Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Литературный обзор. принципы генетической организации систем антигенов у животных 9-41
1.1. Иммуногенетические системы антигенов клеточных мембран 9-14
1.2. Генетика и эволюция мультигенных семейств иммуноглобулинов 14 - 25
1.3. Иммуногенетические системы сывороточных липопротеинов 26 - 32
1.4. Биохимия и иммуногенетика о макроглобулина и С-3, С-4, С-5 белков системы комплемента 33 - 37
1.5. Аллотипы сывороточных белков американской норки и задачи данного исследования 37 - 41
ГЛАВА II. Материал и методы 42 - 50
П.І. Животные 42 - 42
П.2. Образцы сывороток крови 42 - 42
П.З. Аллоантисыворотки норок 42 - 45
П.4. Гетероантисыворотки 45 - 46
П.5. Иммунохимические методы 46 - 48
П.6. Биохимические методы 48 - 50
Собственные исследования
ГЛАВА III. Генетический контроль аллотипов ьрт-системы 51 - 81
1. Генетический анализ 51 - 66
2. Молекулярное распределение аллотипов Lpm7 и Lpm8 и генетическая структура 66 - 81
ГЛАВА ІV. Биохимическое и иммунохимическое изучение lpm-липопротеина 82 - 108
ІУ.І. Выявление Lpm-липопротеина в антигенном и флотационном спектре сывороточных липо-протеинов норки 82 - 88
ІУ.2. Выделение и некоторые свойства Lpm -липопротеина 88 - 109
7. ГЛАВА V. Исслещование взаимоотношений lpm-липо-протеина . - 130
1. Об иммунохимической гомологии Lpm-липо протеина и -макроглобулина 11О - 122
2. Динамика концентраций Lpm-липопротеина и с^2-макРГЛ0<ЗУлина в постнатальном онтогенезе американской норки 122 - 130
8. ГЛАВА VІ. Обсувдение результатов. общие представления о структуре и функции lpm -локуса 131 - 151
9. Выводы 151 - 152
10. Список литературы
- Иммуногенетические системы антигенов клеточных мембран
- Аллотипы сывороточных белков американской норки и задачи данного исследования
- Молекулярное распределение аллотипов Lpm7 и Lpm8 и генетическая структура
- Об иммунохимической гомологии Lpm-липо протеина и -макроглобулина
Введение к работе
Актуальность исследования. Генетические системы аллоантигенов - антигенов, по которым различаются особи, или группы особей одного вида, - открыты у человека, лабораторных и сельскохозяйственных животных. Высокая специфичность иммуногенетических маркеров обусловливает их широкое использование при решении как фундаментальных, так и прикладных вопросов в различных областях современной биологии, медицины, животноводства и ветеринарии (Тихонов, 1967; Петров, 1976, 1982; Баранов, 1981).
Иммуногенетические системы антигенов клеточных мембран
Иммуногенетика оперирует с генетическими системами антигенов, т.е..генетически детерминированными индивидуальными вариациями в тонкой структуре макромолекул, обнаруживаемых в форме различий их антигенных свойств (Петров, 1976; crumpton , 1974).
Исторически ранее других установлены системы антигенов групп крови, которые проще всего выявляются на эритроцитах, хотя и присутствуют на мембранах других типов клеток, а также в некоторых биологических жидкостях организма. Иммунологическая специфичность антигенов групп крови типа АВО и некоторых других обусловлена вариациями углеводных компонентов. Белковыми продуктами генов групп крови этого типа являются гликозилтрансферазные ферменты, которые, модифицируя вещество-предшественник, придают ему специфические свойства. Наследование антигенных факторов в этих системах в большинстве случаев осуществляется по менделевс-ким законам (Бойд, 1969; Hakomori , Kobata , 1974).
