Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 7
1.1. Введение 7
1.2. Спонтанная частота СХО в клетках человека 8
1.3. Влияние индивидуальной чувствительности к химическим мутагенам на индукцию СХО 22
1.4. Сопоставление частот СХО и соотношения митозов в контроле и при действии мутагенов 28
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 34
2.1. Характеристика обследованных групп 34
2.2. Методика проведения эксперимента 34
2.3. Характеристика мутагенов 36
2.4. Методы статистического анализа 42
ГЛАВА 3. Результаты экспериментов 43
3.1. Изучение спонтанного уровня СХО в завистюсти от условий эксперимента 43
3.2. Спонтанный уровень СХО в двух разных возрастных группах 48
3.3. Изучение чувствительности индивидов разного возраста к действию мутагенов 52
3.4. Изучение межиндивидуальных вариаций скорости прохождения клеточного цикла в клетках лиц разного возраста 61
3.5. Изучение корреляционных связей между частотой СХО и скоростью прохождения клеточного цикла в контроле и при действии мутагенов у новорожденных и в группе взрослых доноров 71
Выводы 88
Литература 90
- Спонтанная частота СХО в клетках человека
- Сопоставление частот СХО и соотношения митозов в контроле и при действии мутагенов
- Характеристика обследованных групп
- Изучение спонтанного уровня СХО в завистюсти от условий эксперимента
Введение к работе
Имеется большой фактический материал, показывающий, что многие химические соединения, применяемые в промышленности, сельском хозяйстве, медицине и других областях человеческой деятельности, обладают активным биологическим действием, приводя к различным неблагоприятным последствиям в развитии организма. Доказано, что некоторые химические соединения обладают мутагенными свойствами. Это выдвинуло перед генетиками и другими специалистами задачу по всестороннему изучению данного явления, включая оценку характера и размеров последствий влияния этих факторов на наследственность человека.
Важными моментами в таких исследованиях является выбор моделей для изучения действия химических агентов на наследственный материал и выбор адекватных методов, позволяющих учитывать с большой точностью многообразие генетических эффектов.
В качестве широко применяемой биологической модели являются соматические клетки человека (в основном, периферическая кровь), позволяющие изучать последствия мутагенных воздействий как в условиях "ин витро", так и при прямых воздействиях на организм человека.
Изучение количественных и качественных закономерностей химического мутагенеза у человека требует анализа всех факторов, влияющих на точность оценки химически индуцированных мутационных изменений в наследственном материале. Что касается человека как модели такого рода исследований, то определенное значение в модификации генетических нарушений могут иметь пол, возраст и другие особенности организма.
Сведения о действии химических мутагенов на лиц разного
пола и возраста необходимы для понимания механизмов мутагенеза и для более дифференцированного подхода к оценке действия мутагенов как на отдельных индивидов, так и на популяцию в целом.
Оценку возможных генетических последствий действия факторов внешней среды можно провести при изучении соматических клеток с помощью метода учёта сестринских хроматидных обменов (СХО). Хотя точная природа СХО до сих пор не установлена, учфёт СХО является перспективным методом регистрации мутагенного действия химических веществ (А.НЛеботарев с соавт., 1980; Веек and ОЪе , 1975; Allen and Latt , 1976; Stetka and Wolff , 1976; Lambert and Lindblad , 1980).
Учёт СХО является высокоточным методом, отражающим неблагоприятное действие химических факторов на наследственный материал. В ряде случаев этот тест является более чувствительным, чем учёт хромосомных аберраций или микроядерный тест, и требует меньше усилий и затрат исследователя.
Так как метод учёта СХО находит всё большее применение возникает необходимость его стандартизации.
Для включения этого метода в анализ действия факторов внешней среды при планировании исследований по цитогенетичес-кому мониторингу "групп повышенного риска" должны быть изучены наиболее характерные особенности в количественных закономерностях СХО. В частности, должна быть изучена межиндивидуальная вариабельность в ответ на мутагенное воздействие по тесту СХО.
Целью настоящей работы является изучение распределения индивидов по чувствительности к действию химических мутагенов, оцениваемого с помощью учёта СХО.
Конкретными задачами исследования явились:
Изучение спонтанного уровня СХО в зависимости от условий проведения эксперимента.
