Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 11
1.1.. Молекулярная организация и генетическая активность хроматина 11
1.2. ДНК - связанные липиды 13
1.2.1 Взаимодействия липид - ДНК и липид-хроматин (хромосома) 20
1.3. Влияние липидов на генетические процессы 25
1.3.1. Влияние липидов на репликацию ДНК 28
1.3.2. Влияние липидов на транскрипцию 33
1 А. Механизм изменения состава липидов в ядре 35
1.5. Особенности строения и регуляции генов раннего ответа типа с- 38
fas, c-jim, р53
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 46
2.1.Объект исследования 46
2.2; Проведение частичной гепатэктомии [Higgins G.M., Anderson R.M.] 46
2.3.Методика выделения ядер 48
2.4.Фракционирование хроматина 48
2.5.Определение белка [Бредфорд М.М.] 49
2.6.Электрофорез белка по [Laemli U.K.] 50
2.7. Спектрофотометрическое определения ДНК и РНК 51
2.8.Определение содержания ДНК с дифениламином 51
2.9.Выделение ДНК 52
2.10,Постановка ПЦР-амплификация участка ДНК 53
2.11. Выделени е РНК 55
2.12. Амплификация генов раннего ответа с применен иелі обратной транскрипции 56
2.13. Электрофорез ДНК в агарозном геле, 58
2.14. Определение содержания РНК с орцином 58
2.15. Экстракция липидов [Bligh E.G., Dyer W.J.] 59
2.16, Приготовление тонких слоев силикагеля 59
2.17.Фракционирование липидов в тонких слоях силикагеля 60
2.18. Обнаружение и идентификация липидов на хроматограмме 60
2.19. Количественное определение фосфолипидов [Vaskovsky V.E., Kostetsky.E.Y.].
2.20. Количественное определение нейтральных липидов 63
2.21.ТБК-ТЄСТ 63
2.22.Определение диеновых и триеновых коныогатов 64
2.23.Молекулярное моделирование взаимодействия липидов с ДНК 64
2.24. Статистическая обработка 65
ГЛАВА III. Результаты и обсуждение 66
3.1. Активность генетических процессов в хроматине, различающемся связью прикрепления к ядерному матриксу, в печени мышей после частичной гепатэктомии 66
3.2. Особенности спектра липидов фракций хроматине в норме 79
3.3. Особенности перестройки спектра липидов во фракциях хроматина печени после частичной гепатэктомии 85
3.4; Перекисное окисление липидов во фракциях хроматина клеток печени в динамике регенерационного процесса 96
3.5. Моделирование методом молекулярной механики взаимодействий ДНК-липид 104
Заключение 114
Выводы 115
Список используемой литературы
- Молекулярная организация и генетическая активность хроматина
- Влияние липидов на генетические процессы
- Проведение частичной гепатэктомии [Higgins G.M., Anderson R.M.]
- Активность генетических процессов в хроматине, различающемся связью прикрепления к ядерному матриксу, в печени мышей после частичной гепатэктомии
Введение к работе
Актуальность проблемы. Согласно современным представлениям один из уровней регуляции генетической активности ДНК связан с изменением структуры хроматина, дифференциальным позиционированием различных районов хромосом как относительно друг друга, так и ядерной оболочки [Сингер М., Берг П., 1998; Misteli Т., 2001; Gasser S.M., 2002; Parada L., Misteli Т., 2002]. Показано, что на экспрессию генов влияют обратимые перестройки в структуре ДНК, в частности, изменения степени сверхспирализации ДНК и состояния хроматина. При этом активация транскрипции сопровождается переходом высококонденсированного хроматина в менее плотно упакованные формы.
В связи с изменением структуры хроматина и, как следствием, активности генетических процессов, рассматривается регуляторная роль липидов. Имеются данные о том, что липиды входят в состав ДНК, хроматина, хромосом, ядерного матрикса, могут участвовать в регуляции активности генетических процессов: репликации, транскрипции, репарации [Алесенко А.В. и др., 1989; Стручков В.А., Стражевская Н.Б., 2000; Viola-MagniM.P. et al., 2002; David R.J., Nullin D„ 2004; Martclli A.M. ct al., 2005]. Кроме того, в ядре функционируют липидзависимые сигнальные системы в частности, фосфоинозитидный и сфингомиелиновый циклы, метаболиты которых участвуют в передачи сигнала в ядро, влияя на транскрипционную активность генов [Catt K.J. ct al., 1991; Alberto M.et al., 2004; Zaina S et al., 2005; Wooten L.G. et al., 2005].
