Гладышев и др., 1997). Понятно, что в идеальном случае определение кинетических характеристик необходимо проводить для отдельных видов водных бактерий, однако классические методы водной микробиологии не обеспечивали такой возможности. Основным методом определения видовой принадлежности бактерий в течение длительного периода было выращивание на твердых селективных средах. Однако, как известно (Горленко и др., 1977; Cole, 1982; Amann et al.,
1995), на твердых средах вырастает не более 1-3% планктонных бактерий, определяемых прямым счетом. Поэтому до недавнего времени видовой состав бактериопланктона оставался практически неизвестным. Появление методов молекулярно-генетической идентификации бактерий позволяет надеяться, что методические трудности описания бактериального звена водных экосистем будут преодолены и описание микробного звена водных экосистем будет отвечать требованиям эколого-биофизического подхода.
Целью диссертационной работы явилось качественное и количественное изучение бактериопланктона двух пресноводных водоемов методами мо-лекулярно-генетического анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК. Были поставлены следующие задачи:
Определить видовой состав бактериопланктона эвтрофных водохранилищ Бугач и Лесной.
Изучить сезонную динамику видового состава бактериопланктона этих водоемов.
Определить виды водных бактерий, использующих в качестве субстрата биоразрушаемые полимеры гидроксиалканоатов.
Развитие методов идентификации бактерий
Как известно (Гусев, Минеева, 1992), существуют два типа систематики биологических объектов: филогенетическая, или естественная, в основе которой лежит установление родственных (генетических, эволюционных) связей между организмами, и практическая, или искусственная, цель которой - выявление степени сходства между организмами для их быстрой идентификации и установления принадлежности к определенным таксонам. Очевидно, что для исследований в области экологической биофизики важен второй тип систематики - практический. Наиболее полно задача быстрой идентификации прокариотных организмов решается с помощью Определителя бактерий Берджи, выпускаемого периодически Обществом американских бактериологов с привлечением крупных специалистов в области изучения тех или иных групп бактерий. Очевидно, что для бактерий, не выделенных в чистую культуру, данный подход неприемлем.
Если существующая систематика высших организмов отражает в определенной мере эволюционные связи между ними, т. е. признаки, используемые для! выявления степени сходства, отражают и степень родства между этими организмами, то попытка создания на этой же основе систематики прокариот не была успешной (Woese, 1987). Важным признаком, определяющим принадлежность организмов к одному виду, является их способность скрещиваться и давать жизнеспособное потомство. Однако прокариоты размножаются преимущественно неполовым путем, поэтому данный признак для определения видовой принадлежности к ним неприменим. Отнесение прокариотных организмов к одному или разным видам осуществляется в большой степени эмпирическим путем на основе анализа многих признаков, при этом генетическая информация, содержащаяся в нехромосомных генетических элементах, для определения видовой принадлежности не используется. Высокая скорость размножения бактерий, а значит и высокая скорость мутационных процессов, наличие горизонтального переноса генетической информации являются причиной быстрой изменчивости прокариот и вынуждают использовать очень большое число признаков для их классификации. Вероятно, наилучшим рабочим определением бактериального вида является следующее: группа штаммов, проявляющих высокую степень сходства всех фенотипических признаков, которая отличается от близких групп штаммов по многим независимым признакам (Rossello-Mora, Amann, 2001). Таким образом, в идеале, бактериальные виды необходимо описывать на основе полной, всеохватывающей характеристики фенотипа, а лучше - генотипа. Однако в настоящий момент для большинства групп бактерий описана только часть фенотипа и совсем небольшая часть генотипа. В связи с развитием техники секвенирования ДНК в последние годы постепенно расшифровываются геномы все большего числа видов бактерий, что позволяет проводить сравнительный анализ полных геномных последовательностей (Stein, et al., 1996; Sicheritz-Ponten, Andersson, 2001; Bansal, Meyer, 2002). Однако этот подход крайне трудоемкий, сравнительно слабо разработанный, и самое главное -его использование также требует выделения исследуемых бактерий в чистую культуру.
