Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. Структурно-функциональная организация генаНБЕ 10
2.1.1. Локализация гена HFE в кластере генов главного комплекса гистосовместимости на 6-й хромосоме 10
2.1.2. Структура гена HFE и возможные механизмы его экспрессии 12
2.1.3. Структура белка HFE 17
2.1 АПолиморфизмы гена HFE 19
2.1.5. Филогеографическая распространённость полиморфизмов и гаплотипов гена HFE 24
2.2. Некоторые аспекты метаболизма железа у человека 28
2.2.1. Роль железа в организме 28
2.2.2. Белки, участвующие в метаболизме железа 31
2.3. Роль HFE в метаболизме железа и его предполагаемые функции 38
2.3.1 .Участие HFE в регуляции TfRl 38
2.3.2.Участое HFE в регуляции экспрессии хепсидина 40
2.3.3. Участие HFE в регуляции метаболизма трансферрин-несвязанного железа...42
2.3.4. Предполагаемые иммунологические функции HFE 44
2.4. Клиника заболеваний, сцепленных с HFE 47
2.4.1. Хронические заболевания печени 47
2.4.2. Порфирия 51
2.4.3. Сердечно-сосудистые заболевания 52
2.4.4. Сахарный диабет 53
2.4.5. Злокачественные новообразования 54
2.4.6. Болезнь Альцгеймера 55
2.5. Влияние носительства различных аллелей гена HFE на продолжительность жизни и биохимические показатели крови 56
3. Материалы и методы 58
3.1. Выборки 58
3.2. Выделение ДНК 60
3.3. ПЦР-ПДРФ анализ 61
3.4. Секвенирование ДНК 65
3.5. Статистический анализ 66
3.6. Гашютипический анализ последовательностей нуклеотидов гена HFE 66
3.7. Построение эволюционного дерева по данным о распределении полиморфизмов в последовательностях гена HFE ..67
3.8. Использованные базы данных 68
3.9. Соответствие нумерации полиморфизмов в асе. no.Z92910 и no.U91328 69
4. Результаты 70
4.1. Анализ популяционных частот экзонных полиморфизмов C282Y, H63D, S65C гена HFE 70
4.2. Анализ частот аллелей C282Y, H63D, S65C гена HFE в выборках пациентов с различными хроническими заболеваниями 73
4.3. Оценка зависимости показателей железа крови от генотипа по HFE в выборке здоровых женщин г. Новосибирска 76
4.4. Оценка сцепленности интронных гаплотипов с мутациями C282Y, H63D, S65C гена HFE 77
4.5. Оценка частот интронных гаплотипов reHaHFE в популяциях России 82
4.6. Анализ потенциальной значимости интронных полиморфизмов гена HFE в регуляции его экспрессии .'85
4.7. Оценка функциональной значимости полиморфизмов IVS2(+4)t/c, IVS4(-44)t/c и IVS5(-47)a/g гена HFE 89
5. Обсуждение 94
5.1. Частоты полиморфизмов C282Y, H63D и S65C гена HFE в популяциях Сибири...94
5.2. Анализ частот аллелей с экзонными мутациями и интронными гаплотипами гена HFE в выборках пациентов с различными заболеваниями и в выборках долгожителей 96
5.3. Варианты гаплотипов по интронным полиморфизмам IVS2(+4)t/c, IVS4(-44) t/c и IVS5(-47)a/g гена HFE. Сцепленность каждой из мутаций C282Y, H63D и S65C с определённым вариантом интронного гаплотипа 99
5.4.Расо - и этноспецифические особенности распространения интронных гаплотипов гена HFE в популяциях России 100
5.5. Возможные функции полиморфизмов IVS2(+4)t/c, IVS4(-44)t/c и IVS5(-47)a/g гена HFE по данным контекстного анализа структуры ДНК 102
6. Выводы 109
7. Благодарности 111
8. Список литературы 112
- Некоторые аспекты метаболизма железа у человека
- Влияние носительства различных аллелей гена HFE на продолжительность жизни и биохимические показатели крови
- Гашютипический анализ последовательностей нуклеотидов гена HFE
- Оценка сцепленности интронных гаплотипов с мутациями C282Y, H63D, S65C гена HFE
Введение к работе
Актуальность. Выяснение закономерностей внутривидовой фенотипической изменчивости человека является одной из важнейших проблем современной биологии. Концептуально полагают, что вариабельность геномов определяет всё разнообразие фенотипических проявлений, в т.ч. и патологических. Оценка влияния структуры генома на фенотип осложняется разветвлённой многоуровневой системой регуляции экспрессии генетического материала и плейогропизмом генов. Решение задач, имеющих отношение к выяснению влияния генотипа на фенотип, усложняется также диплоидностью генома. На современном этапе развития функциональной геномики изучение вклада полиморфизмов отдельного гена в фенотипические характеристики организма требует применения комплексного подхода и корректного выбора объекта для коррелятивных оценок. Моногенные заболевания считаются наиболее простой моделью для таких исследований. Аутосомно - рецессивное заболевание наследственный гемохроматоз (НГ) первоначально относили именно к таким болезням, поэтому генетическая предрасположенность к данному заболеванию широко исследовалась в последние годы во всём мире.