Вопрос участия липидов в регуляции функциональной активности ДНК на наш взгляд достаточно аргументирован. Однако данных об изменчивости липидов хроматина, различающегося транскрипционной активностью и связью с ядерным матриксом, недостаточно, чтобы детализировать роль
липидов в изменении генетической активности ДНК при регенеративном процессе в ткани печени, для которого характерно разграничение во времени транскрипции и репликации;
Цели и задачи исследования. В этой связи цель настоящей работы состоит в изучении изменчивости липидного компонента хроматина, различающегося транскрипционной активностью и связью с ядерным матриксом, в периоды интенсивной транскрипции и репликации после частичной гепатэктом и и, его роли в изменении генетической активности.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
Во-первых, изучить активность генетических процессов в клетках печени, экспрессию генов раннего ответа типа c-fos, c-jiin, р53 в хроматине, различающемся транскрипционной активностью и связью с ядерным матриксом, в фазы G\ и S после частичной гепатэктомии.
Во-вторых, изучить особенности спектра нейтральных липидов и фосфолипидов в хроматине, различающемся транскрипционной активностью и связью с ядерным матриксом, в норме.
В-третьих, изучить перестройки в спектре нейтральных липидов и фосфолипидов во фракциях хроматина печени в фазы Gj и S после частичной гепатэктомии.
В-четвертых, изучить динамику процессов перекисного окисления липидов во фракциях хроматина в регенерирующей печени в фазы Gi и S после частичной гепатэктомии.
В-пятых, смоделировать взаимодействия индивидуальных липидов с ДНК, с целью выявления специфических особенностей, образующихся липид-ДНК комплексов.
Научная новизна работы. Гены c-fos, c-jiin, р53 в динамике регенерационного процесс в печени включаются последовательно, и включение эти генов в первые часы после частичной гепатэктомии сопровождается снижением выхода из ядер растворимого хроматина.
-б-
Концентрирование протоон ко генов во фракциях растворимого хроматина происходит в результате структурных перестроек хроматина.
Впервые проведено широкое комплексное исследование липидного компонента хроматина, различающегося связью с ядерным матриксом и транскрипционной активностью, позволяющее охарактеризовать участие липидов в регуляции генетических процессов в регенерирующей после частичной гепатэктомии печени белых мышей;
Показано, что эухроматин (Хр-1, Хр-2) и гетохроматин имеют специфические особенности качественного и количественного состава липидов. В фазы Gi и S клеточного цикла в хроматине, различающемся связью с ядерным матриксом, содержание липидов и их спектр изменяется. Специфические перестройки в: спектре липидов эухроматиновых фракций включают в Хр-1 повышение уровня фосфатидилхолипа, лизофосфолипидов, диацилглицерола, уменьшение доли сфингомиелина, в Хр-2 накопление свободных жирных кислот, понижение долей триацилглицерола, эфиров холестерола. В липидном спектре гетерохроматина (Хр-ВС) уменьшается доля кардиолипина, триацилглицерола, специфически возрастают фонды сфиЕігомиелина, фосфатидилсерина, а также лизофосфолипидов. В Хр-ЯМ понижаются уровни эфиров холестерола, лизофосфолипидов, возрастает доля сфингомиелина;
В S-фазе в Хр-1 понижались доли триацилглицерола, сфингомиелина,
кардиолипина, холестерола, суммарных фосфолипидов, накопление
фосфатидилэтаноламна, фосфатидилхолипа, эфиров холестерола. В спектре
липидов Хр-2 понижались доли фосфатидилхолипа, фосфатид ил инозитол а,
исчезали ди- и триацилглицеролы, возрастали доли холестерола,
кардиолипина, сфингомиелина, фосфатидилсерина. В Хр-ВС и Хр-ЯМ в S-
фазе понижались доли фосфатидилхолипа, фосфатидилэтаноламина,
холестерола, диацилглицерола, накапливались сфингомиелин,
фосфатид и л инозитол. Специфические изменения в спектре липидов в Хр-ЯМ
связаны с возрастанием фондов кардиолипина, триацилглицерола, лизофосфолипидов.