Важным шагом в развитии систематики прокариот явилось использование признаков, дающих информацию о химическом строении клетки: состав оснований ДНК, ДНК-ДНК- и ДНК-рРНК-гомология, аминокислотная последовательность белков, строение рибосом, компонентов клеточной стен ки и т. д. Важный шаг на пути создания естественной систематики прокариот связан с успехами молекулярной биологии. В 60-х гг. было установлено, что все свойства организма определяются уникальными химическими молекулами - ДНК, поэтому бактерии могут быть классифицированы путем сравнения их геномов. По такому признаку как генетический материал, оказалось возможным на основании выявления степени сходства делать вывод о степени родства между организмами. Первоначально для таксономических целей сравнивали молярное содержание суммы гуанина и цитозина (ГЦ) в процентах от общего количества оснований ДНК у разных объектов (Gonzalez, Saiz-Jimenez, 2002). Этот показатель у прокариот колеблется от 25 до 75%, у эука-риотных микроорганизмов амплитуда вариаций сужается: у грибов - 26-70%, водорослей - 37-68%, простейших - 22-68%, у высших растений и животных - 35-45% (Stanier et al., 1981). Технически более удобным методом оказалось сравнение бактериальных геномов по температуре плавления ДНК, т.к. она напрямую зависит от содержания ГЦ-пар, суммарная энергия водородных связей и, следовательно, температура плавления которых существенно выше, чем у АТ-пар. Однако ГЦ-показатель дает возможность только для грубого сравнения геномов (Rossell6-Mora, Amann, 2001). Если организмы имеют одинаковый нуклеотидный состав ДНК, возможно и сходство и различие между ними, поскольку генетическое кодирование основано не только на определенном содержании оснований в единице кодирования (триплете), но и на их взаимном расположении. Более тонкий метод оценки генетического сходства организмов — сравнение нуклеотидных последовательностей ДНК из разных источников методом ДНК-ДНК- или ДНК-рРНК-гибридизации (Sambrook et al., 1984). Метод наиболее полезен для классификации на уровне вида, т. е. в случае изначально высокой степени гомологии сравниваемых организмов, и мало информативен для классификации объектов на уровне высоких таксонов. Так, еще в 1973 г. было определено, что у штаммов одного вида уровень гомологии составляет 70% и выше, и именно этот уровень го мологии был принят в качестве показателя, определяющего степень родства сравниваемых видов бактерий (Cohan, 2002). В то же время часто имеет место несовпадение выводов, сделанных на основании фенотипических признаков и ДНК-гибридизации (Amann et al., 1995). В целом значение данных о строении ДНК для систематики прокариот огромно, так как позволяет перейти от установления степени сходства к выводам о степени родства между организмами. Помимо анализа молекул ДНК для установления степени родства между прокариотными организмами были разработаны методологические подходы, позволяющие сравнивать продукты отдельных генов, выполняющие в клетке одинаковые функции (Stanier et al., 1981). Это могут быть белки (ферредоксины, цитохромы и др.) или рибосомальные РНК. С использованием последних в качестве филогенетических маркеров связано крупное открытие, позволяющее по-новому взглянуть на систему живого мира.
Применение методов молекулярно-генетического анализа для изучения бактериальных сообществ водных экосистем
Несмотря на возрастающий интерес к молекулярным методам изучения видовой структуры бактериального звена экосистем, они, в силу своей высокой стоимости и серьезных требований, предъявляемых к квалификации исследователя, пока не нашли широкого применения в общелабораторной практике. Среди мировых лидеров этого направления можно назвать следующие научные коллективы: группа проф. Р. Аманна (лаборатория молекулярной экологии, Институт морской микробиологии им. Макса Планка, Бремен, Германия); группа проф. Й. Оверманна (Институт генетики и микробиологии, Людвиг-Максимилиан-Университет, Мюнхен, Германия); группа проф. М. Саймона (Институт химии и биологии морских экосистем, Ольден-бургский университет, Германия); группа проф. К.Н. Тиммиса (лаборатория микробиологии окружающей среды, Германский исследовательский центр биотехнологии, Брауншвейг, Германия); лаборатория проф. С. Джиованньо-ни (Департамент микробиологии, Университет штата Орегон, Корваллис, Орегон, США); научный коллектив Департамента морской биологии и океанографии Института морских исследований (Барселона, Испания); научный коллектив Департамента лимнологии Центра эволюционной биологии (Университет г. Уппсала, Швеция); группа экологии микроорганизмов проф. Р. Лаанброека (Лимнологический Центр, Институт экологии, Ньюверслиус, Нидерланды).
