Молекулярное маркирование генома перца Рыжова Наталья Николаевна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1.Обзор литературы8

1.1. Род Capsicum Z>: морфологическая, таксономическая и генетическая характеристика. 8

1. Общая морфологическая характеристика рода Capsicum L. 8

2. Систематика рода Capsicum L. 11

3. Эволюцыонно-филогенетические исследования культурных и дикорастущих видов рода Capsicum. Гипотезы происхождения культурных видов перца. 13

4. Происхождение и филогения культурных видов рода Capsicum L. 15

5. Внутривидовой полиморфизм представителей рода Capsicum L . 20

6. L2. Уникальные последовательности генома растений 24

7. 1,3. Характеристика основных семейств генов растительного генома, 26

1.3. L Семейство генов устойчивости растений. 26

1. Общая характеристика семейства генов резистентности. 26

2. Эволюция генов резистентности. 30

1.3.2. Семейство MADS-tox генов. 31

1. Общая характеристика семейства MADS-box генов. 31

2. к АВСмодель» и семейство MADS-box генов. 33

1.3.3. Семейство генов протеинкиназ растений. 35

1. Общая характеристика генов протеинкиназ и их функции. 35

2. Классификация протеинкиназ 37

1.4. Повторяющиеся последовательности генома растений. 39

1.4.1. Фракция высокоповторяющейся ДНК. 40

1. Микросателлитные повторы. 40

2. Хлоропластные микросателлиты 42

43

1.4.2. Фракция умеренноповторяющейся ДНК: гены рРИК и их спейсерные участки

Общая структурно-функциональная характеристика рДНК. 43Согласованная эволюция повтороврДНК. 45

1.4.3. Фракция умеренно-повторяющейся ДНК: мобильные элементы генома растений 1.5. Молекулярные методы анализа растительного генома. 53

CLASS Глава 2. Материалы и методы. 6 CLASS 0

Глава 3. Результаты и обсуждение. 73

3.1. Использование молекулярных систем AFLP-, RAPD- и ISSR- маркирования для исследования генома рода Capsicum. 73

3.1.1. Анализ генома видов и сортов рода Capsicum методом AFLP. 73

1. AFLP-анализ межвидового полиморфизма рода Capsicum 76

2. AFLP-анализ внутривидового полиморфизма рода Capsicum 77

3. Использование метода AFLP для определения филогении видов рода Capsicum . 78

4. Анализ генома представителей рода Capsicum RAPD-методом. 81

5. 3.1.2.1. RAPD-анализ межвидового и внутривидового полиморфизма и определение филогении видов рода Capsicum. 82

6. Анализ генома видов и сортов рода Capsicum методом ISSR-маркирования межмикросателлитных последовательностей. 86

7. . lSSR-анализ межвидового и внутривидового полиморфизма и определение филогении видов рода Capsicum 88

8. Комплексный анализ генетического разнообразия видов Capsicum chinense и Capsicum frutescens с использованием AFLP-f RAPD-, ISSR-систем молекулярного маркирования.

9. Комплексный анализ генома рода Capsicum с использованием AFLP-, RAPD-, ISSR-систем молекулярного маркирования.

3.1.6. Сравнительный молекулярный RAPD-и ISSR~ анализ генетического разнообразия родов Capsicum и Lycopersicon. ^""

3.2. Молекулярный анализ основных адаптивно значимых семейств генов (генов резистентности, MADS-box генов и генов, кодирующих проте инкиназы) у представителей рода Capsicum.

3.2.1. Молекулярный анализ семейства генов резистентности у представителей рода Capsicum 111

3.2.1.1. Общая характеристика полиморфизма RGA-фрагментов видов перца, выявленного при использовании метода NBS-маркирования. 111

3.2.1.2. Использование метода NBS-маркирования для определения филогении RGA-семейства у Capsicum. 113

3.2.1.3. Анализ нуклеотидных последовательностей полиморфных RGA- фрагментов. 115

3.2.2. Молекулярный анализ семейства MADS-box генов и их аналогову представителей рода Capsicum 117

3.2.2.1. Общая характеристика полиморфизма MADS-box содержащих последовательностей генома перца, выявленных при использовании метода MADS-маркирования. 117

3.2.2.2. Использование метода MADS-маркирования для определения филогении семейства MADS-содержащих последовательностей у Capsicum. 121

3.2.3. Молекулярный анализ семейства генов протеинкиназ у представителей рода Capsicum 122