Впервые показано, что в периоды интенсивной транскрипции и репликации липиды хроматина характеризуются различной окисляем остью. В эухроматике максимально окисляются фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и фосфатидилинозитол, эфиры холестерола, свободные жирные кислоты. В Хр-ВС и Хр-ЯМ во время репликации интенсивно окисляется кардиолипин.
Липиды обладают разным сродством к бороздкам и нуклеотидным последовательностям ДНК, поэтому изменчивость л ипидов может выступать в качестве механизма регуляции генной транскрипции и репликации.
Положения, выносимые па защиту.
1. Фракции хроматина, различающегося связью с ядерным матриксом и
транскрипционной активностью, имеют специфический липидный состав,
2. Во время транскрипции и репликации в различных фракциях
хроматина спектр л ипидов специфически изменяется, что свидетельствует об
участии липидов в регуляции физиологической активности ДНК.
Важным фактором модификации липидного компонента хроматина в регенерирующей печени белых мышей является процесс перекисного окисления липидов.
Качественные и количественные, перестройки в спектре липидов, появление окисленных форм липидов в хроматине приводят к изменению сродства индивидуальных липидов к определенным последовательностям нуклеотидов бороздок ДНК.
Теоретическая и практическая значимость работы: Проведено комплексное изучение спектра нейтральных липидов и фосфолипидов, окисленность индивидуальных липидов фракций хроматина, различающихся транскрипционной активностью и связью с ядерным матриксом, в печени после частичной гепатэктомии в динамике регенерационного процесса,
имеющего четко выраженные периоды транскрипции и репликации.
Выявлены периоды максимальной экспрессивной активности генов c-fos, с-
jiin, р53, связанные с их перераспределением между фракциями хроматина,
различающегося связью с ядерным матриксом. Смоделированы комплексы
липидов с определенными последовательностями ДНК с целью
доказательства участия липидов в изменении экспрессии генов раннего
ответа. Данные проведенного исследования позволяют по-новому
рассмотреть некоторые аспекты участия липидов в структурно-
функциональной организации хроматина. В регенерирующей печени мышей
качественные и количественные перестройки б спектре липидов,
обусловленные изменением липидного метаболизма, интенсификацией
процессов перекисного окисления липидов могут влиять на конформацию
хроматина и выступать механизмом регуляции генной экспрессии.
Полученные данные имеют теоретическое значение, поскольку позволяют
определить участие индивидуальных липидов в изменении структурной
организации хроматина, его функциональной активности. Важное
теоретическое значение имеет установление роли метаболических
перестроек и процессов пер оксидации липидов в изменении спектра ядерных
липидов.
^ Практическое значение работы заключается в возможности
использования некоторых данных исследования регенеративного процесса в
поврежденной печени в клинике. Выявление периодичности изменений в
липидном спектре, сопряженное с изменением активности процессов
транскрипции и репликации, является важнейшей предпосылкой для
эффективного использования специфических композиций липидов для
ускорения репарационного процесса в печени.
^ Полученные данные могут быть использованы в клинике, учебном
процессе, в таких курсах как генетика, клеточная биология, патофизиология.
»
Апробация работы. Материалы диссертации, были доложены и обсуждены на российских и международных конференциях: международной конференции «Междисциплинарный уровень интеграции современных научных исследований» (г. Анталия, Турция, 2004г.); международной конференции «Современные медицинские технологии диагностика, терапия, реабилитация и профилактика» (г. Умаг, Хорватия, 2004 г.); международной конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине» (о. Крит, Греция, 2004 г.); мелсдуиародный конгресс «Высокие технологии» (г. Париж, Франция, 2004 г.); международной конференции молодых ученых «Современные проблемы науки и образования» (г. Хургада, Египет, 2005 г.); международной конференции «Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии и генетики животных» (г. Саранск, Россия, 2005 г.); на ежегодных Огаревских чтениях (научных конференциях Мордовского государственного университета) (г.Саранск, Россия, 2003, 2004, 2005 г.).
Публикации: По теме диссертации опубликовано 12 работ.
Структура и объем работы: Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц, 33 рисунка, состоит из введения, обзора литературы (I глава), материалов и методов исследований (II глава), результатов собственных исследований и обсуждение результатов исследований' (III глава), выводов и списка используемой литературы. Библиографический указатель включает 279 библиографических источников, в том числе 203 на иностранных языках.