Впервые молекулярно-генетический подход для изучения видового состава бактериальных сообществ был применен в исследованиях морского пи-копланктона. Предварительные исследования показали, что доминирующими организмами в морском пикопланктоне Саргассового моря являются представители домена Bacteria (Giovannoni et al., 1990). В пробах было выявлено присутствие большого количества неизвестных ранее видов. Анализ проб из подповерхностного слоя воды Тихого океана показал сходные результаты (Schmidt et al., 1991). В обоих случаях, несмотря на использование разных методик, большую территориальную удаленность (скорее даже географическую изоляцию) точек отбора проб, были выявлены представители подкласса цианобактерий (Synechococcus spp. и Prochloron spp.), а также а- и у-подклассов протеобактерий (Mullins et al., 1995). В пробах бактериопланкто-на Саргассового моря были обнаружены многочисленные последовательности 16S рРНК, сгруппированные в SAR11 кластер а-протеобактерий (Giovannoni et al., 1990; Field et al., 1997). Авторы высказали предположение, что последовательности данного кластера свидетельствуют о существовании-весьма многочисленной, но некультивируемой группы морских бактерий. Гибридизация 16S рРНК со специфичными зондами показала, что последовательности этой группы бактерий составляют около 12.5% от суммарной рРНК бактерий Саргассового моря. Ни одна из последовательностей не име ла более 96% гомологии с известными на тот период культивируемыми бактериями, однако многие из них были на 97 и более процентов гомологичными к последовательностям, обнаруженным на разных станциях отбора в Тихом океане (Mullins et al., 1995). Наиболее близкими к выявленным клонам оказались бактерии родов Oceanospirillum, Vibrio, Photobacterium и She-wanella. На самых разных глубинах, от 10 до 500 м, также было обнаружено около 4% последовательностей царства Archaea (Massana et al., 1997). Изучение вертикального распределения и временной динамики архебактерий в океанических водах вблизи Антарктиды показало относительно равномерное распределение и клеточную активность этих организмов в пространстве, наличие сезонной динамики, отрицательно коррелирующей с ростом температур и развитием фитопланктона (Massana et al., 1998; Murray et al., 1998; Murray et al., 1999).
При изучении разнообразия морского пикопланктона в Тихом и Атлантическом океанах было выявлено доминирование последовательностей у- и а-подклассов протеобактерий, а также актиномицетов (Giovannoni et al., 1996). Было обнаружено значительное филогенетическое разнообразие акти-номицетных бактерий среди морских микроорганизмов (Rappe et al., 1997) и бактерий, отнесенных к кластеру зеленых несерных бактерий (Giovannoni, Rappe, 2000). Для бактерий численно доминировавших групп СЫогоЫит и Fibrobacter была характерна вертикальная стратификация (Gordon et al., 1996).
Изучение сезонной динамики отдельных групп бактерий в заливе Чеза-пик на северо-восточном Атлантическом побережье США методом FISH выявило наличие сезонной динамики у-протеобактерий рода Vibrio с максимальной численностью до 107 кл-л 1 в летний период (Heidelberg et al., 2002b). Сопоставление динамики размерных фракций зоопланктона и численности бактерий позволило выявить связь определенных групп бактерий и зоопланктона, особенно в зимний период (Heidelberg et al., 2002а).
Исследование пространственно-временного распределения бактерио-планктона Каталанского побережья северо-западного района Средиземного моря методом ДГТЭ показало наличие устойчивых различий между образцами бактерий прибрежной зоны и открытого моря, и выявило зависимость сезонной динамики бактериопланктона прибрежных районов от гидрографических особенностей участков пробоотбора (Schauer et al., 2000). Вопреки ожиданиям, было отмечено одинаковое разнообразие видового состава бактерий эвтрофной прибрежной зоны в районе Барселонской гавани и участков открытого моря.