3.2.3.1. Общая характеристика полиморфизма последовательностей генома перца, содержащих киназный домен и выявленных при использовании метода РК-маркирования. 122

3.2.3.2. Использование метода РК-маркирования для определения филогении семейства генов протеинкиназ перца. 125

3.2.3.3. Анализ нуклеотидных последовательностей полиморфных РК- фрагментов. 126

3.3. Молекулярный анализ микросателлитных локусов генома перца. 128

3.3.1. Общая характеристика полиморфизма SSR-локусов хлоропластной ДНК. 128

3.3.2. Детекция полиморфизма ядерных микросателлитных локусов. 132

3.4. Исследование ну клеотидного полиморфизма последовательности гена 5.8S и транскрибируемых спейсерныхучастков (ITS1,1TS2) рибосомной ДНК видов рода Capsicum

Заключение 142

Выводы 146

Приложение 141

Список литературы 158

• Внутривидовой полиморфизм представителей рода Capsicum L
• Использование метода AFLP для определения филогении видов рода Capsicum
• Молекулярный анализ семейства генов резистентности у представителей рода Capsicum
• Молекулярный анализ семейства генов протеинкиназ у представителей рода Capsicum

Введение к работе

Перец (род Capsicum, сем. Solanaceae), наряду с томатом и картофелем, является одной из основных овощных культур, однако, в отличие от последних представляет собой один из наименее исследованных родов этого семейства. Несмотря на то, что 5 из 27, выделяемых на сегодняшний день, видов перца широко культивируются (Pickersgill, 1997), представители рода Capsicum изучены весьма скудно как в генетическом, так и молекулярном плане.

Данные по систематике рода Capsicum весьма противоречивы (Eshbaugh, 1980; Walsh, Hoot, 2001). Со времен появления перца в Европе и до последнего времени систематики не имели единого мнения по поводу критериев, определяющих границы рода и отдельных его видов. Некоторые описывали свыше 100 видов, в то время как другие выделяли лишь несколько видов, составляющих этот род (Eshbaugh, 19S0). Огромное число видовых синонимичных названий возникало из-за того, что многие систематики использовали в своих классификационных описаниях признаки, связанные с морфологией плода (форма, цвет, размер, острота), большое разнообразие которых, в особенности у культивируемых образцов, является результатом отбора из дикорастущих и полукультурных популяций мутантньгх форм перца (Eshbaugh, 1980; Bosland, Votava, 2000).

При отмечаемом фенотипическом полиморфизме рода Capsicum многие виды, тем не менее, имеют перекрывающуюся морфологию, что в первую очередь относится к таким близкородственным таксонам перца как С. arimium, С. Jhttescens и С chinense; С baccatum и С. praetermissum; С. exirnium и С. cardenasiu Часто идентификация, основывающаяся лишь на отдельных данных, как, например, морфологическом анализе, бывает весьма затруднительна. Кроме того, так как барьеры видовой изоляции у Capsicum не строги (Smith, Heiser, 1957; Lippert et a!., 1966; Pickersgil, 1966; Eshbaugh, 19S0; Walsh, Hoot, 2001; Бухаров, 2001), в результате межвидовой гибридизаций особенно близкородственных видов может наблюдаться все разнообразие фенотипически промежуточных форм, что сильно запутывает видовую идентификацию (Eshbaugh, 1980). Исследование запасных

белков семян (Panda et al., 1986) и анализ полиморфизма изозимных локусов у представителей таких видов Capsicum (Jensen et al., 1979) зачастую показывает невозможность четко выделить отдельные таксоны. Схожие трудности в идентификации возникают и при использовании цитологического анализа (Pickersgill, 1979). Все это указывает на необходимость использования дополнительных диагностических методов, в том числе и высокоразрешающих систем молекулярного маркирования.

