Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 10
1.1. Состояние и перспективы молочного козоводства в России и мире 10
1.2. Полиморфизм белков молока 13
1.2.1. Полиморфные системы белков молока коз 15
1.2.2. Влияние полиморфизма белков молока коз на его физико-химические показатели и технологические свойства 21
1.3. Полиморфизм гена бета-лактоглобулина коз 25
1.3.1. Бета-лактоглобулин как фракция молочного белка 25
1.3.2. Полиморфизм гена бета-лактоглобулина коз разных пород 29
1.3.3. Молочная продуктивность и технологические свойства молока коз с различными генотипами по бета-лактоглобулину 32
II. Материал и методика исследований 34
2.1. Характеристика хозяйства 34
2.2. Методика проведения исследований 36
III. Результаты собственных исследований 44
3.1. Молекулярно-генетический анализ полиморфизма гена BLG молочных коз зааненской, альпийской и нубийской пород 44
3.2. Молочная продуктивность коз разных пород и генотипов по гену BLG 49
3.3. Состав и свойства молока коз разных пород и генотипов по гену BLG 51
3.3.1. Физико-химические показатели молока 52
3.3.2. Технологические свойства молока 60
3.3.3. Качественный и количественный состав белков молока 64
3.3.4. Аминокислотный состав молока 70
3.3.5. Характеристика жировой фазы молока 72
3.3.6. Витаминный состав молока 75
3.3.7. Минеральный состав молока 78
3.3.8. Термоустойчивость молока 82
3.4. Качество йогурта из молока коз разных пород и генотипов по гену BLG 85
3.5. Качество и состав творога из молока коз разных пород и генотипов по гену BLG 90
3.6. Эффективность производственного использования коз разных пород и
генотипов по гену BLG 95
Выводы 99
Практические предложения 101
Список использованной литературы
- Полиморфизм белков молока
- Полиморфизм гена бета-лактоглобулина коз
- Молочная продуктивность коз разных пород и генотипов по гену BLG
- Качество йогурта из молока коз разных пород и генотипов по гену BLG
Введение к работе
Актуальность темы. Развитие современного животноводства требует внедрения новых биотехнологических методов оценки признаков продуктивности сельскохозяйственных животных, базирующихся непосредственно на анализе наследственной информации [Эрнст Л..К и др., 2008, ElinHallen, 2008, Ng-Kwai HangKF., 1998]. В этой связи разработка и внедрение в практическое животноводство ДНК-диагностики является актуальной задачей сельского хозяйства.
В настоящее время многие исследования направлены на идентификацию генов, связанных с хозяйственно-полезными признаками животных, что представляет экономический интерес [Эрнст Л.К,Зиновьева НА., 2008, ИолчиевБ.С, 2006, AjayKumaru др., 2006, El-HanafyAA., 2010]. В связи с возрастающими требованиями к качеству молока и молочной продукции, возникает необходимость использования в селекции животных генетических маркеров, связанных с признаками молочной продуктивности и качеством молока-сырья.
В питании населения разных стран наряду с коровьем молоком используют молоко других видов животных - кобылиц, коз, овец, буйволиц и др. Увеличивающийся в последнее время спрос на козье молоко позволяет считать развитие молочного козоводства в нашей стране перспективным производством, особенно вблизи густонаселенных мегаполисов [Бодров А., 2009, Харитонова Д., 2010]. Козье молоко является высококачественным сырьем для получения питьевого молока, кисломолочных продуктов, творога и различных видов сыров. Селекционная работа в молочном козоводстве в основном направлена на улучшение показателей молочной продуктивности животных. В отличие от молочного скотоводства, полиморфизму белков молока коз не уделяется должного внимания, в то время, как состав молока является основой для его целенаправленной переработки. Многочисленные научные работы доказывают тесную связь между полиморфизмом белков молока и его технологическими свойствами [Chiattil F. идр, 2005, Park Y.W.udp, 2007, DonataMarietta и др., 2007].
