Содержание к диссертации
Введение
Глава 2. Обзор литературы 9
2.1 Загрязнение окружающей среды и биомаркеры , 9
2.1.1 Экотоксикология и биомаркеры. Основные понятия и термины 9
2.1.2 Специфические и неспецифические биомаркеры 10
2.1.3 Двустворчатые моллюски - идеальные о бъекты биомониторинга 13
2.1.4 Разновидности неспецифических биомаркеров и их применимость в полевых условиях для экологического мониторинга 16
2.1.5 Импульсное и хроническое загрязнение. Содержание АТФ в гемоцитах, концентрация гемоцитов в гемолимфе и гистопатологии - как биомаркеры
острого стресса 25
2.2 Район и объекты исследований 29
2.2.1 Антропогенное загрязнение Черного моря 29
2.2.2 Динамика прибрежных макрозообентосных сообществ Северо-кавказского побережья Черного моря 32
2.2.3 Объекты исследований 33
ГЛАВА 3. Материал и методика 35
3.1 Экспериментальные исследования 35
3.1.1 Исследования последствий хронического загрязнения для моллюсков 38
3.1.2 Исследования влияния импульсного загрязнения на моллюсков 40
3.1.2.1 Предварительный эксперимент. Определение сублетальных концентраций загрязняющих веществ для черноморских двустворчатых моллюсков Anadara cf. inaequivalvis, Mytilus galloprovincialis и Chamelea gallina 40
2.1.2.1 Иследование боимаркерных параметров двустворчатых моллюсков Anadara cf. inaequivalvis, Mytilus galloprovincialis и Chamelea gallina при экспериментальном импульсном загрязнении 41
3.2 Оценка фоновых значений биомаркерных параметров двустворчатых моллюсков из разных районов Северо-Кавказского побережья Черного моря 41
3.3 Методики анализов 42
ГЛАВА 4. Основная часть работы 47
4.1. Эффекты хронических загрязнений на двустворчатых моллюсков 47
4.1.1 Chamelea gallina 47
4.1.2 Anadara cf. inaequivalvis 49
4.2. Эффекты импульсных загрязнений ha Anadara cf. inaequivalvis, Mytilus galloprovincialis и Chamelea gallina 54
4.2.1 Определение сублетальньгх концентраций загрязняющих веществ для черноморских двустворчатых моллюсков 54
4.2.2 Исследование боимаркерных параметров двустворчатых моллюсков Anadara cf. inaequivalvis, Mytilus galloprovincialis и Chamelea gallina при экспериментальном импульсном загрязнении 55
4.3. Биомаркеры импульсного и хронического загрязнения 62
4.4 Фоновые значения биомаркерных параметров двустворчатых моллюсков из разных районов северокавказского побережья черного моря в 2003-2007 гг 75
4.2.1 Содержание загрязняющих веществ в мягких тканях моллюсков 75
4.4.1 Гистопатологии 76
4.4.2 Содержание АТФ в гемоцитах и концентрация гемоцитов в гемолимфе моллюсков 81
4.4.3 Динамика биомаркерных параметров Anadara cf. inaequivalvis и популяционная динамика Л. cf. inaequivalvis и Rapana venosa 83
4.5 Последствия разлива мазута в керченском проливе 86
Глава 5. Заключение 92
Глава 6. Выводы 93
Благодарности 94
Список использованной литературы
- Специфические и неспецифические биомаркеры
- Исследования влияния импульсного загрязнения на моллюсков
- Эффекты импульсных загрязнений ha Anadara cf. inaequivalvis, Mytilus galloprovincialis и Chamelea gallina
- Содержание АТФ в гемоцитах и концентрация гемоцитов в гемолимфе моллюсков
Введение к работе
Актуальность темы Интенсивное антропогенное загрязнение прибрежных морских акваторий остается одной из важных проблем современности. В результате человеческой деятельности в океаны и моря поступает огромное число загрязняющих веществ, включая ксенобиотики. По времени воздействия и концентрации веществ загрязнение можно разделить на хроническое и импульсное. Хроническое загрязнение характеризуется наличием постоянного источника загрязнения (канализационные стоки городов, загрязнение нефтепродуктами вблизи крупных портов и пр.). Импульсное или залповое загрязнение - это одномоментный выброс высоких концентраций загрязняющих веществ, при этом облако загрязнителя может сравнительно быстро рассеиваться в толще вод.