Особым типом систем антигенов групп крови, представляющим интерес для генетики, являются сложные полиаллельные системы типа резус ( Rh)y человека. Серология Rh-системы сложна и до сих пор до конца не выяснена. В теоретическом плане Rh- система интересна прежде всего тем, что были сформулированы две гипотезы ее генетической организации. Одна гипотеза предполагает, что Rh-локус представляет собой блок тесно сцепленных генов, каждый из которых имеет серию аллелей ( Race , 1944). Согласно второй гипотезе Rh-локус представляет собой один ген (Wiener , 1943), множественные аллели которого контролируют различия по нескольким антигенам между ними (см. также Доссе, 1958; Бойд, 1969j Race , Sanger , 1968). Какая из этих гипотез верна дляИп- системы не выяснено до сих пор. Однако, с постановкой вопроса именно в такой форме, на определенном, особенно раннем, этапе работы приходится сталкиваться почти всем исследователям, изучающим сложные иммуногенетические системы.
Одной из сложнейших (а может быть и самой сложной) систем антигенов, открытой в экспериментах по пересадкам органов и тканей является главный комплекс тканевой совместимости - МНС ( major histocompatibility complex ). Совместимость по антигенам МНС оказывает решающее влияние на результаты трансплантации. Наличие МНС установлено у всех исследованных в этом отношении видов млекопитающих; наиболее полно они изучены у мышей - система Н-2, и человека -HLA (McDevitt , 1976; Klein , 1979; Klein et al. , I98I;Benacerraf , 1981; Snell, 1981; Dausset , 1981).
В Н-2 комплексе мышей различают 6 областей и около 40 локу-сов ( Klein , 1979; Winoto et al. , 1983). Во многом аналогичным образом устроен МНС у человека (Зотиков, 1982).
По характеристике генов и их продуктов выделяют три класса генов МНС ( Klein , 1979). У мыши к первому классу относятся гены Н-2К, Н-2Д, Оа-2, ТТа, кодирующие полипептиды с молекулярным весом в 44 000. Эти полипептиды одинаково гликозилируются и в ассоциации с #2 шкРглоС Улином прочно связываются с мембранами. К этому же классу относятся некоторые псевдогены Н-2 комплекс са. Среди них есть и такие, которые не имеют дефектов в структуре, однако, тем не менее, не экспрессируются (Pease et al. Д983;
Winoto et ai. , 1983). Ко второму классу относятся гены І-облас-ти. Они кодируют «/-полипептиды с молекулярным весом 34000 и j9-полипептиды с молекулярным весом 29 000. На поверхности клеточной мембраны эти два типа полипептидов объединены в единый антигенный комплекс ( Mathis et al., 1983 а,Ъ; Benoist et al , 1983). К Ш классу относятся гены s -области (рис.1). Гены этого класса кодируют белки с молекулярным весом 185 000- 200 000, синтезируемые в виде единой полипептидной цепи. В процессе дальнейшей протеолитической модификации эта цепь разрезается в двух точках, в результате чего образуется белок, состоящий из -, - и -полипептидных цепей, связанных между собой дисуль-фидными мостиками. Эти белки секретируются в сыворотку крови и являются компонентами (С-4) системы комплемента ( Carroll et al,, 1980; Klein, 1979; Klein et al. , 1981; Snell, 1981; Carroll, Porter , 1983).
Получены разнообразные данные, указывающие на гомологию генов I класса между собой, на гомологию их генам, кодирующим цепь 1-области, на гомологию всех этих генов гену /ь-микрогло-булина и генам иммуноглобулинов (Гурвич, 1978; silver » 1977; Nathenson et al. , 1981; Benoist et al., 1983; Mathis et al., 1983 a , Ъ ).
Имеются достаточные основания предполагать, что все эти гены, совместно с генами T/t-локуса произошли от одного предкового гена, контролирующего межклеточное распознавание (Брондз, Рохлин, 1978 снелл и др., 1979).
Гены I класса экспрессированы практически во всех типах ядро содержащих клеток, исключая ранних эмбрионов. Дифференциальная экспрессия генов П класса и 1-области придает специфичность различным популяциям иммунокомпетентных клеток.
Аллотипы сывороточных белков американской норки и задачи данного исследования
Обнаруженные у человека и лабораторных животных системы ал-лотипов оказались весьма удобным инструментом при изучении многих важных теоретических и прикладных задач современной биологии. С их помощью установлен ряд важнейших закономерностей организации, экспрессии и эволюции генома эукариот. К ним относятся следующие: кодирование одной полипептидной цепи двумя и более генами, аллельное, или "аллотипическое" исключение, алло-типическая супрессия, латентный характер экспрессии некоторых генов, неравновесное сцепление, связь с предрасположенностью к некоторым заболеваниям и др. ( Незлин, 1972; Брондз, Рохлин, 1978; Баранов, 1981, 1982; Сидорова, 1982; Dreyer , Bennet , 1965; Rapacz , 1978; Dray , 1979; Strosberg et al. , 1979; Ke-lus , 1982).
