Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы. Новые методы генетики несовершенных грибов 8
1.1. Введение 8
1.2. Несовершенные грибы как объекты генетических исследований 9
1.3. Биологические особенности и практическое значение несовершенного гриба Aureobasidium pullulans (de Вагу) Arnaud ІЗ
1.3.1. Жизненный цикл гриба A.pullulans ІЗ
1.3.2. Экологические ниши гриба и механизмы устойчивости к экстремальным факторам среды 16
1.3.2.1. A.pullulans - фитопатоген 16
1.3.2.2. A.pullulans - разрушитель полимеров 16
1.3.2.3. Радиоустойчивость гриба І 16
1.3.2.4. Устойчивость гриба к ионам тяжелых металлов 17
1.3.3. A.pullulans , как модель для изучения дрожже-вого-мицелиального диморфизма у грибов 17
1.3.4. A.pullulans - продуцент полисахаридов 19
1.3.5. Гене тико-физи ологические исследования гри ба.. 20
1.4. Протопласты грибов в генетических экспериментах 23
1.4.1. Условия получения и регенерации протопластов грибов 23
1.4.2. Слияние протопластов грибов 28
1.4.3. Внутривидовая гибридизация грибов методом слияния протопластов 32
1.4.4. Межвидовая гибридизация грибов путем слияния протопластов 40
1.4.5. Межродовые слияния протопластов грибов 47
1.4.6. Возможные механизмы стабилизации продуктов слияния протопластов путем генетической рекомбинации 50
1.4.7. Протопласты в опытах по трансформации грибов... 54
1.5. Заключение 56
Глава II. Материалы и методы 57
2.1. Штаммы гриба и мутанты, использованные в работе.. 57
2.2. Условия культивирования 57
2.3. Выделение мутантов 57
2.3.1. УФ-мутагенез и отбор ауксотрофных мутантов ... 57
2.3.2. Химический мутагенез 62
А. Обработка нитрозометилмочевиной (БММ)
Б. Обработка гидроксиламинопурином (ГАП)
2.4. Получение протопластов и условия их регенерации. 62
2.5. Метод слияния протопластов 64
2.6. Генетический анализ первичных и вторичных ПСП... 65
2.6.1. Анализ митотическои стабильности ПСП 65
2.6.2. Анализ индуцированной митотическои сегрегации ПСП 65
2.6.2.1. Индуцирование УФ-излучением 65
2.6.2.2. Индуцирование хлорал-гидратом 66
2.6.2.3. Индуцирование беномилом 66
2.7. Метод окраски ядер в клетках гриба 67
2.8. Определение количества ДБК в клетках гриба методом проточной цитофлуориметрии 67
2.9. Статистическая обработка результатов 67
Глава III. Характеристика исходных штаммов 68
3.1. Морфолого-культуралъные признаки 68
3.2. Устойчивость гриба к ионам Со2+ и Си2* 76
3.3. УСТОЙЧИВОСТЬ штаммов гриба к индукторам гаплоиди-зации 78
3.4. Устойчивость клеток гриба к УФ-излучению 79
3.4.1. Летальное действие УФ-излучения 79
3.4.2. Мутагенное действие УФ-излучения 81
Глава ІV. Протопласты A.pullulans и их слияние 83
4.1. Получение протопластов и их регенерация 83
4.2. Внутри- и межштаммовые слияния протопластов 83
4.3. Слияние протопластов и тест на комплементацию . 88
Глава V. Генетический анализ продуктов слияния протопластов A.pullulans 90
5.1. Генетический анализ первичных ПСП 90
5.2. Генетический анализ вторичных ПСП 94
5.2.1. Генетический анализ нестабильных ПСП 95
5.2.2. Генетический анализ стабильных ПСП 98
5.2.2.1. Характеристика митотической стабильности ПСП.. 102
5.2.2.2. Индуцированная УФ-лучами нестабильность ПСП... 102
5.3. Митотическая нестабильность,индуцированная хлоралгидратом НО
5.4. Митотическая нестабильность, индуцированная бено-милом III
5.5. Сравнение количества ДНК на клетку в ПСП и родительских штаммах 114
Глава VІ. Обсуждение 120
Выводы 134
Использованная литература 135
- Несовершенные грибы как объекты генетических исследований
- УФ-мутагенез и отбор ауксотрофных мутантов
- Морфолого-культуралъные признаки
- Внутри- и межштаммовые слияния протопластов
- Генетический анализ первичных ПСП
Несовершенные грибы как объекты генетических исследований
Несовершенные грибы - один из крупнейших классов грибов, включающий около 30% всех известных науке видов грибов (Жизнь растений, 1976, 2т.). Класс объединяет грибы с септированным мицелием, весь жизненный цикл которых обычно проходит в гаплоидной стадии, без смены ядерных фаз. Некоторые микологи считают этот класс формальным, т.к. по происхождению эта группа гетерогенна, а ряд грибов имеет совершенную стадию, относящуюся к классу ас-комицетов или базидиомицетов. Обычно же несовершенные грибы, или микромицеты, размножаются только бесполым путем.