Наиболее распространёнными молочными породами коз в России являются зааненская, альпийская и нубийская. Так как козы этих пород существенно различаются по показателям продуктивности и составу молока, то возникает необходимость в проведении всесторонней оценки этих пород для наиболее эффективного и целенаправленного их использования.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей диссертационной работы явилось изучение влияния породы и генотипа по гену бета-лактоглобулина на молочную продуктивность и качество молока коз.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Разработать модифицированную тест-систему для определения полиморфизма гена бета-лактоглобулина (BLG) коз.
Провести молекулярно-генетический анализ полиморфизма гена BLG молочных коз зааненской, альпийской и нубийской пород.
3. Изучить показатели молочной продуктивности и связь породы и гено
типа по гену BLG с составом козьего молока и его технологическими свойст
вами.
Провести сравнительную оценку качества йогурта и творога, выработанных из молока коз разных пород и генотипов по гену BLG.
Оценить состав и свойства молока, йогурта и творога, выработанных из козьего молока, в сравнение с аналогичными продуктами из коровьего молока.
6. Определить эффективность использования коз разных пород и геноти
пов по гену BLG для производства молока, йогурта и творога.
Научная новизна работы. Впервые в нашей стране проведена комплексная оценка коз разных пород и генотипов по гену BLG в связи с качеством получаемого от них молока и молочных продуктов при одинаковых условиях содержания. Изучен состав молока коз разных пород и генотипов по гену BLG с определением его белкового, витаминного, аминокислотного и минерального состава. Проведена оценка технологических свойств молока на основе выработки из него молочных продуктов. Определена эффективность производства молока коз в условиях современной промышленной технологии. Предложена усовершенствованная тест-система для определения аллельных вариантов BLG коз.
Практическая значимость работы. Предложена усовершенствованная тест-система для определения аллельных вариантов BLG. Выполнено построение ДНК-профилей по BLG у коз зааненской, альпийской и нубийской пород. Полученные данные могут быть использованы при селекционно-племенной работе со стадами коз изучаемых пород, а также служить дополнительной основой для совершенствования зааненской, альпийской и нубийской пород и при разработке нормативно-технической документации на продукцию из козьего молока.
Положения, выносимые на защиту.
Усовершенствованная тест-система для определения полиморфизма гена бета-лактоглобулина коз.
Молекулярно-генетическая характеристика по гену BLG коз зааненской, альпийской и нубийской пород.
Связь породы коз и генотипа по гену BLG с молочной продуктивностью, составом и свойствами молока.
Качество молочной продукции, полученной из козьего и коровьего молока.
Апробация работы. Результаты проведенных исследований были доложены и обсуждены на восьмой международной научной конференции-школы: «Современные достижения и проблемы генетики и биотехнологии сельскохозяйственных животных», Био-ТехЖ-2009, ГНУ ВНИИЖ, Дубровипы, 2009 г.; на Международной научно-практической конференции по актуальным проблемам АПК, РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева, Москва, 2009 г.; на Международной научно-практической конференции «Молочная индустрия - 2010», Москва, 2010 г.; на Международных конференциях молодых ученых и специалистов, РГАУ-МСХА имени К. А Тимирязева, Москва, 2010 г. и 2011 г.; конференции Центра биотехнологии и молекулярной диагностики ГНУ ВИЖ, 27 мая 2011 г.
Структура и объём работы. Диссертационная работа изложена на 134 страницах, состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, выводов и предложений производству, списка использованной литературы. Работа включает 23 таблицы, 9 рисунков и 9 приложений. Список литературы содержит 240 источников, в том числе 160 на иностранных языках.
Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 научных статей, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ (Зоотехния, №4, 2011; Овцы, козы, шерстяное дело, № 3, 2011; Молочная промышленность, №6, 2011).
Полиморфизм белков молока
Проявление индивидуальной прерывистой изменчивости живых организмов получило название «полиморфизм». Этот термин был введен Е. Фордом в 1940 году, который определил его как наличие в одной и той же популяции «двух или более хорошо обозначенных форм, способных появляться в потомстве одной самки и встречающихся с частотой достаточно высокой для того, чтобы исключить поддержание самой редкой из них повторяющимися мутациями» [54].