Изучение спонтанного уровня СХО в двух разных возрастных группах.
Изучение чувствительности индивидов к воздействию мутагенами разной природы в зависимости от возраста донора.
Изучение межиндивидуальных вариаций скорости прохождения клеточного цикла в нормальных клетках и при действии разных мутагенов в зависимости от возраста.
Изучение корреляций между частотой СХО и скоростью прохождения клеточного цикла в контроле и при действии химических мутагенов у новрожденных и в группе взрослых доноров.
Эти вопросы в той или иной степени разработаны ддя хромосомных аберраций на различных объектах при действии химических мутагенов.
Многочисленные сообщения о межиндивидуальных вариациях в ответе на действие мутагенов позволяют говорить о том, что индивиды статистически реально отличаются друт от друга по чувствительности к химическим мутагенам. Однако анализ такой вариабельности по тесту СХО проводился крайне редко и на очень незначительном экспериментальном материале.
Спонтанная частота СХО в клетках человека
В клетках, обработанных только ВДУ для получения дифференциальной окраски сестринских хроматид, всегда наблюдается спонтанная частота СХО, даже в отсутствии факторов, индуцирующих их.
Спонтанный уровень СХО исследовался во многих работах (К.Н. ЯковеНКО И В.И.Платонова, 1979; Galloway and Evans , 1975; Da-oud et al. t 1976; Morgan and Crossen, 1977).
Уже через некоторое время от начала использования теста СХО было замечено противоречие в оценке спонтанного уровня СХО разными исследователями.
Максимальная частота СХО обнаружена в работе Lambert et al. (1976). Она равна 41,6 обменов на клетку. Минимальная частота СХО равна 4,02 обменов на клетку, согласно данным Ristow and Obe (1978).
Однако в большинстве опубликованных работ обследовано недостаточное количество индивидов при разных экспериментальных условиях, что не позволяет делать окончательные выводы о спонтан НОМ уровне СХО ( Веек and Obe , 1975; Sperling et al. , 1975; Morgan and Grossen , 1977а; Ріпа Net о and Ferrari , 1981; Cihan-gir , 1982). В последнее время уровень исследований по этому вопросу значительно повысился. Наиболее показательными в этом плане являются работы К.Н.Яковенко и В.И.Платоновой (1979), Morgan and Crossen (1977), Morgan and Grossen (1981) .
Частота спонтанных СХО в лимфоцитах человека по данным К.Н. Яковенко и В.И.Платоновой (1979) в среднем составляет 6,52 обменов на клетку при стандартном отклонении 0,956. Авторы обследовали 50 индивидов, у каждого из которых анализировали по 50 клеток. Использованная концентрация ІЩУ равнялась 10 мкг/мл. Средний возраст обследованных равнялся 28,3 года (коэффициент вариации - 36,02 %) в пределах от 2 до 54 лет. Из них было 27 женщин и 23 мужчины.
В работе 1977 года Morgan and Crossen обследовали 50 ИНДИВИДОВ, у каждого из которых анализировали по 20 клеток. Использованная концентрация ВДУ, как и в исследованиях К.Н.Яковенко и В.И.Платоновой составила 10 мкг/мл. Среднее число СХО на клетку по данным этих авторов оказалось равный 7,88, а стандартное отклонение - 1,36, что выше,чем в работе К.Н.Яковенко и В.И.Платоновой.
Не исключено, что несовпадение полученных данных обусловлено популяционными различиями, но возможно, что основная причина заключается в возрастной структуре исследованных популяций и в условиях проведения экспериментов.
В работе Morgan and Crossen (1977) возраст ДОНОРОВ КОЛебаЛ ся от 0 до 85 лет, причём распределение индивидов по возрастным группам было крайне неравномерным (средний возраст равен 33,98 года; коэффициент вариации равнялся 79,99 %).
В работе К.Н.Яковенко и В.И.Платоновой (1979) культивирование продолжалось 96 часов, а ВДУ добавляли за 28 часов до фиксации. А в исследовании Morgan and Grossen (1977) фиксацию проводили на 72 часу с добавлением БДУ за 48 часов до фиксации.