Особенно широко представлены в этом классе фитопатогены - паразиты растений, наносящие серьезный экономический ущерб сельскому хозяйству, поражая сельскохозяйственные культуры. Кроме того, несовершенные грибы представляют практический интерес и как продуценты биологически активных веществ, используемых при производстве антибиотиков, различных .ферментов, витаминов, органических кислот и т.д. В последнее время большое внимание стали уделять микроорганизмам, участвующим в разрушении - биодегра-дации - различных полимерных материалов. Среди них несовершенные грибы также занимают значительное место. Нельзя не отметить и роль микромицетов в вызывании микозов человека и животных.
Относительно слабая изученность несовершенных грибов в генетическом отношении объясняется их биологическими особенностями: мицелиальным ростом, который затрудняет применение к ним общепринятых в генетике микроорганизмов методов исследования, мно-гоядерностью конидий и мицелия, что является препятствием к получению ауксотрофных мутантов и, наконец, отсутствием полового процесса.
Как уже подчеркивалось, существенную роль в изучении этих грибов сыграло открытие парасексуального процесса. Этот процесс слагается из нескольких этапов: образования гетерокариона, слияния ядер в гетерокарионе с образованием диплоидного ядра, ми-тотической рекомбинации в диплоидном ядре и гаплоидизации при последующем вегетативном размножении. Недавно было установлено, что обмен генетическим материалом при парасексуальном процессе может происходить и без слияния ядер в резз льтате переноса отдельных хромосом или их частей в гетерокарионе от одного ядра К друтому (Dutcher, 1981; Sarachek, Weber, 1984).
УФ-мутагенез и отбор ауксотрофных мутантов
Культуру гриба 3-х дневного возраста суспендировали в 1,8 мл фосфатно-цитратного буфера (рН=6,0). К суспензии (концентрация 1,0.10 клеток на I мл) добавляли 0,2 мл раствора ШМ (10 мг/мл) в том же буфере и ставили на качалку при 30С. Клетки обрабатывали в течение 60 минут, выживаемость при этом составляла 47,3%. Обработанную суспензию рассевали через разведения на Д среду. Отбор мутантов проводили, как описано вше. Б. Обработка гидроксиламинопурином (ГАП)
ГАП добавляли в центр чашки (количество не учитывали) с заранее посеянным газоном клеток гриба. Через несколько дней, когда вырастал газон гриба, брали клетки из области, близкой к месту нахождения мутагена, суспендировали в воде и рассевали на Д среду.
Морфолого-культуралъные признаки
Так как в коллекции мы имели штаммы, выделенные из различных источников, то, естественно, для дальнейшей с ними работы было необходимо знать их морфолого-культуральные особенности.