Такого рода наследственная изменчивость контролируется аллельными генами и, следовательно, можно дать несколько иное определение полиморфизма, подразумевая под ним «наличие в популяции двух или более аллелей одного ло-куса, встречающихся с ощутимой частотой» [1]. Полиморфной считают популяцию, в которой частота гетерозигот по локусу более 1-5%.
Ген, представленный более чем одним аллелем, называют полиморфным геном. В тех случаях, когда локус хромосомы в популяции имеет два и более аллелей с частотой более 0,01, применяется термин «генетический (биохимический) полиморфизм». Доля полиморфных локусов точно неизвестна, но предполагают, что в популяциях многих видов она достигает 25-50% [57].
Первые работы в области биохимической генетики популяций были проведены Pauling, который описал аномальный электрофоретический тип гемоглобина при серповидноклеточной анемии у человека. Методом пептидных карт было показано, что разница между нормальным и аномальным электрофоретически-ми типами гемоглобина определяется мутационным замещением глутаминовой кислоты валином в положении 6-глобулиновой (3-цепи [1]. Благодаря этим исследованиям было доказано влияние генных мутаций на первичную структуру белка и заложена основа использования электрофоретических методов для выявления биохимической наследственной изменчивости. Принципиально важное значение имело создание современных методов электрофореза белков в крахмальном и ак-риламидном гелях.
В последнее время большое распространение в животноводстве получила маркер-зависимая селекция, т.е. локализация и идентификация маркеров, которые находятся в прямой или косвенной связи с продуктивными признаками животных. Использование в животноводстве маркер-зависимой селекции открывает возможности дальнейшего усиления эффекта селекции, в первую очередь за свет повышения точности оценки потенциала животных [37, 78].
ДНК-маркеры - это полиморфные участки ДНК с неизвестными до настоящего времени функциями, но с известной позицией на хромосоме. Маркеры находятся в тесном сцеплении с целым рядом генов, определяющих уровень продуктивных признаков, передаются по наследству потомству и при этом позволяют маркировать и прослеживать происхождение всех локализованных в этом участке, но пока не известных локусов, обусловливающих проявление признаков [28, 48, 106]. Применение такой маркерной технологии в селекции позволяет прогнозировать генетический потенциал продуктивности сразу после рождения и независимо от пола животных. Благодаря улучшению техники электрофоретического разделения белковых смесей, обнаружен генетический полиморфизм по многим белкам [47]. В настоящее время у сельскохозяйственных животных изучено более 150 полиморфных локусов белков (включая ферменты) крови, молока, тканей, однако у коз биохимический полиморфизм изучен в значительно меньшей степени.
Все белки молока характеризуются наличием генетически обусловленных полиморфных вариантов, отличающихся одной или несколькими аминокислотами. Другими словами, каждый молочный белок присутствует в двух или более формах, наличие которых генетически обусловлено аутосомальными или кодоми-нантными аллелями [37, 70, 106]. В настоящее время генетический полиморфизм установлен для всех основных молочных белков.
Полиморфизм гена бета-лактоглобулина коз
В последнее время во всем мире неуклонно растет распространенность аллергических заболеваний. Среди многообразия аллергических заболеваний особое внимание следует уделять пищевой аллергии, как одному из наиболее ранних и частых клинических проявлений аллергии. Сегодня пищевую аллергию рассматривают как реакцию повышенной чувствительности организма к пищевым продуктам, которая имеет в своей основе иммунный механизм. Остро встает проблема питания детей раннего возраста с пищевой аллергией к белкам коровьего молока. По данным различных авторов распространенность пищевой аллергии среди детей составляет 10-20% от общей популяции детей, причем от 60 до 94% случаев отмечается у детей первого года жизни [2, 4, 66, 148, 152]. Среди взрослого населения Европы непереносимость молока зарегистрирована у 1-7%, в России - у 6 %, при патологии желудочно-кишечного тракта она достигает 30%, а у лиц пожилого и старческого возраста - 68% [43].