Помимо изучения филогении рода Capsicum, актуальны вопросы, связанные с анализом внутривидового геномного полиморфизма перца. Генетическое разнообразие внутри таксона имеет, как известно, важное значение, как для генетиков, систематиков, так и для селекционеров.. Эволюционные исследования, таксономические классификации и селекционные схемы базируются на использовании информации о генетической вариабельности таксонов (Prince et al., 1992). Однако, что касается Capsicum, эта тема остается мало изученной.. Большая часть биохимических и молекулярных исследований была сфокусирована в основном на анализе одного из культивируемых видов перца - С. аппиит (Рагал et al, 1998; Prince et al, 1992; Rodriguez et al, 1999), в то время как потенциал биоразнообразия остальных культивируемых видов упускался из виду. Между тем ие исключено, что именно они могут стать полезными донорами агрономически важных свойств, в том числе устойчивости к фитопатогенам и вредителям. Так, например, по данным Pickers gill (1980) среди культурных видов перца Cfrutescens, С. chinense, С baccatum ряд образцов характеризуется устойчивостью к фитофторе, вилту, бактериальной листовой пятнистости, вирусу мозаики огурца и картофельному вирусу Y, а также к другим патогенам. В связи с нестрогими барьерами, межвидовой изоляции у Capsicum (Pickersgill, 1980),. исследование генетических ресурсов дикорастущих видов перца для целей селекции при создании новых улучшенных сортов также может быть весьма актуальным (Тимина, Балашова, 1983; Мамедов, Пивоваров, 2002).

С учетом такой малой исследованности рода, целью данной работы явился комплексный молекулярный анализ генома Capsicum^ который позволил бы, во-первых, оценить потенциал.меж- и внутривидового генетического разнообразия

рода, а так же сравнить его с генетическим разнообразием наиболее близкого ему рода Lycopersicoth И, во-вторых, позволил бы подтвердить таксономический статус каждого образца, а так же определить филогению взятых в анализ культурных и дикорастущих видов перца. Для достижения поставленных целей сформулированы следующие задачи:

1. Используя методы молекулярного мультилокусного анализа,
маркирующие как уникальные, так и повторяющиеся участки генома (AFLP,
RAPD, ISSR) определить уровни межвидовой вариабельности у представителей
рода Capsicum. С помощью AFLP-системы молекулярного маркирования
исследовать внутривидовой полиморфизм основных культивируемых видов С.
аттиит, С. frutescens, С. chinense.

2, С помощью метода домен-направленного маркирования (DDP-profiling)
охарактеризовать полиморфизм последовательностей основных адаптивно-
значимых семейств генов рода Capsicum: семейства RGA-генов, MADS-box генов
и генов протеинкиназ, а также исследовать нуклеотидный полиморфизм
полученных маркерных фрагментов,

3. Охарактеризовать последовательности внутренних транскрибируемых
спейсерных участков (ITS1, ITS2) и гена 5.8S рРНК рибосомного оперона у видов
рода Capsicum.

4. Изучить возможность использования праймеров, разработанных к ядерным микросателлитным локусам генома картофеля и томата, для маркирования генома перца и определить уровни полиморфизма этих локусов у представителей рода Capsicum.

5. Используя метод cpSSR-анализа провести исследования полиморфизма хлоропласта ого генома перца. Описать межвидовой и внутривидовой полиморфизм данного типа маркеров у представителей рода Capsicum.

6. На основе комплексного молекулярного маркирования генома перца
установить филогенетические связи между видами рода Capsicum.

Внутривидовой полиморфизм представителей рода Capsicum L

Представлялось интересным сравнить уровень генетического разнообразия исследуемого рода Capsicum с уровнем полиморфизма рода Lycopersicon как одного из наиболее близкородственных перцу родов из семейства Sotanaceae. Помимо близкородственности, оба рода характеризуются одинаково небольшим числом диплоидных видов.

В RAPD- и ISSR- анализ были взяты 53 представителя практически всех выделяемых на сегодняшний день, 9 видов томата (табл.2.5)- Культурный вид томата L esculentum был представлен наибольшим числом образцов (33), включавшим сорта и разновидности. Ранее ISSR- анализ рода Lycopersicon не проводился, а в RAPD-маркирование не были включены представители всех видов томата (Кочиева и др., 1999),

Для анализа генома видов этого рода был использован приблизительно тот же набор RAPD- и ISSR-праймеров, что и для анализа генома перца (см. глава 2). В результате проведенного анализа было амплифицировано 248 RAPD и 390 ISSR полиморфных ДНК фрагментов, позволивших идентифицировать все исследовавшиеся генотипы. Для каждого вида томата получены уникальные RAPD-, и ISSR-спектры, характеризующиеся своими видоспецифичными фрагментами (рис. ЗЛО) Также выявлен ряд фрагментов, которые присутствовали в спектрах всех анализируемых видов, и которые, по всей видимости, могут считаться родоспецифичными маркерами. Использование предварительно отобранных праймеров позволило детектировать довольно высокий уровень, как межвидового (более 95%), так и внутривидового полиморфизма. При этом, как и ожидалось, уровень различий между популяциями и между сортами был значительно ниже, чем между видами.