Отбор проб средиземноморского бактериопланктона с трехчасовыми промежутками в течение трех суток и определение зонд-специфичных групп бактерий позволил выявить суточную динамику численности и активности клеток Synechococcus spp., гетеротрофных бактерий и вирусных частиц (Betarel et al., 2002). Выяснилось, что динамика вирусов более тесно связана с динамикой цианобактерий, чем гетеротрофных бактерий, а активность последних слабо связана с содержанием растворенного органического вещества. Изучение фильтрующихся бактерий размерами менее 0.2 мкм показало их принадлежность сразу к нескольким, обычным для морских экосистем таксонам. Это позволило исследователям предположить, что такие бактерии являлись мелкоклеточными формами, испытывающими дефицит питания (Haller etal., 1999).
В Эгейском море методами «фингерпринта» было выявлено наличие сложного пространственного распределения планктонных и связанных со взвешенными частицами бактерий (Moeseneder et al., 2001). Анализ структуры подобных сообществ в западном районе Средиземного моря показал относительно бедное разнообразие видов прикрепленных бактерий в отличие от свободноживущих (Acinas et al., 1999).
Анализ генетического разнообразия общей фракции и фракций активных и культивируемых бактерий Средиземного побережья выявил различие
Методика отбора и обработки проб воды для анализа видового состава бактериопланктона
Отбор проб воды для идентификации и анализа сезонной динамики видового состава бактериопланктона проводили в декабре 1999 г. однократно. В 2000 г. - ежемесячно с июня по октябрь на п. Бугач и п. Лесной, и с мая по сентябрь 2001 г. на п. Бугач. Пробы воды отбирали батометром на открытой части в центре водоемов в виде интегральной пробы с горизонтов 0-1-2-3 м (п. Лесной) и 0-1-2 м (п. Бугач). В декабре 1999 г. пробы были взяты с поверхностного горизонта из-подо льда. Пробы воды отбирали в тщательно вымытые и ополоснутые стерильной дистиллированной водой полиэтиленовые флаконы. Объем проб составлял 0.5-2 л. Обработку проб и концентрирование бактериопланктона проводили не позднее 3 ч после отбора.
Здесь и далее все растворы, использованные в работе, были приготовлены на деионизованной воде высокой степени очистки (за исключением питательных сред, приготовленных на дистиллированной воде) из реагентов марки х.ч. или о.с.ч. Для стерилизации применяли автоклавирование или фильтрование через стерильные шприцевые фильтры 0.22 мкм. Фильтрационную воронку стерилизовали фламбированием, металлические инструменты - в пламени спиртовки, стеклянную посуду - прокаливанием при 200С, пластиковые микропробирки, наконечники для автоматических пипеток и мембранные фильтры - автоклавированием, органические растворители (этанол, хлороформ и т.д.) очищены перегонкой.
Предварительно пробы воды фильтровали через мембранные фильтры с диаметром пор 2.5 мкм для удаления цианопрокариот, биомасса которых во многие даты отбора значительно превышала биомассу нефотосинтезирующе-го бактериопланктона. Бактериопланктон собирали фильтрованием на мембранные фильтры с размером пор 0.2 мкм, затем фильтры помещали в стерильные пробирки. Бактерии смывали с фильтров 2 мл стерильного STE буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 7.6, 100 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА), осаждали 10 мин центрифугированием при 14 тыс. об/мин, надосадочную жидкость удаляли, осадки хранили при -70С до выделения ДНК.