Термин «гемохроматоз» был введён в 19 веке для обозначения заболевания, симптомы которого проявлялись в накоплении железа в паренхимальных тканях с их сопутствующим повреждением. Классической триадой считают цирроз печени, сахарный диабет и нарушение пигментации кожи, развивающиеся у людей среднего возраста, преимущественно мужчин. В 1996г группа исследователей методом позиционного клонирования обнаружила, что НГ ассоциирован с геном HLA-H, кодирующим неклассический белок МНС1 [Feder et al., 1996]. В 1997г Номенклатурный комитет факторов системы HLA переименовал кодируемый геном белок в HFE (high Fe) [Bodmer et al., 1997]. Было установлено, что этот белок является негативным регулятором трансферринового рецептора типа 1 [Gross et al., 1998; Feder et al., 1998], а также одним из основных регуляторов экспрессии хепсидина - белка, который определяет сорбцию железа в кишечнике и концентрацию железа в сыворотке
крови [Roetto et al., 2003; Makui et al., 2005]. Большинство пациентов с НГ имели генотипы C282Y/C282Y и C282Y/H63D этого гена [Feder et al., 1996]. При генотипировании популяционных выборок различных этнических групп по мутациям C282Y и H63D было установлено, что частоты этих аллелей максимальны в государствах Европы и минимальны в Юго-Восточной Азии. Это предполагает достаточно высокую заболеваемость НГ в странах Западной Европы, чего, однако, не наблюдается. В настоящее время признано, что носительство генотипа C282Y/C282Y или C282Y/H63D является одним из основных условий развития НГ типа 1 (НГ1), но клиническая пенетрантность этих генотипов невысока [Beutler et al., 2002, 2003; Ajioka and Kusher, 2003; McCune and Worwood, 2003]. При этом показано, что частоты аллелей C282Y, H63D, а также по некоторым данным и S65C, повышены среди пациентов с синдромом перегрузки железом и рядом других мультифакториальных заболеваний. Отсутствие экзонных мутаций этого гена на хромосомах значительного числа пациентов с НГ в некоторых этнических группах послужило причиной поиска мутаций в некодирующих областях этого гена, которые могли бы влиять на его экспрессию. В результате этого было найдено значительное количество нейтральных в отношении НГ1 интронных мутаций. В число наиболее полиморфных сайтов гена HFE у человека входят IVS2(+4)t/c, IVS4(-44)t/c и IVS5(-47)a/g. Их распространение оказалось расоспецифичными, поэтому они часто используются для филогенетического анализа [Beutler and West, 1997; Aguilar-Martinez et al, 1999; Rochette et al., 1999]. Однако представленные в литературе результаты гаплотипического анализа гена HFE противоречивы.
Подробное популяционное исследование полиморфизма гена HFE среди населения Европы и оценка его вклада в развитие патологий, связанных с перегрузкой организма железом, оказалось недостаточным для ответов на все возникшие вопросы. Остались невыясненным, каковы географические границы распространения аллелей C282Y, H63D и S65C, с какими генетическими маркерами 6-й хромосомы они сцеплены за пределами Европы. Так же неясны причины низкой клинической пенетрантности генотипов C282Y/C282Y и
C282Y/H63D. Неизвестны причины обнаружения различающихся наборов мРНК HFE разными исследователями [Rhodes and Trowsdale, 1999; Jeffrey et al., 1999; Thenie et ah, 2000; Sanchez et al., 2001].
Целью исследования была оценка полиморфизма гена наследственного гемохроматоза типа 1 человека HFE среди населения России и выяснение возможных связей его ОНП и гаплотипов с патологиями, вызванными нарушением метаболизма железа. Задачи исследования
1. Создание надежных тест-систем для генотипирования распространённых
экзонных (C282Y, H63D, S65C) и интронных (IVS2(+4)t/c, IVS4(-44)t/c, IVS5(-
47)a/g) полиморфизмов гена HFE.