Аллотипия как форма белкового полиморфизма была выявлена у всех видов животных, которых подвергали внутривидои иммунизации (Баранов, 1981). Такого рода эксперименты проводились и на американской норке. В результате было показано наличие в сыворотке крови этого вида аллотипов неидентифицированных белков с подвижностью /3 и ./-глобулинов (Rapacz , Дааіеі-, 1968). Несколько позднее Яника описала три аллотипа сывороточных белков норки, два из которых идентифицированы как принадлежащие 2" гликопРоте"" ину (janicka , 1972).
В 1971 году, на традиционном объекте лаборатории эволюционной генетики животных Института цитологии и генетики СО АН СССР - американской норке (Mustela vison Schr. ), была начата серия аллоиммунизаций с целью выявления и последующего изучения имму-ногенетических систем аллотипов - потенциальных моделей для изучения эволюции генома этого вида. Следует отметить, что американская норка как объект иммуногенетических исследований представляет интерес, по крайней мере, с двух точек зрения. Во-первых, этот вид в значительной степени филогенетически обособлен от традиционных объектов (человек, лабораторные животные, куры), на которых проводятся иммуногенетические исследования. Поэтому, информация об организации гомологичных сютем аллоанти-генов этого вида весьма интересна в плане развития сравнительной иммуногенетики. Во-вторых, ранняя стадия одомашнивания, на которой находится американская норка, является периодом резких генетических изменений, связанных с ускорением микроэволюционного процесса. Известно, что доместицированные виды отличаются от диких форм больше, чем отдельные виды и даже роды (Беляев, 1979). Поиск и идентификация этих отличий, в том числе на уровне белков и кодирующих их генов, - весьма актуальная проблема эволюционной генетики.
В результате многолетних иммуногенетических исследований нашей лаборатории были выявлены восемь аллотипов ИГ, шесть из которых являются маркерами тяжелых полипептидныж цепей G-класса. Вопреки ожиданиям, в результате анализа нескольких тысяч норок, не удалось установить четких закономерностей генетического контроля этих аллотипов. Не выявлены ни сцепленные комбинации аллотипов, ни их аллельные пары, которые следовало ожидать, исходя из обычных представлений о тесном сцеплении генов тяжелых цепей ИГ (см. 1.2). Предполагается, что трудности выяснения генетического контроля и взаимоотношений Сд-аллотипов норки связаны с особенностями регуляции их проявления, латентного и полулатентного характера их экспрессии. По-видимому, американская норка является видом с экстраординарным масштабом популяцію иной распространенности латентных аллотипов и онтогенетической нестабильностью их количественного проявления (Беляев и др., 1983 а). Эволюционным фактором, вызвавшим такой значительный сдвиг нормальной регуляции ИГ у американской норки, может быть дестабилизирующий отбор, наиболее интенсивно действующий и порождающий большой размах изменчивости на ранней стадии доместикации животных.
Молекулярное распределение аллотипов Lpm7 и Lpm8 и генетическая структура
Из результатов исследований, описанных в предшествующем разделе очевидно, что Lpm-система является одной из наиболее слож но организованных систем аллотипов сывороточных белков животных. В таких системах особое значение приобретает выяснение аллелиз-ма и псевдоаллелизма образующих их генов (см. главу I). Прежде всего, необходимо знать, кодируется ли каждая моногенно наследуемая аллогруппа одним геном, или же набором разных тесно сцепленных генов.
Углубления представлений о строении сложных генетических систем можно добиться путем сочетания классического генетического анализа с исследованием молекулярного распределения аллотипов. Сущность такого подхода состоит в том, что если аллотипы находятся на разных молекулах, то они кодируются разными генами, если же они расположены на одной молекуле, то вопрос остается открытым да выяснения деталей субъединичного состава анализируемых белковых молекул (Baranov , 1976).