Общую численность бактерий в пробах после предварительной фильтрации оценивали ка описано в разделе 2.2.1; Хромосомную ДНК из проб бактериопланктона п. Бугач и п. Лесной, отобранных в декабре 1999 г., выделяли с помощью набора для выделения ДНК QIAamp Blood and Tissue kit (Qiagen, Германия). Выделение проводили по рекомендованному производителем протоколу, который включал обработку суспензии клеток лизирующим буфером, содержащим протеиназу К, сорбцию ДНК на пористом стеклянном носителе, отмывку и элюцию в 50 мкл стерильного ТЕ буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 8.5, 0.1 мМ ЭДТА). В дальнейшем геномную ДНК выделяли с использованием лизиса клеток хао-тропным реагентом с последующей сорбцией ДНК на стеклянном сорбенте (Vogelstein, Gillespie, 1979). Для этого клеточные осадки размораживали и ресуспендировали в 100 мкл STE буфера, добавляли 300 мкл лизирующего раствора (5 М гуанидин изотиоцианат, 20 мМ ЭДТА, рН 8.0, 0.1 М Р-меркаптоэтанол), 10 мкл 50% водной суспензии БіОг (Sigma, США), тщательно перемешивали и инкубировали 15 мин при комнатной температуре с периодическим перемешиванием. Пробы центрифугировали на микроцентрифуге 1 мин при 5000 об/мин, надосадочную жидкость отбирали водоструйным насосом, осадок однократно промывали раствором (5 М гуанидин изотиоцианат, 100 мМ ЭДТА, рН 8.0) - ресуспендировали в 150 мкл раствора, вновь центрифугировали и тщательно удаляли супернатант. Затем осадок трижды промывали от лизирующего раствора 700 мкл STE/EtOH буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 7.0, 1 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 75% этанол), подсушивали водоструйным насосом. В пробирки добавляли 50 мкл стерильного ТЕ буфера, ресуспендировали сорбент и элюировали ДНК 5 минутным прогреванием при 55С. Пробы центрифугировали 2 мин при 14000 об/мин, водную фазу переносили в чистые пробирки, не захватывая осадок сорбента. Качество и количество выделенной высокомолекулярной ДНК проверяли горизонтальным электрофорезом в 1% агарозном геле в однократном ТАЕ буфере (40 мМ
Суммарная ДНК, выделенная из проб бактериопланктона, отобранных из п. Бугач и п. Лесной в декабре 1999 г., была использована для создания библиотек генов 16S рибосомальной РНК. Фрагменты исследуемых генов размером 894 п.н. были амплифицированы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). В реакции использовали универсальные праймеры, комплементарные консервативным участкам гена 16S рРНК эубактерий: прямой 514F (5 -CG TGC CAG CAG CCG CGG ТАА-30 и обратный 1407R (5 -G ACG GGC GGT GTG ТАС AAG-3 )- Здесь и далее названия праймеров обозначают соответствие 5 -конца праймера нумерации нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК Escherichia coll. Амплифицированные с помощью данной пары праймеров продукты полимеразной цепной реакции находятся в том же количественном соотношении, в котором находилась смесь геномной ДНК, выделенной из смешанной культуры бактерий (Suzuki, Giovannoni, 1996). Суммарную ДНК бактериопланктона в объеме 1-2 мкл использовали в качестве матрицы для амплификации в 30 мкл реакционной смеси, содержащей 20 мМ Трис-HCl, рН 8.8 при 25С, 10 мМ КС1, 10 мМ (NH4)2S04, 2 мМ MgSC 4, 0.1% Тритон Х-100, 0.2 мМ каждого dNTP, по 10 пмолей каждого праймера, 0.1 ед. акт. Vent ДНК полимеразы (СибЭнзим, Новосибирск). Vent ДНК полимераза имеет более высокую точность синтеза по сравнению с обычной Taq полимеразой, так как обладает 3 -5 экзонуклеазной активностью. Поскольку для амплификации использовали универсальные бактериальные праймеры, чтобы избежать контаминации ПЦР экзогенной бактериальной ДНК, все манипуляции проводили в стерильном ламинарном боксе, обработанном бактерицидным ультрафиолетом, использовали только серти фицированные для ПЦР пробирки и наконечники для автоматических пипеток. Для контроля