Более ПОЗДНЯЯ работа тех ЖЄ авторов (Morgan and Cross en , 1981)
показала, что средняя частота СХО среди 100 обследованных индивидов составляет 10,98 обменов на клетку при стандартном отклонении 1,71. Средний возраст доноров не указан. В данном исследовании авторы пытались выяснить, какие условия могут влиять на такую разницу в спонтанном уровне СХО. Они обсуждают пять вариантов проведения экспериментов: I. влияние методики окраски сестринских хроматид на частоту СХО; 2. влияние питательной среды; 3. влияние применённой при культивировании сыворотки; 4. влияние сроков культивирования; 5. наличие различий частот СХО при повторных культивированиях крови одного и того же донора.
Было показано, что при различных сыворотках (эмбриональной телячьей, человеческой группы АВ и аутологичной), различных сроках культивирования (48 часов и 72 часа, ЩУ вводили через 24 часа после начала культивирования) и повторного культивирования крови одного и того же индивида частота СХО остаётся в одних и тех же пределах.
Однако применение различных питательных сред может явиться причиной вариабельности частоты СХО у одного и того же донора. Вышеназванные авторы использовали 5 типов питательных сред (обследовалось по 5 человек в каждой группе) и нашли значительные различия в частоте СХО при применении сред Мс Coy 5А и ТС 199 (частоты СХО составили,соответственно,11,76 и 14,04 обменов на клетку).
Сопоставление частот СХО и соотношения митозов в контроле и при действии мутагенов
Материалом исследования являлась цельная периферическая кровь (забор проводили из локтевой вены) здоровых доноров и пуповинная кровь новорожденных детей. Кровь гепаринизировали (20 единиц гепарина на I мл крови) и хранили от нескольких часов до I суток в холодильнике. Перед началом опыта кровь тщательно перемешивали.
Культивирование лимфоцитов проводили по общепринятой методике (Hungerford , 1965).
Соотношение компонентов культуральной смеси было следующим: I часть цельной крови, 3 части сыворотки крупного рогатого скота, 12 частей среды Игла. На каждые 10 мл культуральной смеси добавляли 0,015 мл ФГА "Р" фирмы "Difco ". Культу ральную смесь разливали по 9 мл в бактерицидные пробирки. За 2 часа до фиксации в каждую пробирку вводили колхицин в конечной концентрации 0,5 мкг/мл.
Гипотонизацию культур проводили в течение 7 минут при температуре 37С раствором хлористого калия 0,075 М, подогретым до 37С.
Фиксировали культуры охлажденной смесью ледяной уксусной кислоты и метилового спирта в соотношении 1:3. Смену фиксатора проводили не менее трех раз.
Препараторы готовили следующим образом: на обезжиренные охлажденные стекла наносили несколько капель густой клеточной суспензии, в течение 30 секунд стекло выдерживали на воздухе, а затем проводили один раз через верхнюю часть пламени горелки. Окончательно высушивали стёкла струёй сжатого воздуха. После этого препараты помещали в термостат при 37С на 24 часа.
Дифференциальную окраску сестринских хроматид проводили по методу, предложенному А.Н.Чеботаревым с соавт. (1978).
На 10 минут стекла помещали в водный раствор акридинового оранжевого (концентрация 10"" М), споласкивали водой и высушивали.
Затем препараты покрывали тонким слоем 0,07 М раствора двузамещённого фосфата натрия и облучали 15 минут ультрафиолетовой лампой СВД-І20А на расстоянии 30-40 см. После облучения стёкла промывали проточной водой и обрабатывали насыщенным раствором гидроокиси бария при комнатной температуре в течение 5 минут.
Затем промывали последовательно в 0,1н растворе соляной кислоты, 10$ растворе гидроокиси аммония, проточной воде и высушивали.
Окрашивали 8-9 минут 2% раствором Гимза, приготовленном на фосфатном буфере (рН = 6,8). После окраски препараты шифровали для анализа. Анализ ме-тафазных пластинок проводили с помощью микроскопа " Ergaval " VEB Carl Zeiss, Jena, DDR ПОД Малым (12,5 X 10) И бОЛЫПИМ (12,5 х 100) увеличением.
СХО подсчитывали только в тех метафазных пластинках, которые удовлетворяли определенным требованиям. Основными критериями отбора метафаз для анализа были: чёткость дифференциальной окраски, хороший разброс хромосом, оптимальная спирали-зация, отсутствие продольного наложения больших и средних хромосом, а также любого наложения малых хромосом, количество центромер от 45 до 46. Рис. I.