На основании статистического анализа выявленных фрагментов для образцов томата были рассчитаны коэффициенты попарных генетических различий. Согласно полученным результатам установлено» что диапазон генетического разнообразия исследуемых видов рода Lycopersicon (0.01-0.49RAPD/0.01-0.471SSR) превышал выявленную генетическую изменчивость у

Capsicum (0.0I-0.29RAPD/0.01-0.3IISSR). При этом максимальные показатели межвидового разнообразия были отмечены» например, для пар видов L.esculentum L.peruvianum (0.30-0.49), L.esculentum - Lparviflorum (0.29-039) и L.parviflorum L.perwianum (0.22-037), LMrsutum - Lperuvianum (0.28-0.43). Внутривидовой полиморфизм для некоторых дикорастущих видов томата был также весьма высоким. Наибольший показатель внутривидовой изменчивости» несмотря на, ограниченность выборки (6), был отмечен для такого преимущественно перекрестноопыляющегося вида томата, как L. peruvianum (0.12-0-32), что согласуется с ранее полученными молекулярными данными огенетической гетерогенности этого вида (Miller, Tanksley, 1990; Alvarez et al, 2001).

Причем генетическая вариабельность образцов L, peruvianum оказалась значительно выше межвидовой вариабельности образцов ряда самоопыляющихся/факультативно самоопыляющихся видов томата L. escuientum, L, cheesmanii L. pimpinellifolium (0.08-0.24 RAPD/0.12-0.22 ISSR). Диапазон генетической вариабельности этих трех видов томата оказался аналогичен уровням межвидового полиморфизма близкородственных видов факультативных самоопылителей перца С baccalum - С praetermissum (0.19-0.23) и С. аппиит - С. chinense - С frutescens (0.15-0.25). Соответственно, внутривидовое генетическое разнообразие видов самоопылителей/факультативных самоопылителей томата {JL escuientum, L. cheesmanii, L. parviflorum, L. pimpinellifolium) было еще меньшим. Межсорговой полиморфизм L. escuientum (0.02-0.08 RAPD/0.02-0.06 ISSR) и С. аппиит (0.01-0-06 RAPD/0,02-0.08 ISSR) был крайне низким и практически одинаковым, что совпало с литературными данными о низком уровене генетической вариабельности геномов культурных L. escuientum и С. агтиит (Klein йаЦ 1991; Williams eta!., 1993; Smulders etal., 1997;Paranet al., 1998). В последующем кластерном анализе RAPD- и ISSR-данных для культурного томата L. escuientum, как и для культурного перца С, аппиит, было показано отсутствие какой-либо корреляции между известными морфологическими признаками исследуемых сортов и образуемыми ими родственными группами. Также не была подтверждена классификация разновидностей культурного томата, основывающаяся на признаках окраски и формы плода.

Таким образом, ISSR- и RAPD-методы молекулярного маркирования были применены для изучения меж- и внутривидового полиморфизма, а также для определения филогенетических отношений у представителей родов, Lycopersicon и Capsicum. Сравнительный анализ результатов показал, что полиморфизм рода Lycopersicon несколько превышает полиморфизм рода Capsicum. Межвидовая и внутривидовая генетическая вариабельность у представителей видов-перекрестников томата существенно выше, чем у видов самоопылителей томата и перца. Межвидовой полиморфизм некоторых близкородственных самоопыляющихся видов томата сравним с межвидовым полиморфизмом видов, составляющих основные генетические комплексы у перца. При этом уровни межсортового полиморфизма как томата, так и перца были одинаково крайне низкими»