Традиционно используемые при оценке качества водной среды величины предельно допустимых концентраций (ПДК) не позволяют ни предсказать эффекты всех возможных комбинаций поллютантов на биоту, ни выявить последствия импульсных воздействий. Они предназначены для предотвращения и контроля неблагоприятных последствий загрязнения на окружающую среду (Филенко, 2007). Методики биотестирования с использованием культур ракообразных и микроводорослей, которые используют при анализе токсичности водной среды, не применимы для морских экосистем с высокой гидродинамической активностью, когда изменения концентрации поллютантов вблизи источника загрязнения могут происходить за часы (Отчет по ФЦП «Мировой океан»..., 2004). Кроме того, эти методы ориентированы на быструю оценку токсичности среды (Филенко, 2007), но не позволяют предсказать возможные эффекты антропогенного загрязнения на экологические характеристики водных экосистем. Множество комбинаций синергических, антагонистических и маскирующих эффектов антропогенных факторов (Magaud et al., 1997), а также необходимость соотнесения этих эффектов с изменениями в реальных сообществах, выдвигают на первый план проблему методов интегральной оценки их влияния на водные организмы (Руднева и др., 2004).
Традиционным методом оценки состояния морских экосистем является биоиндикация (bioindication) - метод определения качества среды обитания по видовому составу и структуре сообществ, а также по показателям количественного развития видов-биоиндикаторов. Наиболее консервативными и пригодными для биомониторинга являются бентосные организмы. Однако для водоемов с нестабильной экологической обстановкой использование этого метода оказывается затруднительным. Так, в последние годы на Северо-Кавказском побережье Черного моря наблюдаются значительные изменения в структуре прибрежных экосистем. В результате инвазии аллохтонных видов и бенто-планктонных взаимодействий наблюдаются значительные колебания численности и биомассы донных организмов (Кучерук и др., 2002; Chikina, Kucheruk, 2003) На этом фоне значительно сложнее выявить появление и динамику видов-биоиндикаторов, а также однозначно связать изменения в структуре сообществ с загрязнением. Кроме того, виды-биоиндикаторы развиваются в экосистемах в основном при хроническом загрязнении. Однако возможность залпового загрязнения прибрежных акваторий с интенсивными морским транспортом и слабо контролируемыми бытовыми стоками остается важной проблемой и сравнительно слабо изученной областью. Поэтому рациональным и целесообразным представляется использование подходов, основанных на принципе биомаркирования, позволяющих получить интегральную оценку физиологического состояния животных на основе измерения нескольких ключевых параметров. Главное преимущество этого метода - в возможности использования неспецифических биомаркеров, отражающих общее изменение физиологического состояния организма в ответ на воздействия разной природы.
Наиболее доступными и удобными объектами биомаркерных исследований в прибрежных донных экосистемах Северо-Кавказского побережья Черного моря являются двустворчатые моллюски-фильтраторы - доминанты местных донных сообществ. Они характеризуются крупными размерами и высокой численностью, легкодоступны для отбора, что позволяет использовать их как для химического анализа загрязнений, так и для изучения биологических реакций на поллютанты.
Целью настоящей работы является выявление неспецифических физиологических и гистологических биомаркеров в организме двустворчатых моллюсков, отражающих уровень антропогенной нагрузки на прибрежные экосистемы Северо-Кавказского побережья Черного моря и позволяющих разделять хроническое и импульсное воздействие загрязняющих веществ.
Для достижения цели нами были поставлены следующие задачи:
1. Найти неспецифические биомаркеры при экспериментальном импульсном и хроническом воздействиях сублетальных концентраций тяжелых металлов и нефтепродуктов на черноморских двустворчатых моллюсков (Chamelea gallina, Anadara cf. inaequivalvis и Mytilus galloprovincialis).
2. Оценить возможности использования физиологических и гистологических параметров для разделения эффектов импульсного и хронического воздействий.