-
Определение частот встречаемости экзонных и интронных полиморфизмов и гаплотипов среди контрастных в расовом отношении групп населения России.
-
Оценка предрасположенности к нарушениям метаболизма железа, связанным с носительством экзонных мутаций гена HFE, на территории России.
-
Контекстный анализ последовательностей ДНК, содержащих интронные полиморфизмы IVS2(+4)t/c, IVS4(-44)t/c, IVS5(-47)a/g гена HFE.
5. Выяснение потенциальной функциональной значимости полиморфизмов
IVS2(+4) t/c, WS4(-44) t/c и IVS5(-47) a/g.
Научная новизна.
1. Разработаны оригинальные методики для выявления мажорных мутаций
(C282Y, H63D, S65C) гена HFE, ассоциированные с наследственным гемохроматозом. Впервые были определены частоты аллелей с этими экзонными мутациями гена HFE в различных этнических группах России и оценена предрасположенность к наследственному гемохроматозу 1-го типа в разных этнических группах.
-
Идентифицированы гаплотипы по полиморфизмам IVS2(+4)t/c IVS4(-44)t/c, IVS5(-47)a/g гена HFE. Обнаружено 4 варианта (TTG, ТТА, СТА, ССА) из 8-ми теоретически возможных.
-
Установлена сцепленность каждой из мажорных мутаций гена HFE во всех исследованных этнических группах России с определённым вариантом
интронного гаплотипа по полиморфизмам IVS2(+4)t/c IVS4(-44)t/c, IVS5(-47)a/g этого гена, а именно C282Y-с TTG, H63D-с СТА и S65C-с CCA.
4. Определена потенциальная функциональная роль интронных полиморфизмов
IVS2(+4)t/c IVS4(-44)t/c, IVS5(-47)a/g гена HFE на различных стадиях
формирования сплайсосомы в пре-мРНК.
5. Ассоциативным анализом показано влияние аллеля IVS4(-44)t на
формирование патологического фенотипа синдрома перегрузки железом.
Положения, выносимые на защиту. На защиту выносится доказательство
этноспецифического распределения среди населения России полиморфизмов
C282Y, H63D и S65C в экзонах, а так же полиморфизмов IVS2(+4)t/c IVS4(-44)t/c
и IVS5(-47)a/g в интронах гена HFE, кодирующего неклассический белок МНС1,
регулятор метаболизма железа. Носительство аллелей C282Y, H63D и S65C гена
HFE не является достаточным фактором для формирования нарушений
метаболизма железа. Интронные полиморфизмы гена HFE потенциально могут
влиять на особенности сплайсинга и изменять состав кодируемых геном мРНК у
человека.
Научно-практическая значимость. Произведена оценка вклада носительства аллелей C282Y и H63D гена HFE в риск возникновения наследственного гемохроматоза 1-го типа и некоторых патологий, связанных с нарушением метаболизма железа, а также на продолжительность жизни человека на территории России. Результаты данного исследования могут быть использованы в подразделениях Минздравсоцразвития России. На разработанную тест-систему диагностики мутаций C282Y и H63D гена HFE получен Патент на изобретение № 2144566, 2000г «Способ диагностики предрасположенности к гемохроматозу». Тест - система используется среди медицинских генетиков для диагностики наследственного гемохроматоза.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на IV Российской конференции «Гепатология сегодня», 1999г. Москва, Российская конференция «Гепатология сегодня», Москва, 2001, IV ISTC Scientific Advisory Committee Seminar on "Basic Science in ISTC Activities", Novosibirsk, 2001, П Объединённой научной сессии CO РАН и СО РАМН «Новые технологии в
медицине», Новосибирск, 2002, II Международной конференции «Математическая биология и биоинформатика», Пущино, 2008, V съезде ВОГиС, посвященном 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина, Москва, 2009. Публикации. По теме диссертации опубликовано 33 работы, из них 7 в рецензируемой печати, в том числе 1 патент РФ, 5 статей в журналах из списка ВАК.
Структура и объём работы. Работа изложена на 137 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы, включающего 293 источника. Текст проиллюстрирован 17-ю рисунками и содержит 19 таблиц.