Молекулярный анализ основных адаптивно-значимых семейств генов (геноврезистентности, MADS-boxгенов и генов, кодирующих протеинкиназы) у представителей рода Capsicum. Целью данной части работы явилось исследование основных семейств растительных генов у представителей рода Capsicum, Исследование было проведено с помощью новейшей системы молекулярного анализа, так называемой, методики домен-направленного маркирования (DDP-domain directed profiling), которая была разработана в лаборатории Plant biodiversity and identity (РШ, Wageningen, the Netherlands) (Van der Linden et aL, 2004). На основе этого метода для семейств растительных генов, характеризующихся присутствием специфических консервативных доменов (таких как NBS-LLR-домены генов устойчивости, MADS-box-домен гомеозисных генов и специфические домены серш/треонин протеинкиназ) были разработаны его модификации - методы NBS-маркирования (NBS-profiling), MADS-маркирования (MADS-box profiling) и маркирования генов протеинкиназ (РК- profiling). Выбранные для анализа семейства генов - гены резистентности, MADS-box гены и гены протеинкиназ, как было отмечено в гл. 1, вовлечены во многие важные процессы жизнедеятельности растений. В отличие от селективно-нейтральных последовательностей, маркируемых посредством методик AFLP, RAPD, ISSR, SSR, последовательности вышеперечисленных семейств генов являются адаптивно-значимыми, в большой степени подвержены давлению отбора и таким образом, представляют собой совершенно особую часть растительного генома. Исследование генетического полиморфизма генов резистентности, генов MADS-box и генов протеинкиназ у видов рода Capsicum имеет интерес как с теоретических позиции анализа структуры и пластичности генома растений, так и для прикладных целей селекции, а также для характеристики генетических ресурсов при составлении кор-коллекций. Кроме того, представляло интерес определение филогении каждого из этих трех семейств генов и исследование вопроса, в какой степени филогенетическое родство столь адаптивно-важных.

Использование метода AFLP для определения филогении видов рода Capsicum

Классификация протеинкиназ в настоящее время довольно неоднозначна, что вполне ожидаемо, исходя из огромного числа генов (белков), составляющих это семейство. В основу классификации протеинкиназ положено сходство их нуклеотидного (аминокислотного) состава, в том числе наличие, помимо киназного, других доменов, определяющих их функции (Hardie, 1999).

В настоящее время выделяют 4 основных подсемейства протеинкиназ растений {www.kinase.com; pkr.sdscedu): трансмембранные рецепторные киназы (receptor-like cytoplasmic kinases,-RLCK). Это подсемейство протеинкиназ является наиболее представительным у растений (около 700 последовательностей, выделенных преимущественно из генома арабидопсиса ( 85%) (Hardie, 1999; Walker, 1999; pkr.sdscedu). Последовательность этих киназ характеризуется наличием сигнального пептида на N-кошіе белка, протеинкиназного домена на Оконце, а также лиганд-связывающего домена, вызывающего образование гетеродимерных структур, В геноме арабидопсиса идентифицировано, по крайней мере, 18 типов генов RLCK (Satterlee, Sussman, 1998), которые, в свою очередь, подразделяются на ряд подгрупп по присутствию в их последовательностях других функциональных доменов.

У растений наиболее многочисленную группу составляют рецепторные киназы с лейцин-богатыми повторами (LRR) (Hardie, 1999; Braun et ai., 1996; Walker, 1999), LRR-киназы содержат до 25 повторов лейцина, разделенных характерными промежутками (Kobe, Deisenhofer, 1993). К этой группе относятся многие протеинкиназьг, которые связаны с устойчивостью растений к болезням. Так ген Ха21 риса, ответственный за устойчивость к Xanthomonas oryzae, кодирует как киназный каталитический, так и LRR-домены (Stein et ai., 1996). Ген Ptot обусловливающий устойчивость томата к Pseudomonas syringae посредством индуцирования апоптоза в клетках в месте инфекции, как и гомологичный ему на 80% ген Fen, также являются генами рецепторних протеинкиназ. В ответ на фитопатогенную атаку также вовлекаются протеинкиназы Prf и Pti, которые индуцируются белком Pto (Salmeron et al., 1996; Zhou et ah, 1995).

Остальные группы этого подсемейства протеинкиназ растений, несмотря на то, что представлены большим числом последовательностей, охарактеризованы не так полно и не имеют типичных доменных структур - казеиновые киназы, названные так, потому что впервые были выделены с использованием в качестве субстрата белока казеина. Это подсемейство представлено двумя негомологичными подтипами казеиновых протеинкиназ: CKI и CKIL Однако функционально оба подтипа сходны: эти киназы фосфорилируют серин/треониновые аминокислотные остатки в присутствии соседних остатков кислых аминокислот. Роль CKI и СКЇЇ киназ до сих пор не совсем понятна. В настоящее время (март 2004) в базе данных pkr.sdsc.edu представлено всего 19 последовательностей, кодирующих казеиновые протеинкиназы арабидопсиса, локализованные на всех его пяти хромосомах.-нетрансмембранные протеинкиназы в базе данных представлены также довольно многочисленной группой белковых и нуклеотидных последовательностей. Этот класс протеинкиназ является наиболее функционально охарактеризованным у растений. Наиболее представительной является несколько дивергентная группа мытоген-актиеированых протеинкиназ (МАРК МАРКК, МАРККК) объединенных в один каскадный цикл МАРККК—МАРКК—МАРК. Было показано, что МАРК вовлечены в ответ растения на различную гормонопосредованную стимуляцию, В листьях люцерны МАРК-киназы активируются холодовым шоком, водным стрессом и поранением (Hardie, 1999). В клетках листьев томата экспрессия МАРК индуцируется грибными элиситорами или обработкой системином, который, как предполагается, является первичным сигналом в ответе на поранение (Stratmann and Ryan, 1997).