контаминации всегда ставили отрицательную контрольную реакцию, в которую в качестве матрицы добавляли стерильную воду (Niederhauser et al., 1994). Реакцию проводили на приборе Biometra TPersonal (Biometra, Германия) в следующем температурно-временном режиме: первый цикл - денатурация при 94С, 3 мин; отжиг праймеров при 50С, 1 мин; удлинение цепи при 75С, 1 мин; 5 циклов - 94С, 30 с; 50С, 40 с; 75С, 40 с; 6 циклов - 94С, 30 с; 52С, 40 с; 75С, 40 с; 9 циклов - 94С, 30 с; 54С, 40 с; 75С, 40 с; 9 циклов - 94С, 30 с; 56С, 40 с; 75С, 40 с и окончательная полимеризация 75С, 6 мин. Данный режим постепенного повышения температуры отжига праймеров призван обеспечивать наибольшее «представительство» разнообразных последовательностей, различающихся по нуклеотидно-му составу и сродству к ним выбранных праймеров (Денисова и др., 1999). Поскольку Vent полимераза синтезирует ПЦР-продукты с тупыми концами, для их последующего клонирования в Т-вектор необходимо было достроить «липкие» З -А-концы с помощью Taq ДНК полимеразы. Для этого по окончании реакции в пробирки добавляли по 1 ед. акт. Taq ДНК полимеразы и 1 мкл 0.2 мМ dATP и проводили 10 минутную инкубацию при 72С. После инкубирования немедленно проводили депротеинизацию равным объемом смеси фенол:хлороформ (1:1) и переосаждали ДНК, добавляя к водной фазе 1/10 объема 3 М ацетата натрия (рН 5.2) и 2.5 объема 96% этанола (Sambrook et al., 1989). Размер, количество и чистоту ПЦР-продуктов проверяли электрофорезом в 1.2% агарозном геле. После окрашивания геля бромистым этидием полосы искомого размера вырезали из геля под длинноволновым УФ и выделяли ДНК по методу "glass milk" (Смирнова, Солдатов, 2003). Полоски геля взвешивали и добавляли 4-кратный объем (мкл/мг геля) 6 М KJ, инкубировали пробирки при 50С до полного растворения агарозы, добавляли объем изопропанола, равный объему геля, и 5 мкл 50% суспензии Si02. Смесь инкубировали при 55С при постоянном помешивании, центрифугировали 5 с, супернатант сбрасывали, осадок сорбента промывали последовательно 100 мкл 6М KJ, затем 3-кратно STE/EtOH буфером. ДНК элюировали 10 мкл стерильного ТЕ буфера.
Для клонирования ПЦР-продуктов готовили Т-вектор (Смирнова, Сол-датов, 2002). Для этого плазмиду pBluescript II (Stratagene, США) обрабатывали рестриктазой EcoR V (СибЭнзим, Новосибирск), достраивали «липкие» З -Т-концы двухчасовым инкубированием при 72С с Taq ДНК полимеразой и dTTP. Полученный Т-вектор очищали препаративным электрофорезом в 0.8% агарозном геле и выделяли из геля как описано выше.
Фрагменты гена 16S рРНК бактерий и Т-вектор лигировали высокоактивной Т4 ДНК лигазой (СибЭнзим, Новосибирск) при 16С. Лигазной смесью трансформировали клетки Е. coli XL-l Blue (Stratagene, США). Компетентные клетки Е. coli готовили стандартным методом, используя TFB буфер, как описано в (Sambrook et al., 1989). Клеточную суспензию высевали на 1.5% LB-arap, содержащий 100 мкг/мл ампициллина, 80 мкг/мл X-Gal и 80 мкг/мл ИПТГ. Отбор клонов, содержащих вставку, проводили методом «бело-голубого» скрининга (Sambrook et al., 1989). Белые колонии переносили в микропробирки, содержащие 20 мкл 10 мМ Трис-HCl, рН 8.0, подвергали 2-кратному замораживанию-оттаиванию. Для анализа размера вставок проводили ПЦР с 2 мкл суспензии клеток в качестве матрицы, используя прайме-ры, комплементарные участкам плазмиды в районе вставки (M13-Up 5 -ССТ TTG TCG ATA CTG GTA-3 , M13-Down 5 -GTT GTA AAA CGA CGG CCA GTG A-3 ). Условия реакции: первый цикл - 94С, 2 мин; 60С, 1 мин; 72С, 1 мин; 29 циклов - 94С, 30 с; 60С, 40 с; 72С, 40 с и окончательная полимеризация 72С, 5 мин. Полученные продукты реакции анализировали электрофорезом в 1.2% агарозном геле. После окрашивания геля бромистым этидием полосы искомого размера (1124 п.н.) вырезали из геля под длинноволновым УФ и выделяли ДНК как описано выше.