Некоторые аспекты метаболизма железа у человека
Железо служит у теплокровных организмов универсальным источником электронов во многих метаболических процессах с участием гемопротеинов: перенос электронов, клеточное дыхание, синтез ДНК, РНК и белков, регуляция экспрессии генов. Железо является важным компонентом многих ферментов — оксидаз, каталаз, пероксидаз, цитохромов, рибонуклеотид-редуктаз, аконитаз [Boldt, 1999; Conrad et al., 1999; Ponka, 1999]. Высокая концентрация железа обнаружена в эритроцитах, печени, макрофагах и мозге [Youdim, 1988; Yehuda and Youdim, 1989; Andrews et al., 1999]. Неорганическое железо в свободном состоянии индуцирует появление гидроксид-ионов и свободных радикалов, которые способны повреждать большинство клеточных молекул. Концентрация «свободного» железа, растворённого в плазме крови и цитозоле, жёстко регулируется молекулярными механизмами усвоения, транспорта, хранения и утилизации этого элемента, которые минимизируют оксидативный стресс. В организме не существует механизма активного выведения излишков железа, это достигается только путём отслоения эпителия и кровопотерь. В плазме крови железо транспортируется в основном в комплексе с трансферрином (80%), его избыток откладывается на хранение в печени, где образуется его комплекс с ферритином, а в некоторых случаях с гемосидерином, являющимся продуктом протеолиза ферритина. Основная масса железа (80%) находится в эритроцитах в комплексе с гемом. Кроме того, значительное количество железа сосредоточено в ретикулоэндотелиальных клетках. Они получают железо в основном не из сывороточного трансферрина, а путём фагоцитоза отработавших эритроцитов. Подсчитано, что у человека 1 моноцит захватывает 1-1,5 «состарившихся» эритроцитов в час. После переработки эритроцита он выбрасывает в плазму железо в виде гема, комплекса с ферритином и «свободного» железа [Moura et al., 1998а]. Последнее связывается в плазме с трансферрином, а гемоглобин - с гаптоглобином, а затем вновь захватывается специфическими рецепторами. Общая схема «круговорота» железа в организме показана на рис.7.
Одновременно менее 1% железа находится в клетках в «свободном» виде, образуя комплексы с цитратом и ацетатом, и формируют так называемый лабильный пул железа. Именно он в значительной степени определяет координированный синтез в клетке белков, участвующих в регуляции захвата и хранения железа, а также защиты от оксидативного стресса. Механизмы этой регуляции зависят от типа клеток и стадии клеточного цикла, в значительной степени эта регуляция опосредуется внутриклеточными «iron regulatory proteins» IRP1 и IRP2. Эти белки связывают свободное железо и, меняя свою конформацию, теряют сродство к «iron responsive elements» (IRE) - шпилечным структурам длиной 26-30 н. на некоторых мРНК, тем самым изменяя структуру этих мРНК [Theil, 1994, 1998]. Белок IRP1 экспрессируется во всех тканях, но максимальный его уровень наблюдается в печени, почках и кишечнике, по структуре он является цитозольным гомологом митохондриальной аконитазы. При повышении концентрации железа он захватывает кластер 4Fe-4S и приобретает аконитазную активность [Kaptain et al., 1991; Rouault et al., 1991; Henderson et al., 1993; Emery-Goodman et al., 1993; Guo et al., 1994; Hentze, 1994]. IRP2- белок более чем на 50% гомологичен IRP1 по аминокислотному составу, но не имеет аконитазной активности. IRP2 экспрессируется во всех тканях, но концентрация его низка [Emery-Goodman et al., 1993; Guo et al., 1994]. Различие между этими белками состоит в том, что IRP2 быстро деградирует при высокой концентрации железа [Guo et al., 1995; Pantopoulos et al., 1995], тогда как IRP1 способен снова активизироваться при снижении концентрации железа. Хотя оба этих белка связываются с IRE с одинаковой афинностью, они имеют разные гены-мишени [Henderson et al., 1993] и в разной степени модулируются различными клеточными факторами [Pantopoulos and Henze, 1995; Recalcati et al., 1998]. Образование комплекса IRP/IRE намРНК трансферринового рецептора 1-го типа (TfRl) усиливает её трансляцию, а на мРНК ферритина способствует её деградации рибонуклеазами. Это обусловлено различным положением IRE- элементов на мРНК (3 UTR - на мРНК TfR и 5 UTR - на мРНК тяжёлой и лёгкой цепей ферритина). IRE также найдены в генах многих других белков, участвующих в метаболизме железа (например, ферропортина и DMT1) и других клеточных процессах (синтез ДНК, перенос электронов и др.).