К классу нетрансмембранных киназ относятся также кальцийзависимые протеинкиназы (СРК) (Hardie, 1999; Lindzen, Choi, 1995) и циклинзависимые киназы (CDK)y которые являются одними из ключевых ферментов, регулирующих клеточный цикл, особенно прохождение S-фазы и митоза- (Hemerly et al., 1995; Zhang etaL, 1996). CTR1, A TNI, EDR1, СтРКб - подобные киназы. В эту немногочисленную группу были объединены протеинкиназы по гомологии последовательностей их киназных доменов. У растений наиболее полно охарактеризован клонированный ген CTRl-киназы, продукт которого в норме выключает этилениндуцируемый ответ путем ингибирования присоединения этилена к его рецептору (Hardie, 1999).

Таким образом можно сказать, что за последние 5-8 лет достигнут значительный прогресс в исследовании растительных серин/треониновых протеинкиназ. Были идентифицированы 1286 последовательностей генов протеин киназ растений и, прежде всего, арабидопсиса (более 90%)- Ряд генов, кодирующих растительные протеинкиназы, был клонирован. Описаны обусловленные ими мутантные фенотипы. Однако все еще остаются неизвестными функции большинства киназ. Не идентифицированы их белки-мишени, не определена степень вовлеченности протеинкиназ в цепях сигнальной трансдукции, не известны пути регуляции активности самих киназ. Кроме того, отсутствуют данные о структуре семейства генов протеинкиназ в целом, крайне скудны генетические данные о локализации их на хромосомах. Нет полной информации о копийности генов протеинкиназ определенных классов и наличии псевдогенов. Также отсутствуют данные о степени полиморфизма этих генов и их белковых продуктов у различных видов растений.

Молекулярный анализ семейства генов резистентности у представителей рода Capsicum

В анализ были взяты образцы ДНК 57 представителей рода Capsicum, (табл.

2.4), В качестве праймеров были использованы последовательности, гомологичные двум основным консервативным мотивам NBS-домена: Р-петли и кипазы-2, позволившие маркировать как 34 так и 5 - области RGA. Так, праймеры NBS1 и NBS3 маркировали последовательность Р-петли NBS-домена и обеспечивали амплификацию в 5 -направлении, включающем гюследовательноспи TIR /nonIR доменов. Праймеры NBS5A и NBS6, в свою очередь, были гомологичныпоследовательности мотива киназы-2 и приводили к амплификации RGA-фрагментов, главным образом, включающих 3 -конец NBS-домена (рис. 1.2).

В результате проведенного анализа были получены воспроизводимые спектры RGA-фрагментов для следующих трех комбинации NBS-праймер/фермент: NBSl/Rsal, NBS3/MseI, NBS5A+NBS6/MseL В зависимости от комбинации праймер/фермент с помощью методики NBS- маркирования амплифицировалось от 40 до 70 RGA-фрагментов генома перца. Длины полученных RGAs варьировали в пределах 70-550 п.н. (рис, 3.11). Всего было получено 163 полиморфных RGA-маркера. В результате было показано, что каждый вид перца характеризовался определенным набором RGA-фрагментов, по всей видимости, отражающим специфичность устойчивости отдельных видов перца к патогенам. Детальный анализ RGA-спектров позволил выявить ряд видо- и комплексоспецифичных фрагментов» Так каждый вид преца, за исключением С galapagoense, обладал 2-8 видоспецифичными RGA-фрагментами, отсутствовавшими в спектрах других видов.

Выявленные видоспецифичпые RGA-фрагменты представлены в таблице приложения 3. Ряд обнаруженных фрагментов был специфичен для целых групп близкородственных видов, составляющих генетические комплексы.