Если клетка не соответствовала хотя бы одному из указанных критериев, то её не включали в анализ частоты СХО. В мета-фазах подсчитывали число СХО по всем хромосомам. В каждом варианте опытов анализировали по 40 клеток, согласно рекомендациям К.Н.Яковенко и В.И.Платоновой (1979). Среди всех просмотренных клеток разделяли клетки первого, второго и третьего митозов.
В качестве мутагенных агентов в работе были использованы тиофосфамид, митомицин С и фотрин. Рис. 2.
Выбор данных препаратов определялся следующими соображениями: во-первых, количественные закономерности мутагенного действия этих веществ на культуры лимфоцитов здоровых доноров детально изучены; во-вторых, эти препараты вызывают раз личные типы повреждений ДНК; в-третьих, они обладают рядом удобных с экспериментальной точки зрения свойств: легко растворяются в воде, растворе Хенкса и среде Игла, растворы довольно стойки и при температуре 37С не снижают своей цитоге-нетической активности на протяжении нескольких часов (О.П.Кириченко, 1974; К.Н.Яковенко, 1974; С.А.Ажаев, 1974; О.П.Кириченко с соавт., 1976; ishii , 1981).
Тиосфосфамид - триэтилениминотиофосфамид (тиоТЭФ), молекулярный вес - 189,221, содержит три этилениминовые группы, является типичным алкилируюпщм одноцентровым мутагеном. Белый кристаллический порошок. Тиофосфамид применяется для лечения онкологических заболеваний. Это соединение широко используется в патогенетических исследованиях (Ю.Е.Иванова с соавт., 1980; А.Н.Чеботарев и Т.Г.Селезнева, 1979).
Фотрин - 2,2,4,4,6 -пентаэтиленимино-бморфолинощкло-трифосфазатриен, молекулярный вес - 431,382, содержит пять этилениминовых групп, типичный алкилируюший многоцентровой мутаген. Белый кристаллический порошок используется в клинике для лечения лейкозов. Основные закономерности цитогенетичес-кого действия этого препарата изучены ранее (С.А.Ажаев, 1974).
Митомицин С - противоопухолевый антибиотик. Молекулярный вес - 334,3. Порошок фиолетового цвета. Используется в онкологической практике. Обладает значительной цитогенетичес-кой активностью, повышает уровень СХО, Действуя по типу бифункциональных алкилирующих агентов, вызывает образование перекрёстных сшивок ДНК (Latt , 1974; Kato and Shimada» 1975а, Latt et al. , 1975; Perry and Evans , 1975; Ishii , 1981).
Характеристика обследованных групп
Представленный в данной части работы экспериментальный материал основан на анализе двух серий, в которых изучена межиндивидуальная вариабельность химически индуцированных СХО.
В первой части работы обследовано две группы индивидов мужского пола: 5 человек новорожденных и 5 человек взрослых. Средний возраст взрослых доноров составил 24,60 ± 0,81 при стандартном отклонении, равном 1,82. Размах колебаний возраста был от 23 до 27 лет.
В качестве мутагенов были использованы тиофосфамид, фот-рин и митомицин С в концентрациях 10 мкг/мл, 10 мкг/мл и I мкг/мл,соответственно.
Воздействие мутагенными агентами на культуры лимфоцитов проводили на стадии G0 клеточного цикла, т.е. до стимуляции культур ФГА.
Время контакта лимфоцитов с мутагенами составляло I час, после чего мутаген тщательно отмывали с последующей заменой среды на свежую, содержащую ФГА и 5ДУ. Кровь культивировали 72 часа.
В табл. 5 представлены полученные данные по частоте СХО. Как видно из этой таблицы, средняя частота СХО в группе новорожденных детей в контроле составила 9,86 ± 0,25 обменов на клетку, а в группе взрослых - 10,79 ± 0,86.
При действии .тиофосфамида частоты СХО достигли у новорожденных 61,63 + 1,69, у взрослых - 67,40 ± 3,04 обменов на клетку. При действии фотрином средние показатели частот СХО в двух возрастных группах оказались сходными: 25,23 + 0,38 и 25,18 ± 0,75.