Основной этап регуляции метаболизма железа на уровне организма приходится на его сорбцию в клетках кишечника (12-перстной и тощей кишке). Для попадания в кровоток железо должно пройти апикальную мембрану, цитозоль и базолатеральную мембрану энтероцита. Если в эитероцит поступает сигнал об избытке железа в организме, оно хранится внутри клетки в комплексе с ферритином вплоть до её отшелушивания. Если сигнал не поступает, происходит его перенос через базолатеральную поверхность энтероцита в кровоток, связывание с белками и захват клетками. В ходе этого процесса несколько раз меняется степень окисления железа. В составе пищи «неорганическое» железо содержится в форме Fe3+, в цитоплазме всех клеток в «свободном» виде - в форме Fe , в комплексе с ферритином - в форме Fe , в крови, в том числе и в комплексе с транспортёром трансферрином - в форме Fe3+. Для изменения степени окисления железа при переходе клеточных мембран и его транспортировки в организме существует набор белков, как общих для всех типов клеток, так и клеточноспецифичных.
Влияние носительства различных аллелей гена HFE на продолжительность жизни и биохимические показатели крови
Аллели H63D и C282Y гена HFE достаточно широко распространены в популяциях человека, несмотря на их ассоциацию с различными заболеваниями. Для выяснения причин этого феномена в разных странах были предприняты попытки генотипирования выборок пожилых людей и долгожителей. Выяснилось, что у датчан с возрастом падает частота гетерозигот по замене C282Y [Bathum et al., 2001]. Тогда как в Англии и Нидерландах отличий в частотах аллелей C282Y и H63D между популяцией и долгожителями выявлено не было [Van Aken et al., 2002; Willis et al., 2003]. Было выдвинуто предположение, что в ходе эволюции человека замены в гене HFE могли нести адаптивную функцию для людей, проживавших в железодефицитных районах, предохраняя их от железодефицитной анемии, а также могли давать преимущество часто рожавшим женщинам. Для подтверждения этой гипотезы были изучены показатели содержания железа в крови у женщин репродуктивного возраста. Оказалось, что у австрийских женщин - носителей замены C282Y достоверно выше уровень гемоглобина, сывороточного железа и показатели насыщения трансферрина железом [Datz et al., 1998]. Среди пожилых и долгожителей США носители замены C282Y и/или H63D имеют более высокие показатели насыщения трансферрина и большее содержание железа в организме [Garryet al., 1999]. Результаты были подтверждены на выборке из 23681 человек европеоидной расы из разных этнических групп, при этом показано, что этнические группы различаются по средним показателям гемоглобина, ферритина и осаждения трансферрина крови, а также по степени влияния носительства мутаций гена HFE на эти показатели. Среди носителей замены C282Y существенно меньше распространён железодефицит, не связанный с анемией [Beutler et al., 2003]. В выборке женщин из Англии у носительниц генотипа C282Y/C282Y уровень ферритина был в 2.4 раза выше и эффект от приёма гемового железа на показатели железа крови был усилен в 2 раза по сравнению с носителями других генотипов [Greenwood et al., 2005].
Таким образом, носительство распространённых мутаций гена HFE имеет как негативные, так и позитивные стороны в зависимости от,сопутствующих генетических факторов и условий внешней среды. Однако причины столь разнообразного фенотипического проявления носительства этих замен остаются невыясненными. Не до конца изучены функции белка HFE. Малопонятны механизмы регуляции экспрессии этого гена, роль альтернативных изоформ мРНК и кодируемых ими белков. Цель настоящей работы состояла в оценке распространения аллелей, гаплотипов и генотипов гена HFE по мутациям C282Y, H63D, S65C и полиморфизмам IVS2(+4) t/c, IVS4(-44) t/c, IVS5(-47) a/g в этнических группах Сибири и клинических выборках населения, а так же в выяснении потенциальной функциональной значимости изученных полиморфизмов этого гена. г. Тамбова и Челябинской области (447 чел). Объединенная выборка финно-угров (104 чел) включает представителей народностей мордвы и хантов, манси, проживающих в бассейне реки Оби. Тувинцы (110 чел) - жители Алтае-Саянского нагорья (г. Кызыл и поселок Эрзин Убсунурской котловины) и алтайцы (102 чел, Кош-Агачский район республики Алтай) относятся к центрально азиатским монголоидам. Казахи (62 чел) - монголоидная этническая группа из Кош-Агачского района республики Алтай. Восточноазиатские монголоиды нивхи (32 чел) являются жителями бассейна р. Амур и Сахалина. Арктические монголоиды чукчи (125 чел) представляют население поселков Чукотского автономного округа.