RGA-фрагментов присутствовали в спектрах лишь отдельных образцов видов перца (прил-3-)- Большинство из этих фрагментов принадлежат дикорастущим представителям С. аппиит #40, #43, #44, #45 (табл. 2.4), которые в этом исследовании показали неожиданно высокий уровень полиморфизма (82.9%), в то время как показатель межсортового полиморфизма С аппиит составил лишь 28.6%. Столь значительные отличия между RGA-генотипами дикорастущих и культивируемых представителей С аппиит, с одной стороны, показываютограниченность пула генов устойчивости, вовлекаемых в создание сортов, а с другой стороны, выявляют тот генетический потенциал дикорастущих С аппиит, который мог бы быть использован в будущих селекционных работах. Таким образом, метод NBS-маркирования был впервые использован для характеристики генетического разнообразия последовательностей семейства генов Ш устойчивости и их аналогов- Выявленный высокий полиморфизм этих последовательностей может отражать разнообразие существующих генов (типов устойчивостей) к патогенам у различных видов перца, но может быть также вызван лишь точковыми мутациями в сайтах рестрикции одного гена, которые не влияют на изменение специфичности в узнавании патогена, В любом случае полученные данные о представленности RGA-последовательностей у конкретных генотипов Ф позволят более обоснованно подходить к подбору родительских форм при селекционной работе, 3.2. L 2 Использование метода NBS-маркирования для определения филогении RGA-семейства последовательностей у Capsicum. Особый интерес в работе представляло исследование филогении полученных при использовании метода NBS-маркирования последовательностей NBS-LRR семейства генов резистентности и их аналогов у видов рода Capsicum. Для каждой из комбинаций были рассчитаны матрицы генетических расстояний и построены дендрограммы.

Учитывая адаптивность генов резистентности, несколько неожиданным оказался тот факт, что топология RGA-дендрограммы совпадает с топологией дендрограмм, построенных по результатам вышеописанных AFLP-, RAPD- и ISSR-анализов: состав видовых подкластеров, а также кластеры групп видов, представляющих генетические комплексы, у Capsicum практически полностью сохраняются (рис. 3.12)

Вариации касаются лишь положения кластера, сформированного представителями вида С chacoense, который значительно обособляется от других видов. В целом же представители проанализированных образцов перца внутри своих мега-кластеров образуют компактные видовые подкластеры, которые, как правило, не смешиваются с представителями других кластеров. Исключение составили образцы С аппиит #40, #43, #45, что обсуждалось выше, а также #29 и #39(рис.ЗЛ2);

Таким образом, исследование вариабельности RGA-локусов перца согласно результатам кластерного анализа показало, что большинство представителей Capsicum образуют группы, соответствующие видам, а также комплексам близкородственных видов. Выявленное на основе полиморфизма RGA-последовательностей филогенетическое родство таксонов рода Capsicum, в целом конгруэнтно филогении рода, основанной на данных морфологии этих видов, а также данных изоферментного и молекулярного анализов ДНК последовательностей различной природы, составляющих геном