Схема постановки и проведения эксперимента по изучению субстратов некультивируемого бактериопланктона пруда Бугач
Для выявления специфических групп некультивируемого бактериопланктона, использующих в качестве субстрата биодеградируемые полимеры гидроксиалканоатов, был проведен следующий эксперимент.
Эксперимент закладывали 5.09.2000 г. В качестве субстрата использовали пленки, полученные по методу "solvent-evaporation" из сополимера 0-оксимасляной и р-оксивалериановой кислот в лаборатории Хемоавтотрофно-го биосинтеза ИБФ СО РАН. Пленки предварительно взвешивали на аналитических весах и равномерно распределяли (нанизывали на нить с грузом) внутри тщательно вымытой и ополоснутой стерильной дистиллированной водой двухлитровой прозрачной пластиковой бутыли. Бутыль заполняли водой пруда Бугач, зачерпнутой с поверхности в 0.5 м от берега, закрывали отверстие планктонным газом №72 с ячеей 80 мкм, и помещали бутыль в пруд на глубину 0.5 м от поверхности. Для контроля рядом помещали бутыль, обработанную так же, как опытную, но не содержащую пленок полимера. Эксперимент продолжался в течение 42 суток, до 17.10.2000 г. Воду из контрольной и опытной бутылей обрабатывали по приведенной выше методике (раздел 2.2.2). Пленки полимера в стерильных условиях переносили в колбу со стерильной дистиллированной водой, интенсивно встряхивали в течение нескольких минут. Полученную суспензию бактериальных клеток, смытых с поверхности пленок, обрабатывали так же, как воду из экспериментальных бутылей. Пленки полимера высушивали при 50С до постоянной массы и взвешивали на аналитических весах. Концентрирование бактериопланктона, выделение ДНК, анализ проб методом ДГТЭ, определение нуклеотидных последовательностей Дії Э-полос проводили как описано выше.
Нуклеотидные последовательности фрагментов гена 16S рРНК сравнивали с последовательностями баз данных Интернета GenBank и EMBL с помощью программы BLAST (Altschul et al., 1997). Для сравнительного анализа нуклеотидные последовательности были выровнены с гомологичными последовательностями генов 16S рРНК из баз данных с помощью программы ClustalW (Higgins et al., 1994). Эволюционные расстояния оценивали с помощью однопараметрической модели Jukes & Cantor (1969), разрывы последовательностей в анализе не учитывали. Построение филогенетических деревьев, основанных на сравнении генов 16S рРНК, производили с помощью neighbor-joining метода, реализованного в пакете программ TREECON (Van de Peer, de Wachter, 1994).
Корреляционный анализ проводили стандартными статистическими методами (Плохинский, 1978) с использованием программного пакета Microsoft Excel с оригинальными макросами. Во внимание принимались только сильные ( г 0.50) и статистически достоверные корреляционные связи.
Кластерный анализ результатов ДГТЭ выполняли методом одного звена с построением кратчайшего остовного дерева (Джефферс, 1981) по оригинальной программе, разработанной д.б.н. М.И. Гладышевым (ИБФ СО РАН).
Рис. 3. Динамика температуры, рН, содержания растворенного кислорода, ХПК, содержания минерального фосфора, аммонийного (1) и нитратного (2) азота в пруду Бугач в 1997-1999 гг. Жирной линией отмечены температура, рН, содержание растворенного кислорода придонного слоя воды, тонкой - поверхностного
В целом за период исследований с 1997 по 1999 гг. динамика была сходной по всем параметрам. Значения рН во все годы были щелочными, 7.9-9.5. Содержание растворенного в воде кислорода в поверхностном слое было на уровне насыщения. Динамику ХПК в 1998 г. оценить затруднительно, т. к. было проведено всего 7 измерений. В течение всех трех лет максимальное значение содержания Рми„ отмечалось в августе - сентябре, NH4+-N -в начале июня с тенденцией снижения к сентябрю, концентрация NCV-N увеличивалась в течение сезона.