В выборку пациентов с хроническими диффузными заболеваниями печени включено 185 чел, проходивших обследование в клинике НИИ Терапии СО РАМН и Государственном Новосибирском Областном Клиническом Диагностическом Центре. Среди них выделены пациенты с синдромом перегрузки железом (59 чел), у которых уровень сывороточного железа был выше 26 мкмоль/л у женщин и выше 28 мкмоль/л у мужчин, а уровень сывороточного ферритина выше 72 нг/мл у женщин и 160 нг/мл у мужчин. В выборку пациентов с гемохроматозом (13 чел) входили лица, для которых бьш показан полный набор клинических признаков гемохроматоза (насыщение трансферрина железом более 45% при норме не более 30%, гепатит или цирроз печени неизвестной этиологии, нарушение обмена углеводов, меланодермия).
Выборка пациентов с болезнью Альцгеймера (222 чел) состояла из лиц обоих полов с поздней формой этого заболевания, проходивших обследование в НИИ Терапии СО РАМН г. Новосибирска.
Выборка пациентов с сахарным диабетом была составлена случайным образом из 149 представителей обоих полов, страдавших разными формами сахарного диабета и находившимися на лечении в Отделении эндокринологии Областной больницы, г. Тамбова. В группу пациентов с тяжёлыми осложнениями диабета относили пациентов с выраженной нефропатией, пролиферативной ретинопатией, тяжёлой нейропатией, ишемической болезнью сердца с наличием стенокардии, с перенесённым инсультом.
Выборка долгожителей (271 чел) была сформирована из лиц старше 90-летнего возраста, проживавших в г. Новосибирске, Томске и Тюмени.
Структуру внутригенных гаплотипов по полиморфизмам IVS2(+4) t/c, IVS4(-44) t/c и IVS5(-47) a/g определяли у носителей аллелей C282Y, H63D и S65C гена HFE. Отбор носителей этих аллелей проводили посредством генотипирования представителей различных популяционных выборок. Популяционная выборка хромосом с мутациями для анализа неравновесия по сцеплению была увеличена за счёт пациентов с различными хроническими мультифакториальными заболеваниями, генотипы которых содержали аллели C282Y, H63D и S65C. Всего по полиморфизмам IVS2(+4) t/c, IVS4(-44) t/c и IVS5(-47) a/g было генотипировано 359 чел.
ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови с помощью фенольной экстракции [Sambrook et al., 1989]. Для этого полученные замороженные или охлаждённые образцы крови (3-10 мл) гомогенизировали при комнатной температуре в 5-6 объёмах буфера для гемолиза (ЮмМ трис-НС1 рН 7.5, ЮмМ NaCl, ЗмМ MgCb) и собирали осадок центрифугированием в течение 10 мин при 4 000 об/мин 2-3 раза. Затем осадок ресуспендировали в 1 мл буфера, содержавшем ЮмМ ЭДТА, 100мМЫаС1, 50мМ трис-НС1 рН 8.5. В полученную смесь добавляли 20%-ный раствор додецилсульфата Na до 0.5%-ной концентрации и раствор протеиназы (Aspergillus acid proteinase, ICN, USA) до концентрации 200 мкг/мл. Раствор выдерживали в течение 14 часов при комнатной температуре или в течение 3 часов при 37С, затем проводили экстракцию равным объёмом фенола, насыщенного раствором 1 М трис-НС1 рН8, до обесцвечивания верхней фазы. Верхнюю фазу образца собирали после центрифугирования при 4 000 об/мин. в течение 10 мин. Далее экстракцию проводили в тех же условиях равным объёмом смеси фенола, хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 25:24:1 и смеси хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1). ДНК из раствора верхней фазы выделяли осаждением в 2М растворе ацетата аммония равным объёмом изоамилового спирта при комнатной температуре. Осадок собирали центрифугированием при 10 000 об/мин. в течение 5 мин, промывали 75% этанолом, сушили при 50С и растворяли в 50-100 мкл воды.
Гашютипический анализ последовательностей нуклеотидов гена HFE
Внутригенные гаплотипы по полиморфизмам IVS2(+4)t/c, IVS4(-44)t/c и IVS5(-описанных выше этнических групп, выборок пациентов с НГ и хроническими мультифакториальными заболеваниями (синдром перегрузки железом, диабет, гепатиты, болезнь Альцгеймера и др.), а так же долгожителей. Гаплотипический анализ проводили также у случайно выбранных представителей разных этнических групп, имевших генотип WT/WT.
Для определения неравновесия по сцеплению между экзонными мутациями и интронными гаплотипами был выполнен анализ таблиц сопряжённости. Для анализа сцепления интронных гаплотипов с мутациями C282Y и H63D использовали образцы с генотипами TTG/TTG и СТА/СТА, соответственно. Из-за небольшого числа хромосом с мутацией S65C анализу подвергали образцы с генотипом S65C/wt (CCA/CCA) и смешанных гетерозигот H63D/S65C.