Молекулярный анализ семейства генов протеинкиназ у представителей рода Capsicum

Семейство генов протеинкиназ является одним из обширнейших генных семейств. Белковые продукты этого семейства генов участвуют практически во процессах клетки и характеризуются наличием сходных последовательностей аминокислот в области функционального киназного домена. Ряд праймеров, разработанных на основе этих последовательностей киназного домена, был использован в нашей работе с целью исследования полиморфизма семейства генов, кодирующих лротеинкиназы перца. В результате проведенной работы были получены воспроизводимые спектры РК-фрагментов перца (рис. 3.16 а,6). Длины полученных РК-фрагментов варьировали в пределах 80-450 п.н. Всего при использовании двух комбинации праймер/фермент (PKl-2/Мїе/, PKA/Msel) было получено 105 полиморфных РК-маркера. Генотипы некоторых образцов, исследовавшегося набора, видов перца не были идентифицированы, хотя в целом большинство видов Capsicum были охарактеризованы специфическим набором РК-фрагментов- Исключение составили близкородственные виды комплекса аппиит (С аппиит, С frutescens и С. chinense). Спектры ряда представителей этих трех видов перекрывались, что в результате привело к образованию полиморфных смешанных групп образцов на дендрограмме (рис, 3.17). Доля выявленных с помощью праймеров РК1-2, РК4 видоспецифичных фрагментов была несколько ниже, чем при NBS- и MADS-анализах генома перца (18.1% против 21.5% и 22.5%), Кроме того, для таких видов как С. frutescens С. galapagoense, С ехітіит не было получено ни одного видоспецифичного фрагмента. Наибольшее число видоспецифичных РК-маркеров было идентифицировано для видов С baccatum (5), С praetermissum (4) и С pubescens (4), В отличие от NB5- и MADS-маркирования данный анализ выявил РК-комплексоспецифичные маркерные фрагменты для всех трех генетических комплексов перца, в том числе и комплекса baccatum (3). Число фрагментов, характеризующих индивидуальные образцы в РК-маркировании, было незначительным, пять РК-маркеров принадлежали дикорастущим #40, #43, #44, #45 С. аппиит и один #29 С frutescens (прил.З). В целом внутривидовой полиморфизм РК-последовательностей образцов дикорастущих С. аппиит, аналогично результатам NBS- и MADS-маркирования был высок и составил 83.3%, Низким уровнем внутривидового полиморфизма в сравнении с результатами NBS- и MADS-маркирования характеризовались виды С baccatum и С. chacoense, 1L9 и 17.9% соответственно (табл. 3.3) і Полученные данные о полиморфизме РК-фрагаентов были использованы для филогенетических построений- Как видно из рисунка 3.17, кластеры всех исследовавшиеся видов рода Capsicum сохраняют свою обычную топологию. Также как и при использовании других маркерных систем, образцы перца образуют три несмешивающихся, полиморфных кластера, которые соответствуют трем комплексам видов: комплекс аппиит, комплекс baccatum, комплексpubescens. Исследования полиморфизма семейства РК-генов видов комплекса аппиит показали значительное внутривидовое разнообразие последовательностей протеинкиназ. Образцы таких близкородственных видов, как С. аппиит, С. frutescens и С. chinense образовывали подгруппы, а также отдельные ветви, расположение которых на дендрограмме не соответствовало четкому делению на видовые кластеры. Так, С frutescem был разделен на две подгруппы, одна из которых (#25-27, #67-70) образовывала общую, но не смешанную труппу с большинством образцов С chinense. Вторая группа С frutescens (#23, #24) формировала отдельный подкластер, равноудаленный от первой группы С frutescens и образцов С. chinense. Образец С. chinense #32 показал большее сходство с представителями вида С. аппиит. По результатам других молекулярных анализов данный образец, хотя и несколько дистанцировался от других представителей своего вида, но всегда входил в кластер вида С. chinense. Использование метода РК-маркирования, также как и при применении других маркеров, выявило высокую степень вариабельности геномов дикорастущих С аппиит. фрагментов. С целью более детального изучения природы РК-последовательностей перца, ряд полиморфных фрагментов спектров PKAJMsel были элюированы из геля и секвенированы. Из 22 фрагментов геля Y&AIMsel для 16 (72.7%) были установлены нуклеотидные последовательности, которые содержали на 5 -конце 126 последовательность адаптерного праймера, а на З -конце последовательность, гомологичную праймсру РК4 тем самым показывая специфичность отжига РК-праймера и отсутствие адагггер-адагггерных фрагментов в спектре- Дальнейший компьютерный анализ просеквенированных последовательностей с помощью программ BLAST X и BLAST N обнаружил гомологию для четырех из них (25%) с последовательностями уже известных генов протеинкиназ растений (табл. 3.3) Вместе с тем, пять после довательностей (31%) оказались сходными споследовательностями ретровирусоподобных элементов. У остальных РК-фрагментов программы BLASTX и BLASTN распознавали малопротяженные участки гомологии, прядка 20-30 нуклеотидов, с разнообразными последовательностями, находящимися в компьютерных базах данных. Таким образом, в результате данной части работы были охарактеризованы ЩЦ ряд РК-фрагментов генома перца. Показано, что 25% из них гомологичны уже известным генам протеинкиназ. 31% фрагментов связаны с последовательностями ретровирусоподобных элементов. Для большей части фрагментов не было выявлено значительной протяженной гомологии ни с какими известными последовательностями из баз данных. Можно предположить, что такие фрагменты могут также представлять собой последовательности неизвестных на сегодняшний день генов протеинкиназ или же являться сильно измененными РК-псевдогенами,

Похожие диссертации на Молекулярное маркирование генома перца

Использование молекулярных маркеров для анализа полиморфизма генома перца и оптимизации селекционного процессаСнигирь, Екатерина Андреевна

Молекулярно-генетическое изучение полиморфизма генома огурца посевного (Cucumis sativus L.) и его применение для оценки гибридности семян и маркирования устойчивости к мучнистой росеБайназарова Анна Николаевна