В связи с этим сохраняет свою актуальность поиск замены продуктов на основе белков коровьего молока в детском и лечебном питании на иные продукты, способные устранить проявление аллергических реакций и в то же время обеспечить полноценное питание. Научные исследования, проведенные западными и российскими учеными в последние десятилетия, подтверждают эффективность замены коровьего молока на козье в лечебном питании [10, 21, 22, 36, 146, 189, 216]. В результате многолетних наблюдений английскими исследователями было установлено, что лишь у одного ребенка на 100 детей с пищевой аллергией к коровьему молоку возникла непереносимость и козьего молока [4, 216].
Положительное влияние козьего молока у людей с пищевой аллергией связывают с фракционным составом его белка, который отличается от структуры коровьего молока (табл. 2). Козье молоко, по сравнению с коровьим, имеет несколь 26 ко иной спектр белковых фракций. Основной казеиновой фракцией коровьего молока являются а5-казеины, сывороточных белков - Р-лактоглобулин, которые отсутствуют в женском молоке. В отличие от коровьего молока, наибольшую долю казеиновой фракции козьего молока занимает Р-казеин. Также в козьем молоке, в сравнение с коровьим, меньше содержится «аллергенного» р-лактоглобулина. Это дает возможность при непереносимости белка коровьего молока использовать козье молоко.
Белковые фракции а5-казеинов и Р-лактоглобулина, отсутствующие в женском молоке, у некоторых людей вызывают аллергические расстройства. В этом случае генетический полиморфизм казеина и Р-лактоглобулина, связанный с отсутствием или низким содержанием этих фракций белка в молоке у некоторых коз, может помочь сократить случаи проявления аллергических реакций.
В доступной нам литературе информация об аллергенности козьего молока с различным уровнем содержания а5-казеинов представлена только в двух работах [96, 180].
Клинические испытания, выполненные на морских свинках показали, что козье молоко с низким содержанием а$гказеина является менее аллергенным, чем молоко от других коз, что вероятно связано с изменением соотношения р лактоглобулина/а5-казеинов [96]. Marietta D. на основании иммунологического теста предположил, что критическую роль в аллергических реакциях прежде всего играют сывороточные белки, так как козье молоко, в котором отсутствует или низкий уровень о -казеина, имело лишь небольшое снижение аллергенности [180].
Мамаева Л.В. [43] отмечает, что чаще всего обнаруживаются аллергические реакции на (3-лактоглобулин - до 82% случаев аллергии к молоку, реже к казеину - 60%), а-лактальбумину - 41%), иммуноглобулинам - 21%, сывороточному альбумину- 18%.
Наиболее аллергенным для человека (особенно для детей) считается 0-лактоглобулин коровьего молока, так как он отсутствует в женском молоке. Причем он термостабилен и лишь частично подвергается денатурации при 100 С [7].
Бета-лактоглобулин (BLG) - основной белок сыворотки в молоке жвачных. Данную белковую фракцию идентифицируют в молоке других млекопитающих, например, свиноматок, кобыл и ослиц, но она отсутствует в молоке грызунов, зайцев и людей [185].
Молочная продуктивность коз разных пород и генотипов по гену BLG
Основной задачей при разведении молочных коз является повышение их молочной продуктивности, которая зависит от породы, условий содержания, кормления и других факторов. В нашей стране вопросами изучения молочной продуктивности коз занимались многие исследователи [12, 18, 27, 29, 44, 58, 139, 218].
По литературным данным у коз зааненской породы удой за лактацию составляет 600 - 800 кг молока при жирности 3,8 - 4,5%. Молочная продуктивность животных альпийской породы находится на уровне 500 - 750 кг молока за 270 -350 дней лактации при жирности 3,5 - 4,0%. Показатели молочной продуктивности нубийских коз зависят от места их разведения. В Эфиопии средняя продолжительность лактации животных этой породы составляет 60 - 70 дней, удой 120 - 140 кг молока; в Великобритании, США и некоторых других странах лактационный период длится 270 - 365 дней, удой за лактацию составляет 750 - 1000 кг молока при средней жирности 4,5 - 5,0%. [18, 62, 97].