Для выявления взаимосвязи между аллелями с различными интронными гаплотипами использовали опубликованные ранее данные гаплотипического разнообразия локуса HFE человека [Toomajian and Kreitman, 2002]. Метод Dollo parsimony (программа DOLLOP пакета PHYLIP) [Felsenstein, 1989] с параметрами по умолчанию был применён к этим данным для построения эволюционных деревьев. Итоговое дерево было выбрано из 13 с минимальным количеством (15) реверсий при исключении набора взаимосвязанных перестроек в позициях 279, 782, 1436, and 2469 (Acc.no Z92910 из GenBank).
Результаты генотипирования выборок из различных этнических групп Сибири по полиморфизмам C282Y, H63D и S65C гена HFE методом ПЦР-ПДРФ и с помощью секвенирования приведены в табл.5.
Частоты каждой из трёх мутаций гена HFE у русских близки к таковым во многих этнических группах Центральной Европы (Табл. 1, стр. 25). Согласно полученным данным, носителем генотипа C282Y/C282Y, предрасполагающего к развитию наследственного гемохроматоза, является примерно 1 из 750-800 русских. У казахов, алтайцев и нивхов, относящихся к монголоидной расе, а также у финно-угров Западной Сибири, имеющих промежуточные антропологические признаки между европеоидами и монголоидами, замена С282У не была обнаружена. По всей видимости, её частота не превышает 1% в большей части этих популяций. В выборке тувинцев ее частота составила 0.45%, в выборке чукчей - 0,8%. Причем оба выявленных носителя аллеля С282У в чукотской выборке имели в родословной предков из других этнических групп, что может говорить о внесении этих аллелей в данную популяцию вследствие метисации.
Полученные нами результаты для аллеля С282У в монголоидных этнических группах Сибири соответствуют данным для этнических групп Восточной Азии (Табл. 1, стр. 25). Интересным представляется факт отсутствия или крайне низкой частоты этого аллеля у представителей финно-угорских народностей Западной Сибири в то время как у финно-угорских народов Северной и Восточной Европы наблюдаются выраженные колебания его частоты в различных субпопуляциях (0 -5,6%) [Merryweather-Clarke et al., 2000].
У некоторых народностей Сибири достаточно широко представлен вариант H63D, в противоположность восточно-азиатским популяциям, где частота аллеля H63D низка (0,9-3%). Он встречается с частотой 8,1% у казахов, 15,1% у манси и 11,3% у хантов. Полученные для финно-угров частотные показатели по замене H63D соответствуют значениям, характерным для некоторых европейских популяций (Табл.1, стр. 25).
Мутация S65C обнаружена с близкими частотами у русских, чукчей и манси. Ранее она выявлялась только в европеоидных этнических группах с частотами не превышающими 2% (Табл.1, стр. 25).
Соотношение Харди-Вайнберга соблюдается для всех популяций, кроме хантов. Причины его нарушения в данной популяции требуют более детального изучения.
Оценка сцепленности интронных гаплотипов с мутациями C282Y, H63D, S65C гена HFE
Выбранные в ходе популяционных исследований образцы ДНК, а так же образцы ДНК пациентов (непопуляционная выборка), подвергли гаплотипическому анализу по трём интронным полиморфизмам IVS2(+4) t/c, IVS4(-44) t/c и IVS5(-47) a/g гена HFE. Всего было проанализировано 718 хромосом. Полученные данные использовали для анализа неравновесия по сцеплению экзонных мутаций с интронными гаплотипами и для оценки популяционных частот гаплотипов. Результаты гаплотипического анализа даны в табл. 8.
Из табл.8 следует, что во всех образцах с однозначно определяемыми интронными гаплотипами по гену HFE встречаются только 4 из 8-ми теоретически возможных гаплотипа: TTG, СТА, ССА и ТТА. Все остальные наблюдавшиеся случаи не противоречили этому предположению. Из табл. 8 видно, что у 6-ти гомозигот C282Y/C282Y выявлен единственный вариант интронного гаплотипа - TTG. Кроме того, обнаружено 32 гетерозиготы C282Y/WT, имеющие гаплотип TTG/TTG. В этих образцах ДНК мутация C282Y однозначно сцеплена с гаплотипом TTG. Во всех остальных случаях предположение о сцепленности этой мутации с гаплотипом TTG как минимум не противоречит наблюдаемому. 42 исследованные гомозиготы H63D/H63D имеют гаплотип СТА, кроме того, обнаружены 3 гетерозиготы H63D/WT с гаплотипом СТА/СТА. Все остальные наблюдавшиеся случаи не противоречили предположению о сцепленности H63D с СТА. Гомозигот по S65C найдено не было, 3 гетерозиготы S65C/WT имели гаплотип ССА/ССА, кроме того, смешанные гетерозиготы C282Y/S65C и H63D/S65C имели гаплотип TTG/CCA (наиболее вероятно) и СТА/CCA. Это позволило утверждать, что S65C сцеплена с гаплотипом ССА.