Концентрация Хл и величина ВПП в течение полевого сезона имели несколько пиков (рис. 5): весенний (1999 г.), связанный с развитием диатомовых водорослей, и 2-3 летне-осенних пика (1997-1999 гг.), вызванных цветением цианопрокариот An. flos-aquae, Aph. flos-
Отмечена прямая корреляция с температурой в 1997 г. и отрицательная прямая корреляция с ХПК в 1999 г. (табл. 3). Корреляционные связи с временным сдвигом, когда фактор среды изменялся после изменения численности бактерий, отмечены с прозрачностью, содержанием NH4+-N и N03"-N, Ог в 1998 г. (табл. 2) и NCb -N в 1999 г. Зарегистрирована корреляция ОЧБ с рН придонного слоя, Рми„, Ог, ХПК в 1998 г. и температурой, общим азотом (No6m) и NH4+-N, 02 и ХПК в 1999 г. Обнаружена прямая корреляция с ДП в 1998 г. и отрицательная с биомассой фитопланктона в 1999 г. Отмечены достоверные коэффициенты корреляции при временных сдвигах между бактери-опланктоном и величинами биомассы фитопланктона и цианопрокариот в 1998 г., диатомовых водорослей, цианопрокариот, босмин, коловраток и ВПП в 1999 г., что, вероятно, указывает на возможное влияние данных факторов на последующее изменение численности бактериопланктона. Однако ни одна из корреляций не повторялась из года в год. Также не было корреляций между указанными или другими компонентами экосистемы на объединенных двух-трехлетних массивах данных.
Динамика численности сапрофитных бактерий в 1998 и 1999 гг. различалась (рис. 4). В 1998 г. была зафиксирована прямая корреляция численности СБ с биомассой коловраток и копеподитов циклопов (табл. 2). Июльский пик (7.07) в развитии СБ совпадал с локальными максимумами в динамике биомассы фитопланктона, цианопрокариот и зеленых водорослей, зоопланктона, дафний и ВПП, температуры и 02 поверхностного слоя воды. В 1999 г. отмечена прямая положительная корреляция СБ с биомассой коловраток и прямая отрицательная корреляция с биомассой зоопланктона, дафнии, копеподитов и науплий циклопов, биомассой циклопов и ВПП (табл. 3), период максимального развития СБ совпал с минимальным значением содержания Робщ и максимальным - N03_-N. В 1998 г. (табл. 2) зарегистрировано изменение численности СБ, следующее за такими показателями как биомасса диа томовых водорослей со сдвигом в 1 неделю, N03 -N И No6u, и 02 со сдвигом в 2 недели, в 1999 г. со сдвигом в 1 неделю - за РобЩ, Н щ, Ог у поверхности и биомассой зоопланктона, науплий и копеподитов циклопов, в 2 недели - Робщ, температурой и рН у дна. Корреляционные связи со временным сдвигом, когда фактор среды изменялся после изменения численности СБ, отмечены в 1998 г. с биомассой дафнии, в 1999 г. - со значениями рН, концентрацией NH/-N, Рмин, Ог у дна и биомассой фитопланктона, зооплактона, коловраток, циклопов и науплий. Так же, как и в случае ОЧБ, эти корреляции не повторя лись из года в год. Исключение составляет прямая положительная корреля ция с биомассой коловраток, которая проявилась в 1998 и 1999 гг. Динамика численности БГКП в оба года была одинаковой, с абсолютными максимумами в конце июня (рис. 4). Кроме однолетних корреляций с температурой, прозрачностью, рН у поверхности воды с временным сдвигом в 1998 г. и Noem и NH4+-N в 1999 г., обнаружена корреляция между БГКП и различными группами зоопланктона, сохранявшаяся в течение двух лет (табл. 2, табл. 3). Таким образом, исследования экосистемы пруда Бугач за период 1997 1999 гг. показали, что динамика общей численности и биомассы бактерио планктона рекреационного пруда имела закономерный сезонный характер с наличием весенне-летних и летних пиков в течение вегетационных периодов 1997-1999 гг? Максимальное развитие бактериопланктона наблюдалось еже годно в период доминирования копеподного зоопланктона (июнь-июль), для которого характерен хищный; тип питания. Вероятно, при этом бактерио планктон не испытывал пресса консументов. Зафиксированный период не больших флуктуации численности бактерий при ее относительно низком среднем значении совпадал с периодом доминирования дафниевого зоо планктона (август), который представлен тонкими фильтраторами, способ ными потреблять бактериопланктон (рис. 4 и 5).