3. Оценить фоновые значения биомаркерных параметров: содержание АТФ, концентрацию гемоцитов в гемолимфе, уровень гистопатологий двустворчатых моллюсков из разных районов СевероКавказского побережья Черного моря.
Научная новизна. В экспериментальных условиях получены новые данные по: 1) содержанию АТФ в гемоцитах трех видов черноморских двустворчатых моллюсков (Anadara cf. inaequivalvis, Mytilus galloprovincialis, Chamelea gallina), 2) соотношению клеточных типов в гемолимфе, 3) концентрации гемоцитов и 4) гистопатологиям в условиях импульсного и хронического загрязнения среды обитания.
Впервые был выполнен анализ содержания АТФ в гемоцитах, концентрации гемоцитов и гистопатологиям трех видов двустворчатых моллюсков (Anadara cf. inaequivalvis, Mytilus galloprovincialis, Chamelea gallina) Северо-Кавказского побережья Черного моря.
Разработан метод идентификации импульсных и хронических стрессовых воздействий на двустворчатого моллюска Anadara cf.
inaequivalvis, играющего важную роль в структуре прибрежных донных сообществ Северо-Кавказского побережья Черного моря.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты подтверждают применимость метода гистологического анализа для разделения эффектов импульсного и хронического воздействий загрязняющих веществ на двустворчатых моллюсков. Единообразная реакция животных на действие загрязняющих веществ указывает на неспецифичность и универсальность регистрируемых реакций. Полученные результаты по исследованию параметров гемолимфы Anadara cf.
inaequivalvis указывают на неспецифичность ответа организма на различные типы загрязнителей и специфичность реакции на разное время воздействия и концентрацию загрязнителей. При кратковременных воздействиях высоких концентраций на организм преимущественно происходят принципиально иные процессы, в отличие от хронических воздействий загрязняющих веществ в низких концентрациях.
Эти методы могут быть использованы в рутинном мониторинге для оценки физиологического состояния двустворчатых моллюсков - доминирующих видов большинства прибрежных донных сообществ СевероКавказского побережья Черного моря. Комплексная оценка концентрации гемоцитов в гемолимфе и содержания в них АТФ может применяться в качестве экспресс-метода для выявления и разделения импульсных и хронических воздействий.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на I Международной научной конференции по изучению Черного моря (2006, Стамбул, Турция); на 99-й Международной конференции по аквакультуре (2007, Сан-Антонио, Техас, США); на XXII Международной береговой конференции «Проблемы управления и устойчивого развития прибрежной зоны моря» (2007, Геленджик); на 50-м Ежегодном симпозиуме Научного комитета по изучению океана (2008, Вудсхол, Массачусетс, США) и на коллоквиумах Лаборатории экологии прибрежных донных сообществ Института океанологии им. П.П. Ширшова РАН (2003-2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ (3 статьи и 7 тезисов), 1 статья находится в печати.
Сокращения в тексте. ТМ — тяжелые металлы, НУ - нефтяные углеводороды, ДТ — дизельное топливо, ГЛПП - гранулы липофусциноподобного пигмента. АТФ - аденозинтрифосфат, ДМ - двустворчатые моллюски.
Работа выполнена в Лаборатории экологии прибрежных донных сообществ Учреждения Российской академии наук Института океанологии им. П.П. Ширшова РАН.
Специфические и неспецифические биомаркеры
Загрязняющие вещества по химической природе можно подразделить на несколько классов: нефтепродукты, тяжелые металлы, пестициды, биогенные элементы (в том случае, если их концентрация значительно отличается от фоновой концентрации этих веществ в среде) (Shepherd etal., 1999).
Известно большое количество специфических биомаркеров, которые являются индикаторами появления в среде того или иного загрязнителя, так например, металлотионеины (короткие пептиды, связывающие тяжелые металлы) - маркер тяжелых металлов; появление аддуктов на ДНК - маркер полициклических ароматических углеводородов; белки теплового шока маркеры повышения температуры (Peakall, 1992; Soares and Calow, 1993; Ostander, 1996; Richardson, 1996).