Для оценки неравновесия по сцеплению мутаций с гаплотипами по сайтам IVS2(+4)t/c, IVS4(-44)t/c и IVS5(-47)a/g использовали выборки, в которых каждая из мутаций могла быть однозначно сопоставлена с соответствующим гаплотипом. Результаты этой оценки приведены в табл. 9.
Из данных табл. 9 следует высокая достоверность вьшода о сцепленности мутаций C282Y, H63D и S65C с гаплотипами TTG, СТА и ССА, соответственно в обследованных нами выборках населения России.
Во всех проанализированных этнических группах Сибири нами обнаружено только 4 варианта гаплотипов по полиморфизмам IVS2(+4)t/c, iVS4(-44)t/c и IVS5(-47)a/g: TTG, СТА, ТТА и ССА (Табл.8). Исследовавшиеся на сцепление интронных и экзонных полиморфизмов выборки различных этнических групп были изначально обогащены хромосомами с мутациями C282Y, H63D и S65C, поэтому не были случайными. При этом хромосомы WT попадали в эту выборку случайно, что позволило рассчитать популяционные частоты интронных гаплотипов гена HFE в хромосомах WT.
В табл. 10 приведены частоты интронных гаплотипов гена HFE в хромосомах WT в обследованных этнических группах.
При определении частот гаплотипов в популяционных выборках различных этнических групп использовали данные по хромосомам WT (Табл. 10), которые затем пересчитывались с учётом оцененных ранее (Табл. 5) частот аллелей C282Y, H63D, S65C и WT в каждой выборке. Таким образом, с использованием популяционных данных по частотам экзонных полиморфизмов и интронных гаплотипов нами была проведена оценка распространённости аллелей с интронными гаплотипами TTG, СТА, ТТА и ССА в генофондах различных этнических групп Сибири. Результаты приведены в табл. 11.
Гаплотип TTG широко представлен во всех этнических группах Сибири и имеет максимальные значения частоты у финно-угров и чукчей. Самая большая доля гаплотипа СТА (25%) выявлена у русских. В выборках финно-угров и центрально-азиатских монголоидов она ниже. Популяции различаются соотношением аллелей СТА с мутацией H63D и без неё. У русских и казахов они близки, у алтайцев и тувинцев преобладает вариант без мутации, у финно-угров - наоборот с мутацией. Оба обнаруженных носителя гаплотипа СТА у чукчей имели мутацию H63D. Для всех монголоидных этнических групп характерна высокая частота гаплотипа ССА, у русских и финно-угров она существенно ниже (Табл. 11). Приблизительно каждый 6-й русский и каждый 24-й чукча, носители этого гаплотипа, имеют сцепленный с ним полиморфизм S65C, тогда как частоты аллеля S65C в этих этнически отдалённых группах составляют 1.5 и 1.6 % соответственно. По представленности гаплотипа ТТА русские близки к казахам, алтайцам и тувинцам, финно-угры — к арктическим монголоидам.
Этнические группы явно различаются соотношением отдельных генотипов по интронным полиморфизмам гена HFE в соответствии с различающимися частотами гаплотипов. Наименьшей гетерогенностью характеризуются чукчи, у которых практически отсутствуют генотипы с аллелями СТА. Большая часть населения этой популяции имеют генотипы TTG/TTG, TTG/CCA и ССА/ССА с заметным преобладанием гетерозигот. В группе центрально-азиатских монголоидов наиболее часты варианты, содержащие ССА. У русских и финно-угров преобладают генотипы, содержащие TTG (Табл.8, 11)
Таким образом, распределение гаплотипов и генотипов гена HFE этноспецифично, при этом арктические монголоиды (чукчи) отличаются от центрально-азиатских.
![Аллельные варианты генов-кандидатов подверженности туберкулезу у русского населения Западной Сибири [Электронный ресурс]](/i/i/4282/196247.png "Аллельные варианты генов-кандидатов подверженности туберкулезу у русского населения Западной Сибири [Электронный ресурс] Колоколова Ольга Валентиновна")