Анализ продуктивности коз разных пород показал, что у животных альпийской породы в сравнение со сверстницами была более продолжительная лактация (альпийская зааненская, 76,74 дн., Р 0,01) и выше удой за всю лактацию. Козы зааненской породы в сравнение с козами других пород имели более высокие показатели продуктивности за 305 дней лактации.
У коз нубийской породы установлено некоторое превосходство по содержанию белка в молоке в сравнение с козами зааненской и альпийской пород. Высокое содержание жира в молоке наблюдалось у животных альпийской и нубийской пород и было на уровне 4,29% за первые 305 дней лактации, тогда как у коз зааненской породы содержание жира составило 4,18%.
Внутри популяции коз зааненской и альпийской пород у животных с генотипом АВ по BLG было больше дойных дней и более высокий удой за всю лактацию, а также наибольшие показатели удоя за первые 305 дней продуктивности, среднесуточного и максимального удоев в сравнение с животными, имеющими генотип ВВ. Анализ молочной продуктивности показал наличие статистически достоверной разницы у коз зааненской породы разных генотипов по удою за 305 дней (АВ ВВ, +110,2 кг, Р 0,01), количеству молочного жира (АВ ВВ, +3,7 кг, Р 0,05) и молочного белка (АВ ВВ, +3,5 кг, Р 0,05). В остальных случаях выявленные различия можно рассматривать как тенденции.
В последние годы широкое распространение получило научное направление по изучению полиморфизма белков молока, выявлению генетических маркеров молочной продуктивности для повышения эффективности селекции животных. Pauling R. и др. в 1949 г. впервые доказали влияние генных мутаций на первичную структуру белка и как следствие на его функции [123]. Многие последующие исследования подтвердили связь различных вариантов генотипов белков молока с их структурой, фракционным составом и технологическими свойствами. Для удовлетворения требований молокоперерабатывающей промышленности в сырье определенного качества было предложено использовать селекцию животных по генотипам молочных белков [188]. Данные о генотипах молочных белков используются в селекции животных с целью улучшения качества молока, требуемого для производства широкого ассортимента продуктов питания.
У коз полиморфизм белков молока изучен в значительно меньшей степени в сравнение с полиморфными белками коровьего молока, несмотря на то, что козье молоко является высококачественным сырьем для переработки.
В связи с вышеизложенным, изучение связи генотипа гена BLG с качеством и технологическими свойствами молока коз различных пород является актуальной задачей. 3.3.1. Физико-химические показатели молока
Пищевая и биологическая ценность молока обусловлена наличием в нем жиров, белков, молочного сахара, минеральных солей, витаминов, ферментов, гормонов и других веществ. Свойства молока как единой физико-химической системы обусловливаются свойствами компонентов, содержащихся в нем. Следовательно, определяя физико-химические свойства молока, мы определяем его качество.
Плотность молока - это масса молока при 20С, заключенная в единице объема, и зависит от температуры и содержания в молоке составных частей, кото-рые имеют следующую плотность (кг/м ): молочный жир - 922, белки - 1391, молочный сахар - 1610, соли - 2857. По литературным данным, плотность козьего молока находится в пределах от 1,026 до 1,039 г/см [15, 69, 197].
Качество йогурта из молока коз разных пород и генотипов по гену BLG
На молочном рынке России самым динамичным по росту потребления кисломолочным напитком является йогурт. Йогурт, в соответствии с ГОСТ Р 51331-99, вырабатывают из коровьего молока. Однако впервые йогурт появился в Болгарии и изготавливали его из козьего молока [215]. В Греции с использованием молока овец и коз вырабатывают 65% йогуртов [31].