Однако в природе большинство соединений присутствует не в чистом виде, а в составе комплексов или сложных смесей. Так, например, в нефтепродуктах всегда содержатся в виде примесей тяжелые металлы (ICES, 1999). При воздействии комплекса загрязнителей на организм часто наблюдаются синергические и антагонистические эффекты (Barnes, Stanburry, 1948, Cassee et al, 1998, De Zwart, Posthuma, 2005. ). Смесь тяжелых металлов и полициклических ароматических углеводородов оказывает сложный неаддитивный эффект на мейобентосных копепод (Fleeger et al., 2007). При воздействии на копепод смеси ионов ртути и меди происходит 100%-ная гибель животных при меньших концентрациях, чем при воздействии этих элементов по отдельности (Barnes, Stanburry, 1948).
Воздействие загрязнителей также модифицируется воздействием на организм различных биотических и абиотических факторов. Температура, соленость, состав донных осадков, присутствие взвеси в воде, направление течений, пресс хищников и паразитов — все эти факторы могут модифицировать воздействие поллютантов. Например, с повышением солености токсичность тяжелых металлов понижается (Wright, 1995). Присутствие взвеси снижает токсичность тяжелых металлов и нефтепродуктов, которые адсорбируются на поверхности частичек (Hardy et al., 1981, Sunda et al., 1978; Engel, Fowler, 1979; Borchardt 1983; Riisgard et al., 1987, Thomas, Bendell-Young, 1998). Снижение токсичности связано с понижением концентрации действующей на гидробионтов формы загрязняющего вещества (биодоступной формы) (Luoma, 1983; Rainbow, 2007), поскольку биологическое накопление веществ определяется не общим его содержанием в среде, а концентрацией тех его форм, которые легко и быстро усваиваются гидробионтами (Патин, Морозов, 1981). Так, карбонатная система морской воды существенно влияет на формы нахождения, а, следовательно, и биодоступность гидратирующихся и легко сорбирующихся микроэлементов (Патин, 1979). Увеличение солености способствует снижению токсичности кадмия. Так, в соленой воде он присутствует в виде комплексов с ионами хлора, и его биодоступность в такой форме гораздо ниже, чем в виде свободных ионов в пресной воде (Brown et al., 2004). Известно, что, при повышенной температуре и солености плавучесть нефтепродуктов повышается, что может вызывать повторное ресуспендирование осевших на дно тяжелых фракций. При высокой температуре окружающей среды может происходить интенсивное разложение нефтепродуктов бактериями, что приводит к повышению концентрации биогенов и, как следствие, к эвтрофикации и цветению водоема (Востоков, Иванов, 2007).
Механизмы воздействия разных типов смесей загрязнителей на организмы могут быть многообразными и сложными для анализа стандартными экологическими методами (биотестирования). Однако в большинстве случаев сублетальные воздействия приводят к единому результату - стрессовому3 состоянию животных. Для диагностики такого рода стресса используют неспецифические биомаркеры (Sunila, 1987).
Основные принципы, необходимость и проблемы использования неспецифических биомаркеров в экологическом мониторинге были сформулированы уже в 1978 — 1988годах. В 1987 году Сунила писала, что
«Физиологические ответы должны воспроизводить неспецифические (общие) ответы на суммарное воздействие факторов окружающей среды, таким образом, обеспечивая измерение общего вклада изменений окружающей среды, и более специфические ответы на загрязнители на клеточном уровне (Widdows, 1985). В контексте оценки экологических рисков важно найти связь между биомаркерами и экологическими последствиями или степенью экологического ущерба. Изменения должны указывать на ущерб для популяции и ослабление энергетического потока в сообществе, связанное с неблагоприятным или повреждающим эффектом для роста, воспроизведения или выживания организмов и популяции (Widdows et al., 1981; Widdows, 1985). Самая большая проблема в измерениях физиологического состояния - это вариабельность параметров (Ваупе, 1985). В большинстве исследований окружающей среды самое сложное - это установить причинно-следственную связь, из-за того, что на организм одновременно оказывает влияние много различных факторов» (Sunila, 1987, р. 10).
Исследования влияния импульсного загрязнения на моллюсков
В рамках экспедиций «Черное море» (2003-2007) и комплексных исследований последствий катастрофического разлива мазута (Керченский пролив, февраль-март 2008 года) были собраны пробы трех видов двустворчатых моллюсков для анализа их физиологического состояния и содержания в них основных типов загрязнителей: тяжелых металлов (ТМ) и нефтяных углеводородов (НУ).