-ю-
Молекулярная организация и генетическая активность хроматина
Согласно современным представлениям хроматин представляет собой сложный нуклеопротеиновый комплекс, содержащий, хотя и в относительно небольших количествах, липиды. Хроматин в среднем содержит 40 % ДНК, 47 % гистонов и 12 % негистоновьгх белков, 0,84 % нейтральных лшшдов, 0,26 % фосфолипидов [Стручков В.А. и др., 1989; 1990; Jones D. et al, 2004].
Структуру хроматина рассматривают на нескольких уровнях его организации. Первоначально хроматин представляет собой цепь нуклеосом. В состав нуклеосом входят октамеры коровых гистонов (НЗ-Н4-Н2А-Н2В) и ДНК длиной около 145 т.п.н., образующая на поверхности октамера 1,7 витка левой спирали [Kornberg R.D. et al., 1999]. По данным электронной микроскопии, кор нуклеосомы имеет вид цилиндра диаметром 11,7 нм со средней высотой около 5,5 нм. Центральное место в октамере занимает тетрамер гистонов (Н3-Н4)2, фланкирующими являются димеры Н2А-Н2А [Arents G.-et al., 1991; Luger К. et al., 1997; Harp J. et al., 2001]. Центральную часть нуклеосомы формируют гистоновые белки, окруженные слоем сильно увлажненной ДНК (отрезок ДНК в 140 пар оснований содержит около 75 % воды) и фрагментами молекул гистонов [Jones D. et al:f 2004]. Гистоновые хвосты представляют собой неупорядоченные N-концевые участки гистонов, выходящие за пределы нуклеосомной частицы. Они обогащены ; положительно заряженными остатками и подвергаются обратным посттранскрипционным модификациям, в частности, ацилированию [Сиволоб А.В., 2002; Luger К. et al., 1997].
Взаимодействие нуклеосомной нити с линкерным гистоном HI приводит к образованию хроматиновой фибриллы толщиной 30 нм,. формирующей в клеточном ядре петли, жестко закрепленные на скелетных структурах ядра (ядерном матриксе) [Збарский Н.Б., 2003; Nickerson J., 2001].
В интерфазном ядре хроматин организован в петлевые домены (50-200 тыс. П,Н.)І которые прикрепляются к ядерному матриксу через определенные последовательности, находящиеся на концах хроматиновой петли (MARs, matrix associated region) [Razin S.V. et al., 1981]. Длинна фрагментов ДНК, имеющих точки прикрепления, не превышает 10 нуклеосом или 2-Ю3 п.н. : ДНК.
Ядерный матрикс включает в себя л амину и внутренний ядерный матрикс, соответствующий нуклеонемам. Ламина представляет собой фиброзный слой ядерной оболочки с поровыми комплексами, внутриядерную фибрилярно-гранулярную сеть [Збарский И.Б., и др., 1991]! Основным компонентом ядерного матрикса являются негистоновые белки (80-90 %), на остальные компоненты, такие как ДНК, РНК, а также нейтральные и фосфолипиды приходится 10-15 %. Ядерный матрикс играет важную роль в инициации транскрипции и репликации ДНК, он содержит большое количество фермента топоизомеразы II, которая, как полагают, участвует в прикреплении ДНК к ядерному скелету [Mirkouitch J. et ah, 1986]. ДНК хроматина остающаяся прикрепленной к ядерному скелету после переваривания рестриктазами или нуклеазами, обогащена транскрибирующими последовательностями и РНК-полимеразой II [Jacson D.A., 1985; DukeR.G. 2004] представляет собой участки размерами 150 п.н., и 10000 п.н,, состоящие из коротких повторяющихся последовательностей, защищенных от нуклеаз. Места стабильного прикрепления хромосом к ядерной ламине и соответственно к ядерной оболочке находятся в области центромеров и/или теломеров.
Установлена связь ядерного матрикса, транскрипционного комплекса и прочно связанных с ДНК белков р60, р50, р43, р37, р31, р27 и р18 кДа.