Ранее выяснен характер молекулярного распределения аллотипов Lpmi , Lpm2 , ЪртЗ » Lpm4 и Ьрт5 . Было установлено, что существуют пять вариантов молекул. Четыре из них имели только по одному маркеру: Lpm1 , Lpm2 , Lpm3 и Lpm4. Не найдено молекул, несущих две и более аллодетерминанты почти у всех исследованных фенотипов. Исключение составляли только образцы сывороток норок с довольно редким геном Lpm2 4»5 (частота 0,0390), у которых аллотипы Lpm2 и Lpm5 всегда находились вместе на одной молекуле. На основании этих данных был сделан вывод о том, что автотипические маркеры Lpmi и Lpm2 аллогруппы Lpm1,2 кодируются разными генами. Тот же вывод сделан в отношении генов, кодирующих марке-, ры ЬртЗ и ЪртЗ аллогруппы Lpm3,4 , Lpm2 и Lpm4 аллогруппы Lpm2,4,5 Аллотип Lpm5 в аллогруппе Ърт2,4,5 может кодироваться и тем же структурным геном, что и Lpm2 , в том случае, если он локализуется на одной с ним полипептидной цепи (Baranov , 1976).
Представлялось интересным выяснить, маркируют ли два новых аллотипических маркера Lpm7 и Ърт8 отдельные варианты молекул, или же они находятся вместе друг с другом, либо в сочетании с каким-либо из первых пяти аллотипов на одной молекуле.
Для выяснения этого вопроса анализировали сыворотки различных фенотипов и генотипов по Lpm-системе (табліща 9). Смесь двух индивидуальных сывороток, содержащих только по одному из исследуемой пары аллотипов, служила контролем на отсутствие молекул, несущих их вместе.
Присутствие или отсутствие молекул, несущих две детерминанты вместе, определяли методом двойной иммунодиффузии. При избранном нами расположении в геле серологических реагентов (рис.5) пересечение линий преципитаций двух сопоставляемых аллотипов указывает на их принадлежность разным молекулам. В противоположность этому, слияние линий преципитаций аллотипов указывает на их принадлежность одной молекуле.
На рисунке 5 представлены результаты такого анализа всех возможных парных сочетаний аллотипов Ърт7 и Lpm8 с остальными Lpra -аллотипами и между собой. У всех исследованных сывороток, а также контрольных смесей, наблюдается четкое пересечение линий приципитации аллотипов. Это указывает на то, что аллодетерминанты Lpm7 и Lpm8 принадлежат отдельным вариантам молекул Lpm , подобно Lpm1 , Lpm2 , Lpm3 и Lpm4. Следовательно, в сыворотке каждой норки Lpm-липопротеин представляет собой пул молекул с разными аллоантигеиными свойствами. Например, норки фенотипа Lpra3,4,8 имеют минимум три сорта молекул: Lpm3 , Lpm4 и Lpm8. У норок фенотипа Lpmi,3,4,8 -представлены четыре варианта молекул: Lpm1 , Lpra3 , Lpm4 И Lpm8.
Об иммунохимической гомологии Lpm-липо протеина и ^-макроглобулина
Для решения задачи данного раздела исследования с помощью кроличьих антисывороток к с/2макРоглобУлинУ человека (К.анти- оС ), к белкам сыворотки человека (К.анти-СЧ) коммерческого производства и набором ранее перечисленных серологических реагентов к сывороточным белкам норки анализировали сыворотки крови взрослых индивидуумов человека, норки, собаки, а также препарат Lpm-липо-протеина. Предварительно выяснили, что К.анти- М реагирует с сывороткой норки, а К.анти-Lpm с сывороткой человека. В реакциях обеих антисывороток перекрестная реакция выражена существенно слабее гомологичной реакции (рис.17).