Всего было проанализировано около 1000 моллюсков с 38 станций (рис. 4). Для анализа концентрации гемоцитов в гемолимфе и АТФ в гемоцитах отбирали по 10 моллюсков со станции, для гистологического анализа - 30 моллюсков со станции, для анализа на содержание ТМ и НУ - 3-10 моллюсков со станции. Для интерпретации полученных данных в районе станции Шепси было проведено исследование динамики популяции Anadara cf. inaequivalvis и его естественного хищника Rapana venosa. В ходе работы была изучена численность и размерный состав двух видов моллюсков.
Исследование клеточного состава гемолимфы и концентрации в ней гемоцитов. Гемолимфу отбирали при помощи стерильных шприцов из паллиального пространства или из синуса мускула-замыкателя, осторожно приоткрыв створки раковины. Подсчет концентрации гемоцитов производили при помощи микроскопа «Olympus» с увеличением 400Х в камере Горяева. Соотношение клеточных типов определяли на мазках гемолимфы, окрашенных красителями Май-Грюнвальда и Гимзы.
Для анализа содержания АТФ в гемолимфе отбирали 50 мкл гемолимфы у каждого моллюска и смешивали отдельно каждую пробу с ДМСО (диметилсульфоксид) в соотношении 1:1, и хранили при температуре -18С до начала анализа. Для определения содержания АТФ в бесклеточной фракции гемолимфы пробу гемолимфы, собранную от 10 моллюсков, общим объемом 500 мкл центрифугировали на центрифуге ОПН-8 при 900 об./мин. При этом клетки оседали на дно пробирки, но их разрушения не происходило. Затем супернатант разводили ДМСО в соотношении 1:1, и хранили при температуре -18С до начала анализа.
Биолюминесцентный анализ концентрации АТФ с использованием светлячковой люциферазы на люминометре RFT20046 (Германия) с пороговой чувствительностью 10"9 моль АТФ/л проводили на Биологическом факультете Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. В основе метода лежит биолюминесцентная реакция, в основе которой лежит катализируемая специфическим ферментом, светлячковой люциферазой, хемилюминесцентная реакция (Дементьева и др., 2001): D-люциферин + АТФ + Mg2+ + Оо = Оксилюциферин + АМФ + ФФ] + С02 + hv
Угарова, Фрунджян, 2003, стр. 7: «Люцифераза светляков -высокоспецифичный фермент по отношению, как к люциферину, так и к АТФ. Интенсивность излучаемого в ходе реакции света (интенсивность биолюминесценции) - пропорциональна скорости образования электронно-возбужденного продукта реакции и, следовательно, пропорциональна концентрации субстрата при условии, что концентрация последнего ниже константы Михаэлиса. Поскольку на каждую молекулу прореагировавшего субстрата (АТФ) образуется от 0,3 до 1,0 кванта света, то чувствительность биолюминесцентных методов определения АТФ на несколько порядков превышает чувствительность других методов определения этого соединения и составляет 10"13 - 10"18 моль в измеряемом растворе. Высокая скорость анализа (время определения 1-2 минуты), воспроизводимость и универсальность выгодно отличает этот метод АТФ-метрии от других и позволяет производить исследования в полевых условиях».
Для гистологического исследования органы моллюсков (для крупных моллюсков с длиной раковины более 3 см) или отделенные от раковины мягкие ткани (для мелких экземпляров - менее 3 см) фиксировали одним из перечисленных ниже фиксаторов (использование различных фиксаторов не сказывалось на получаемой гистологической картине):
Смесь ФСУ (формальдегид 40%: спирт 96: ледяная уксусная кислота в соотношении 9:3:1) - 1,5 - 2 часа с последующей отмывкой в течение 3-х часов в этиловом спирте 96.
Формальдегид, разведенный морской водой до 4% - 2 суток -несколько месяцев, с последующей промывкой проточной водой в течение 2-х суток. Смесь Дэвидсона (глицерин дистиллированный: 40% формальдегид: спирт 96: морская вода в соотношении 1:2:3:3 ) -2 суток при температуре 4 С с последующей отмывкой спиртом 48 на морской воде в течение 2-х часов.