Описания морфолого-культуральных свойств исходных штаммов были сделаны на 9-е сутки роста культур на М среде, при 25С, в темноте (табл.9). На фотографиях представлены те же штаммы гриба, выращенные на 3-х различных средах: М, П и Д (рис.3). Как видно, по ряду морфолого-культуральных признаков штаммы четко различались. Причем, некоторые из признаков имели явную корреляцию с происхождением штаммов. Так, для трех штаммов-фитопа-тогенов характерными были колонии розоватого или белого цвета с матовой гладкой поверхностью, тогда как для штаммов-биодеструкторов - дрожжеподобные темно-окрашенные, чернеющие с возрастом колонии, имеющие ослизненнуго блестящую поверхность (особенно сильно выраженную у Б2 и В4). Штамм Р -ІІІ6 по характеру пигментации и ослизненности колоний оказался похожим на штаммы-биодеструкторы. Штаммы Р -425 и Р -179 выделялись сильно развитым воздушным мицелием и очень плотной консистенцией колоний, что также было характерно для штамма ВЗ. Штамм ВЗ на П среде имел специфический запах, напоминающий ацетон, и рос в описанных условиях очень медленно. Штамм м-23 был более схож со штаммами-продуцентами и биодеструкторами по пигментации. Его чернеющие со временем колонии вначале имели рыхлую консистенцию, которая постепенно переходила в плотную,и покрывались воздушным мицелием.
Внутри- и межштаммовые слияния протопластов
Метод слияния протопластов вначале был применен для получения гибридных ПСП между ауксотрофными мутантами одного штамма. Так, с успехом были получены внутриштаммовые ПСП во всех поставленных комбинациях слияний протопластов (табл.18). Отсутствие ПСП в комбинации ВІ-І х ВІ-20, вероятно, объясняется аллельностью их мутаций, т.к. оба они имеют одинаковый фенотип - Met"".
Поскольку имеющиеся в нашей коллекции исходные штаммы гриба имели различное происхождение и различались по морфолого-куль-туральным и некоторым другим признакам, то можно было предположить, что они также различаются генетически. Во внутри- и межштаммовых слияниях участвовали одни и те же мутанты, что позволило сравнить получаемые частоты.
Межштаммовые прототрофные ПСП удалось получить только между штаммами-фитопатогенами и между штаммами-биодеструкторами. Причем, частоты слияния разных штаммов-фитопатогенов практически не отличались от частот внутршптаммовых слияний (табл.18 и 19). В комбинациях же слияний протопластов штамлов различного происхождения не было получено ПСП при наличии достаточно большого числа способных к регенерации протопластов (частота слияния которая могла быть зарегистрирована в условиях опыта, рассчитанная по числу регенерировавших родительских протопластов, также приведена в табл.19).
Генетический анализ первичных ПСП
Для генетического анализа были взяты ДСП фитопатогенных штаммов, которые оказались наиболее удобными для проведения генетических экспериментов.
После высева смеси протопластов, обработанной ПЭГом, на селективную среду с осмотическим стабилизатором прототрофные колонии появлялись на 3-4 сутки - так называемые „первичные" ДСП (рис.6). Эти колонии были гетерогенными по окраске, размеру и морфологии. Среди них встречались колонии белые, светло-желтые, ярко-желтые, дрожжеподобные и с развитым воздушным мицелием. Хотя эти признаки сильно варьировали и зависели в большой степени от густоты посева, первичные колонии ПСП можно было разделить по форме и размеру на два класса: мелкие (диаметром I мм на 7-е сутки роста), окртглые без мицелиальных выростов и крупные (3-5 мм) с мицелиальными выростами в среду. Причем, только в двух скрещиваниях $ 6 и № 7 (табл. 19) ПСП четко различались по размерам, а в остальных имели самые разнообразные размеры и формы.
Из первичных ПСП-55 для анализа взяли несколько колоний крайних по размерам вариантов (табл.21). Оказалось, что крупные и мелкие первичные ПСП-55 незначительно отличались по генетическому составу клеток. Мелкие колонии на 90-100$ состояли из ауксотрофных клеток, в крупных же колониях доля ауксотрофных клеток колебалась от 66,0$ до 98,0$.