Митомицин С индуцировал до 37,96 + 1,84 обменов на клетку у новорожденных и до 39,38 ± 1,59 - у взрослых индивидов.
Применение многофакторного дисперсионного анализа позволило выявить достоверность различий в частоте СХО в двух возрастных группах (табл. 6).
Одновременно с этим обнаружена высокая значимость в различии эффективности в индукции СХО различными мутагенами (Р = 2 КГ ), что объясняется различной природой и концентрацией использованных веществ.
Анализ показывает также, что индивиды высоко значимо отличаются друг от друга по индивидуальной чувствительности к мутагенам по тесту СХО (Р = 0,003).
Дія изучения вопроса о взаимодействии индивидуальной вариабельности частот СХО и типа мутагена поставлена вторая серия экспериментов, а именно, взяты 2 группы практически здоровых индивидов мужского пола по 23 человека в каждой: взрослые доноры в возрасте от 20 до 34 лет и новорожденные дети.
Условия эксперимента и концентрации мутагенов были те же, что и в первой серии. В качестве модельных мутагенов использованы тиофосфамид и митомицин С.
Данные по этому эксперименту представлены в табл. 7 и 8. Как видно из таблиц, группы индивидов очень гетерогенны по частоте СХО как в контроле, так и действии мутагенов. Интересен и тот факт, что имеются различия среди индивидов не только в их ответе на один и тот же мутаген, но и значительные вариации у одного и того же индивида в ответ на различные мутагены. Например, в ответ на один мутаген индивид дает высокую частоту СХО, а в ответ на другой - низкую и наоборот, по сравнению с контролем.
Как показывают данные табл. 7 и 8, в группе новорожденных детей средняя частота СХО в контроле составила 9,77 ± 0,16, а в группе взрослых - 10,51 ± 0,29 обменов на клетку. Колебания индивидуальных значений СХО находятся в пределах от 8,75 + 0,35 до 11,35 І 0,60 у новорожденных и от 8,93 + 0,50 до 14,20 + 0,83 у взрослых.
При действии тиофосфамида частота СХО составляет в среднем 63,71 + 1,28 обменов на клетку при размахе колебаний от 48,33 ± і 1,43 до 73,18 + 1,39 у новорожденных и 65,69 + 1,22 при размахе колебаний от 54,60 + 0,98 обменов на клетку до 75,68 + 1,17 у взрослых индивидов.
При воздействии митомицином С частота СХО на клетку составила в среднем 42,74 + 1,51 у новрожденных (при размахе от 31,98 ± 1,29 до 60,50 ± 1,56); у взрослых доноров - 43,30 + 1,17 СХО на клетку (при размахе от 35,73 + 0,92 до 60,10 + 1,89). многофакторный дисперсионный анализ показал значимую дисперсию среди индивидов по их частоте СХО в контроле и при действии тиофосфамида и митомицина С.
Обобщенные данные по этому анализу представлены в табл. 9. Из таблицы видно, что увеличение выборки обследованных индивидов приводит к более обоснованному ответу на вопрос о связи частоты СХО с возрастом индивидов, межиндивидуальной вариабельностью в чувствительности к действию мутагенов, типом мутагенов, а также взаимодействием мутагенов и возраста доноров: І) в разных возрастных группах воздействие мутагенами вызывало разную реакцию, выражающуюся в различном числе СХО в этих двух груп о пах (Р = 1,15 10 ); 2) индивиды с высокой степенью вероятности отличаются друг от друга (Р = 4,98 »10 40); 3) взаимодействие между типом мутагенов и возрастом доноров высокозначимо (Р = 2,68 10""); 4) взаимодействие факторов мутаген-донор дает возможность сделать вывод о том, что существуют доноры более устойчивые к одному мутагену и менее устойчивые к другому (Р = 6,75. Ю""56).
Изучение спонтанного уровня СХО в завистюсти от условий эксперимента
Изучение межиндивидуальной и возрастной чувствительности к химическим мутагенам, проведенное с помощью учета СХО, дает возможность выявить причины межиндивидуальной вариабельности в ответе на действие таких веществ и определить границы использования метода учета СХО для оценки мутагенного действия факторов окружающей среды.