При невозможности немедленного продолжения обработки материал помещали в 70 спирт. Дальнейшую проводку проводили для всех образцов по стандартной гистологической методике (образцы выдерживали последовательно в емкостях, содержащих 96 спирт - 1 час, 100 спирт - 3 часа, хлороформ - 40 минут, смесь хлороформ: гистомикс 1:1 - 16 часов, гистомикс - 3 часа, и заливали в гистомикс в формах). Срезы (5-7 мкм толщиной) получали с использованием салазочного микротома, окрашивали гематоксилином Караччи и эозином и изучали под световым микроскопом «Olympus» при увеличении 400Х-900Х.
Эффекты импульсных загрязнений ha Anadara cf. inaequivalvis, Mytilus galloprovincialis и Chamelea gallina
Смертность моллюсков в экспериментах составила 0%.
Гистопатологии. При остром воздействии дизельного топлива/хлорида кадмия в тканях С. gallina не наблюдалось значительных патологических изменений. У одного из контрольных моллюсков наблюдалась генерализованная неоплазия гемоцитов (состояние похожее на лейкемию). При этом во всех органах и тканях наблюдалось повышенное содержание гемоцитов с крупным гомогенным ядром и ядрышками и высоким ядерно-цитоплазматическим отношением (Рис. 11 б).
У моллюсков, экспонированных в течение 36 часов в 1 мг/л растворе хлорида кадмия с последующей экспозицией в чистой воде в течение 2-х недель в 14% случаев, наблюдалась вакуолизация пищеварительной железы. А у животных, выдержанных 36 часов в воде с добавлением 1 мл/л дизельного топлива, было отмечено повышение содержания ГЛПП в 30% случаев. При воздействии обоих загрязнителей на A. cf. inaequivalvis наблюдалось изменение клеток пищеварительной железы. При 36-часовом экспонировании в среде с поллютантом возрастал процент животных, у которых наблюдалась вакуолизации пищеварительной железы (от 0% в контроле до 90-100% в эксперименте) (Рис. 11 ж).
При продолжительном экспонировании моллюсков в чистой воде восстановление эпителия пищеварительной железы практически не наблюдалось. У небольшого количества моллюсков был отмечен отек жабр, при этом жаберные филаменты изменяли форму (вздувались) и латеральные клетки содержали крупные вакуоли (Рис 11 г). Отек жабр наблюдался в 30 % случаев у моллюсков, экспонированных в течение 36 часов с дизельным топливом и в 25% случаев - на 14 сутки после экспонирования в среде с хлоридом кадмия. Процент животных с отеком жабр снижался до контрольных значений к концу эксперимента. Гемоцитоз - повышение содержания гемоцитов в соединительной ткани, особенно вокруг протоков пищеварительной системы (Рис. 11 з), наблюдался при действии обоих загрязнителей, и достигал максимальных значений 75 % при содержании моллюсков в течение 2-х недель в чистой воде после импульсного загрязнения дизельным топливом и 20% - непосредственно после выдерживании моллюсков в среде с хлоридом кадмия. К концу эксперимента наблюдалось снижение количества гемоцитов в соединительной ткани до контрольных значений. При воздействии обоих поллютантов наблюдались изменения в гонадах (повышалось содержание гемоцитов и коричневых клеток), однако процент животных с такого рода изменениями был максимальным лишь в первую неделю (75% при экспонировании дизельным топливом и 35% - хлоридом кадмия) и снижался до контрольных значений к концу эксперимента (8-9%). Рисунок 11. а-е: гистопатологии жабр моллюсков при импульсном воздействии загрязняющих веществ и в норме. Жабры С. gallina: а - в норме, б- гематопоэтическая неоплазия (контроль); красной стрелкой отмечены трансформированные клетки. Жабры А. cf. inaequivalvis в - в норме, г - при воздействии кадмия; черной стрелкой отмечены расширенные латеральные клетки жаберного эпителия. Жабры М. galloprovincialis д - в норме, е - при воздействии дизельного топлива; зеленой стрелкой отмечено разрастание апикального эпителия жабр. Ж - вакуолизация пищеварительной железы A. cf. inaequivalvis (синей стрелкой обозначены патологические расширенные вакуоли). 3 -гемоцитоз в соединительной ткани A. cf. inaequivalvis (голубой стрелкой обозначены эритроциты). Увеличение 400х - а, з. Увеличение 60х - б-ж. Основные изменения в организме М. galloprovincialis при воздействии загрязнителей были отмечены, как и у других видов, в пограничных эпителиальных пластах (эпителиях жабр и пищеварительного тракта). Вакуолизация пищеварительной железы была отмечена для 100% моллюсков после экспозиции в среде с дизельным топливом и для 30% моллюсков - с хлоридом кадмия. К концу эксперимента происходило восстановление структуры пищеварительной железы. При экспозиции с дизельным топливом в течение 36 часов у 25% моллюсков возникали метапластические нарушения жабр (разрастание фронтальной части жаберного филамента) и увеличение содержания ГЛПП в эпителии жабр (Рис. 11 е).