Хотя йогурт получают из козьего молока в течение многих лет, конечный продукт зачастую отличается от йогурта из коровьего молока по многим показателям, которые являются важными для потребителя. В частности отмечается, что в продукции из козьего молока часто недостаточно выражен типичный аромат йогурта, сгусток получается менее плотный и не имеет характерного привкуса, присущего йогурту из коровьего молока. К положительным качествам можно отнести то, что в йогурте, произведенном из козьего молока, редко наблюдаются любые признаки синерезиса [117, 163, 173]. Aggarwal M.L. в своем исследовании получил термостатным способом образец йогурта из козьего молока, содержащий 4,30% жира и 8,60% сухого обезжиренного остатка, и показал, что конечный продукт неотличим от контрольного, произведенного из коровьего молока [215]. Объединение в одном продукте пищевой ценности йогурта с высокими питательными свойствами и легкой усвояемостью козьего молока позволило бы повысить потребление кисломолочных продуктов из козьего молока, которые сегодня на российском рынке практически отсутствуют, и расширить потребительский спрос на них, включая детей, лиц пожилого возраста и больных. Поэтому разработка и исследование йогурта из козьего молока является актуальным вопросом, имеющим социально-экономическое значение.
Йогурт, выработанный из молока коз, в отличие от йогурта из коровьего молока имел более высокие показатели массовой доли сухих веществ, жира и белка (табл. 21 и прилож. К), что является результатом аналогичных различий в молоке-сырье, полученном от животных этих видов. Содержание сухих веществ, жира и белка в йогурте, выработанном из молока коз нубийской породы с генотипом ВВ по Р-лактоглобулину превышало перечисленные показатели йогурта из молока коз других пород аналогичного генотипа, а также показатели йогурта из коровьего молока. В йогурте из молока коз зааненской породы с генотипом BLG АВ содержание сухих веществ, жира и белка было больше аналогичных показателей йогурта из молока коз зааненской породы, имеющих генотип BLG ВВ. Vlahopoulou L. и др. указывают, что йогурт, полученный из козьего молока, характеризовался более высоким содержанием ряда незаменимых аминокислот (треонина, валина, фенилаланина) по сравнению с йогуртом из коровьего молока [234]. Однако, согласно исследованиям, проведенным Loewenstein М. и др., по содержанию аминокислот йогурт из козьего молока существенно не отличается от йогурта, выработанного из молока коров [173].
Наше исследование показало, что йогурт, выработанный из молока коз, в отличие от йогурта из коровьего молока имел более высокое содержание незаменимых аминокислот, в т.ч. лизина, триптофана и метионина. Наибольшее количе ство незаменимых аминокислот было в йогурте из молока коз нубийской породы с генотипом BLG ВВ. При анализе продуктов из молока коз зааненской породы с различными генотипами по Р-лактоглобулину было установлено более высокое содержание общего количества незаменимых аминокислот, в т.ч. лизина, триптофана и метионина, в йогурте из молока коз, имеющих генотип BLG АВ, в сравнение с йогуртом из молока животных с генотипом BLG ВВ.
Литературные данные о содержании витаминов в молоке и молочных продуктах не всегда согласуются между собой. Это вызвано влиянием различных факторов, от которых зависит содержание витаминов в молоке, а, следовательно, и в молочных продуктах.
Уровень витаминов в молочных продуктах зависит от их содержания в молоке, от массовой доли в продуктах жира и СОМО, от условий технологии и хранения продуктов, от наличия в них синтезирующих и потребляющих витамины микроорганизмов. В кисломолочных продуктах содержание витаминов повышается на 25-62% по сравнению с исходным молоком. Это обусловлено использованием для закваски микрофлоры, активно синтезирующей витамины группы В [70, 71].
Содержание витамина С снижается более чем наполовину при обработке и хранении молока. В кисломолочных напитках его содержание снижается значительно (на 50-70%), так как при жизнедеятельности молочнокислые бактерии потребляют витамин С [70]. Однако Тепел А. утверждает, что в кисломолочных продуктах содержание витамина С несколько повышается в результате жизнедеятельности молочнокислых бактерий [71].