На рис.18 представлены результаты сравнения К.анти-Lpm с К.анти- оС М между собой в реакции с сыворотками человека, норки и собаки в двойной диффузии. Линии преципитации, сформированные обеими антисыворотками в реакции с сывороткой человека, сливаются друг с другом. Такая картшіа иммунопреципитации говорит о том, что в данной тест-системе К.анти-Lpm эквивалентна К.анти- Х і и что обе антисыворотки реагируют с одним и тем же типом молекул сыворотки человека. Она указывает на наличие в К.анти-Lpm антител к оС человека. Те же антисыворотки (К.анти-Lpm и К.анти-оЛ М) сывороткой норки реагируют по типу "частичной" иммунологической идентичности: в зоне реакции К.анти- М наблюдается четкое раздвоение монолитного преципитата зоны К.анти-Lpm . Аналогичная картина преципитации наблюдается при реакции с сыворот кой собаки той же пары антисывороток. Две линии преципитации в зоне реакции К.анти-сС ДО У сыворотки собаки лучше разделены и четче выражены, чем у сыворотки норки (рис.18 а,б). С очищенным препаратом Lpm-липопротеина К.анти- М не образует достаточно определенной выраженной линии преципитации (рис.18 в,г). Поэтому, "шпора" в реакции сыворотки норки с К.анти-обэМ образована Lpm-липопротеином, а слияние линий преципитации обусловлено реакцией другого норочьего белка с антителами, присутствующими в высокой концентрации как в К.анти-о6?м» так и Б К.анти-Ърт
Незначительная ассиметрия преципитата Lpra (подгиб линии преципитации со стороны лунки с К.анти- М) и Б случае ее реакции с сывороткой норки (рис.18 б), и с препаратом Lpm (рис.18 в) указывает на то, что очень слабая перекрестная реакция Lpm-липопро-теина с К.анти- М все же имеет место. Лучше эта ассиметрия, а следовательно, и перекрестная реакция, выражена в реакции сыворотки собаки с К.анти-с М. Видно, что не только гомолог Lprn-липо-протеина, но и другой белок собаки также сильнее, чем их гомологи в сыворотке норки, реагируют с К.анти- ofgM.
На рис.18 д показана реакция сыворотки норки с К.анти-Lpm и с сконцентрированной в три раза К.анти-СЧ. Как в случае реакции сыворотки норки с парой антисывороток К.анти-Lpm -К.анти-efgM, ли-ния Ьрттолько слегка подгибается со стороны лунки с К.анти-СЧ. Препарат Lpm-липопротеина с К.анти-СЧ реагирует также слабо, как и с К.анти- /2М (рис.18 е). Таким образом, не удается обнаружить более существенно выраженной, чем с К.анти- оС А, перекрестной реакции Lpm-липопротеина норки с антителами ко всей совокупности сывороточных белков человека, даже несмотря на специальное повышение концентрации этих антител путем сгущения К.анти-СЧ.
На рис.19 представлена иммунофореграмма сыворотки крови человека и норки с К.анти-Ьрт . Результаты иммуноэлектрофореза подтверждают, что в описанных выше перекрестных реакциях участвуют именно -глобулины: многократно ранее показано, что Lpm-ли-попротеин имеет с о-подвижкость (Беляев и др., 1974; Баранов и др.,19756). Видно также произошедшее при длительной экспозиции диффузии расчленение иммунного преципитата сыворотки норки на две линии, соответствующие Lpm-липопротеину и другому, сильно перекрестно реагирующему с К.анти- бА 2"ТЛ0 УЛЖЕУ
Абсорбируя К.анти-Lpm небольшим количеством препарата Lpm, удается удалить антитела к собственно Ърглипопротеину и сделать ее моноспецифической к другому /2""ГЛ0 УЛИНУ» шшь несколько понизив концентрацию преципитирующих его антител (рис.20). Кроме того, четкое расслоение иммунного преципитата, сформированного в реакции К.анти-Lpm - сыворотка норки, можно наблюдать при использовании сывороток, в которых изменено соотношение концентраций между Ърга и другим о -глобулином, выявляемым этой антисывороткой (см.У.2).
Линии преципитации аллотипов Lpm сливаются с преципитатом изо-типа Lpm , который сформирован в результате реакции сыворотки норки с К.анти-Lpm (рис.21 а), но аллопреципитаты Lpm пересекают преципитат изотипа другого « -глобулина (рис.21 б-г). Этот результат служит дополнительным свидетельством того, что в реакции сыворотки норки с К.анти-о М участвуют два разных белка, и что наиболее сильную реакцию с К.анти-в ДО дает не Lpm , а другой -глобулин норки.