Содержание гемоцитов в гемолимфе и АТФ в гемоцитах. В гемолимфе С. gallina при наблюдении в камере Горяева мы отметили наличие одной клеточной популяции - амебоцитов, которые в течение нескольких минут после помещения на предметное стекло оседали и принимали амебоидную форму (распластывались на предметном стекле). Концентрация гемоцитов в гемолимфе контрольных особей составляла около 2200 кл./мкл. Общая концентрация гемоцитов в гемолимфе С. gallina при воздействии хлорида кадмия изменялась в течение эксперимента недостоверно. При воздействии дизельного топлива концентрация гемоцитов снижалась в 1,5 раза и восстанавливалась после 2-х недельной экспозиции в чистой воде. При дальнейшей экспозиции содержание гемоцитов в гемолимфе снижалось.
В гемолимфе A. cf. inaequivalvis в течение эксперимента изменялись как суммарное содержание гемоцитов (Рис. 12 а), так и соотношение клеточных типов (Рис. 12 б). У контрольных моллюсков концентрация суммарная гемоцитов в гемолимфе составляла 25880±5830 кл/мкл. При воздействии обоих загрязнителей суммарное содержание гемоцитов возрастало в 2 раза (Рис. 12 а), однако к концу эксперимента наблюдалась тенденция к снижению концентрации гемоцитов в гемолимфе практически до контрольных значений.
Содержание АТФ в гемоцитах и концентрация гемоцитов в гемолимфе моллюсков
В 2003-2007 годах были проведены исследования биомаркерных параметров трех видов двустворчатых моллюсков Северо-Кавказского побережья Черного моря (Табл. 3). Были получены данные по среднему содержанию гемоцитов в гемолимфе и содержанию в них АТФ.
Среднее содержание АТФ было сходным у трех видов моллюсков. Поэтому мы провели анализ корреляций содержания АТФ в гемоцитах и некоторых других наблюдаемых характеристик. При анализе среднего содержания АТФ в моллюсках и нормированного содержания в них ТМ наблюдалась нелинейная зависимость (Рис. 15-а). Содержание АТФ было наиболее высоким у моллюсков, содержащих наименьшие концентрации ТМ.