Результаты анализа полученного в данной работе материала на культурах клеток, необработанных мутагенами (т.н. контрольные клеточные культуры), обнаруживают существенное различие между индивидами двух возрастных групп - новорожденными и индивидами средней возрастной группы (20-34-летними). В частности, средний показатель частоты СХО у новорожденных оказался ниже (9,50 обменов на клетку), чем у взрослых лиц (10,24 обменов на клетку). Частота СХО у индивидов каждой возрастной группы значительно варьирует. Так, например, размах колебаний этого показателя у новорожденных находится в пределах от 6,98 до 11,35 обменов на клетку, у взрослых - от 8,85 до 14,20 обменов на клетку. Заканчивая характеристику результатов анализа контрольных культур, следует обратить внимание на полученные показатели скорости прохождения по циклу клеток индивидов разного возраста, оцениваемой по соотношению числа пройденных делений к моменту фиксации культур. Согласно полученным данным, культуры лимфоцитов индивидов разного возраста гетерогенны по этому показателю. В 72-часовых культурах соотношение первых-вторых-третьих митозов составляет у новорожденных ZI% - 4Q%-- 21$, у взрослых - 46% - 41% - 13$, соответственно.
Иными словами, у новорожденных скорость прохождения клеток по циклу значительно выше (69$ клеток прошли 2-3 митоза), чем у взрослых (54$ клеток прошли 2-3 митоза к 72 часу культивирования).
СХО - гетерогенный показатель, заключающийся в том, что в зависимости от времени обработки культур W и их фиксации, можно регистрировать его разные количественные выражения: при ранних сроках введения ВДУ и фиксации определяется т.н. "общий спонтанный уровень СХО", а при поздних сроках введения БДУ и фиксации культур регистрируется та доля СХО, которая обусловлена внутренними, эндогенными факторами. Разность же данных по частоте СХО, полученных в одной и той же культуре при двух вариантах ее обработки и фиксации, будет отражать уровень СХО за счет внешнесредовых воздействий, т.е. уровень СХО, обусловленный разной чувствительностью хромосом к таким воздействиям.
Если принять эту концепцию разделения спонтанного уровня СХО на две части, предложенную Н.П.Бочковым с соавт. (1984), то нам представилось целесообразным изучить спонтанный уровень СХО при разных условиях культивирования, т.е. разных сроках введения БДУ и фиксации, т.к., если после начала культивирования пройдет один или несколько циклов репликации ДНК, то в отсутствии внешнесредовых воздействий в культуре лимфоцитов, исходный, на момент забора крови, уровень внешнесредовых повреждений будет репарирован и при последующем добавлении БДУ для анализа числа СХО не будет зафиксирован.
Поэтому, при позднем добавлении БДУ в культуры будет фиксироваться только та доля СХО, которая связана с внутренними, биологически обусловленными причинами.
Проведение эксперимента при двух разных ранее описанных схемах введения БДУ и фиксации, позволило нам. подтвердить эту гипотезу.
Действительно, когда W добавляли в начале культивирования, а фиксировали клетки на 72 часу, среднее число СХО на клетку превысило эту же величину на 1,94 обмена в среднем по отношению к опыту, когда ЕДУ добавляли на 48 часу культивирования, а фиксировали клетки на 96 часу. Установлена значимая корреляция между уровнями СХО при этих двух схемах культивирования,
Анализ закона распределения СХО по клеткам для схем I и 2 проведения эксперимента в изученной группе индивидов показал, что это распределение описывается гамма-распределением, что совпадает с данными u.p.Bochkov et ai. (1984).
Это еще раз подтверждает тот факт, что происходит не элиминация клеток с большим числом СХО, а одновременное уменьшение СХО во всех клетках. При статистическом анализе выявлено уменьшение дисперсии (Д=0,4278 и 0,3147,соответственно для схем I и 2 проведения эксперимента), хотя коэффициент вариации (V = 6,7109 и 7,1748,соответственно) остается практически таким же.
Следовательно, можно предположить, что репарация повреждений, давших повышение СХО наблюдается во всех клетках, т.е. нвависимо от первоначального числа повреждений.
Полученные в данной работе результаты подтверждают предположение о возможности накопления внешнесредовых воздействий в процессе жизнедеятельности человека, т.к. обнаружено большее число СХО у взрослых людей, чем у новорожденных.