Корреляция концентрации гемоцитов в гемолимфе и вакуолизации пищеварительной железы у A. cf. inaequivalvis (а). Корреляция содержания АТФ в гемоцитах моллюсков и ГЛПП. Таблица 3. Содержание АТФ и концентрация гемоцитов в гемолимфе двустворчатых моллюсков. Значения параметров, значительно отличающиеся от средних значений (и от значений содержания АТФ в клетках по литературным данным »10"16; de Zwaan, Cortesi, 1993) отмечены цветом. Стрелками ( юозначеж ) нап равление отклонения к( жце нтрации. Название моллюска Год № станции КонцентрацияАТФ,моль/1016клеток Стандартное отклонение Содержаниегемоцитов вгемолимфе,кл/мкл Стандартное отклонение Кол-во особей
Chamelea gallina 2005 2138 3,1833 $,1035 1598 509 2140 2,8002 2.2962 1416 871 2150 2,1030 0.5748 567 2( 2 Геленджикская бухта 3,8757 6,6095 \ 2138 2346 2007 2909 2,2611 0,1023 1708 709 2910 1,0795 0.9091 1970 797 среднее среднее 23974 2.0050 1403 "86 47
Anadara cf. inaequivalvis 2005 2146 - - 20446 365 1 2150 2,3430 0.9464 17470 13874 2157 8,8175 6,4216 13239,, 4919 2006 2480 1,998 0.563 1 29674 5007 2487 3,9325 0.7144 34116 1 2108 Ноябрь (Шепси) 0,3799 t 0.42289 10472,, 6822 2007 2933 0,7536j, 1.0468 33280 17844 2008 1 0,01881 J,J, 0.01201 41235 21901 10 0,33481 0.3284 32484 17270 10 0,8738 г 0.8210 53968 \ 18708 8 0,3650, 0.2711 20429 10784 среднее среднее 438 3.44 28246 1 1700 50
Mytilus galloprovincialis 2005 Геленджикскаябухта 0,1044, г 0.()768 746 519 Голубая бухта 1,6812 2.1614 7859 f 3207 2007 Голубая бухта 169,34 " Л- 227.50 424 143 среднее среднее 6,1756 6.1021 1135 730 При анализе средней концентрации гемоцитов в гемолимфе A. cf. inaequivalvis и количества моллюсков с вакуолизацией пищеварительной железы наблюдалась положительная зависимость (р 0,05) (Рис. 17 а). Это подтверждает данные наших экспериментов по импульсному воздействию загрязняющих веществ на моллюсков, когда у A. cf. inaequivalvis повышалось содержание гемоцитов в гемолимфе, и одновременно наблюдалась патологическая вакуолизация пищеварительной железы. Содержание АТФ в гемоцитах моллюсков коррелировало с увеличением в эпителии пищеварительной железы ГЛПП, что также согласуется с результатами наших экспериментов: при хроническом загрязнении у моллюсков наблюдалось как понижение содержания АТФ, так и повышение ГЛПП в эпителии пищеварительной железы.
Динамика биомаркерных параметров Anadara cf. inaequivalvis и популяционная динамика A. cf. inaequivalvis и Rapana venosa
Для района пос. Шепси была прослежена динамика биомаркерных параметров A. cf. inaequivalvis, а также популяционная динамика A. cf. inaequivalvis и Rapana venosa. Известно, что R. venosa - мигрирующий хищник, который питается двустворчатыми моллюсками, в частности, и видом A. cf. inaequivalvis. В конце 1990-х годов на глубинах 5-30 м на участке шельфа от Геленджика до Адлера произошло практически полное исчезновение популяций двустворчатых моллюсков, связанное с массовым размножением R. venosa, а также выеданием личинок двустворчатых моллюсков гребневиком Mnemiopsis leidyi. Ранее в этом диапазоне глубин находилось сообщество с доминированием Chamelea gallina (Кучерук и др., 2002). Появление в 1999 году нового вселенца гребневика Beroe ovata, питающегося М. leidyi привело к значительному оседанию двустворчатых моллюсков (Кучерук и др., 2002). Однако на глубинах 20-30 м, где было отмечено заиление и повышенное содержание органического углерода, преимущество получил вселенец A. cf. inaequivalvis (Чикина и др., 2003; Chikina, Kucheruk, 2005). A. cf. inaequivalvis способна дольше переживать неблагоприятные условия по сравнению с другими двустворчатыми моллюсками (С. gallina и М. galloprovincialis), благодаря присутствию гемоглобина в ее эритроцитах (de Zwaan et al., 2001).
Таким образом, значительные колебания численности и биомассы донных организмов на Северо-Кавказском побережье в настоящее время связывают с биотическими взаимодействиями между аллохтонными и автохтонными видами (Chikina, Kucheruk, 2005). При этом масштабы перестройки прибрежных донных сообществ, происходящие в южной части Северо-Кавказского побережья (на участке шельфа от Геленджика до Адлера) таковы, что выявить на их фоне локальные антропогенные воздействия стандартными экологическими методами практически невозможно. Использование биомаркерного подхода позволяет выявить последствия таких воздействий.