Несмотря на значительный прогресс в расшифровке различных уровней структуры хроматина, вопросы его структурно-функциональной организационной взаимосвязи изучены недостаточно. Известно, что у эукариот значительная часть генома неактивна в транскрипции и лишь сравнительно небольшую его транскрипционно-активную часть (около 10-15 %) составляет ДНК, локализованная в активном хроматине. Уже в.ранних работах по изучению структуры хроматина, было обнаружено, что активно транскрибируемые участки хроматина по сравнению с неактивными организованы по иному. Активно транскрибируемый хроматин имеет і характерную нуклеосомнуго организацию, а также характерные особенности структуры: повышенную избирательную чувствительность к действию ДНК-азы I и рестрикционных эндонуклеаз, низкую степень компактизации нуклеосом по сравнению с неактивным хроматином [Zaina S. et al., 2005]. Транскрипционно активный хроматин содержит значительно меньшее количество гистона HI, который заменяется негистоновьши белками HMG14 или HMG17 [Weisbrod S. et al., 1980]v Гистоны играют важную роль в процессах транскрипции и репликации, причем их действие может модулироваться фосфолипидами [Hirai P. et al., 1992].
Таким образом, проблеме структурно-функциональной организации і хроматина уделяется большое внимание. В этой связи отметим, что в настоящее время липиды рассматриваются как важный компонент хроматина.
Влияние липидов на генетические процессы
Влияние липидов на генетические процессы актуальными, поскольку позволяют выявить еще одну из сторон регуляции функциональной активности ДНК. Интерес к данной проблеме был вызван данными о том, что для репрессированного генома спермы вьюна, эритроцитов голубя, в отличие от активного, характерен сравнительно низкий процент прочносвязанных нейтральных липидов (свободного холестерола) и фосфолипидов (кардиолипина) (10 % и 24 % соответственно), а также высокое содержание фосфатидилэтаноламина как показали авторы, напрямую связано с отсутствием синтеза ДНК и РНК в этих клетках % [Стручков В. А. и др., 1993; Albi Е. A; et al., 2003].
Показано, что в регенерирующей печени крыс в S-фазе количество холестерола и его эфиров, а также кардиолипина в ДНК увеличивается в 2 раза, диацилглицеролов и фосфатидилэтаноламина в 1,5 раза. В G-фазе количество холестерола, кардиолипина и фосфатидилэтаноламина в ДНК снижается до нормы, и даже ниже, но при этом резко возрастает количество свободных жирных кислот (в 5 раз) и диацилглицеролов (в 2 раза), что может быть связано с усилением процесса деацилирования липидов [ПушкареваМ. Ю. и др., 1991]. В этой связи рассматривается стимулирующая роль этих липидов в репликации и транскрипции [Makisliima М., 2003]. Многочисленные исследования структуры хроматина и нуклеосом in vitro показали, что кислые фосфолипиды (в частности кардиолипин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфатидилглицерол) изменяют конформацию хроматиновых компонентов, что в свою очередь приводит к деконденсациии ДНК, а нейтральные фосфолипиды (фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, сфингомиелин), наоборот, принимают непосредственное участие в конденсации хроматиновых структур [Manzoli F.A. et ai;, 1982; Maraldi N. M. et al, 1984; MartelH A.M. et al., 2002]. Деконденсация хроматина, вызванная фосфатидилсерином и І фосфатидилинозитолом, обусловлена не только дисперсией хроматиновых фабрил, но также переходом от соленоидной к нуклеосомной структуре с потерей гистона HI [Manzoli F.A. et al., 1982; Maraldi N.M. et al., 2003]. Конденсация хроматина, вызванная нейтральными фосфолипидами, мало меняет соотношение соленоид/нуклеосома. Очевидно, что конденсация является результатом компактизациии, немодифицированных фибрилл хроматина [Соссо L. et al., 1986].
Фосфолипиды активно включаются в регуляцию репликации и транскрипции эукариот и прокариот [Maraldi N.M. et al., 2003]. Отрицательно і заряженные фосфолипиды (кардиолипин, фосфатидилсерин, фосфатидилглицерол, фосфатидилиназитол) стимулируют синтез РНК, а фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, сфингомиелин, напротив, ингибируют этот процесс [Maraldi N. М, et al., 1984]. Как известно фосфолипиды в силу своих амфотерных свойств могут модифицировать множество взаимодействий между субстратом и ферментом. Действие кислых фосфолипидов (кардиолипина, фосфатидилсерина, фосфатидилгцицерола, фосфатидилинозитола) на ДНК, гистоновые и негистоновые белки, в конечном итоге на считывание генетического кода зависит от типа этерификации, числа и распределения зарядов полярного участка фосфолипидов [Maraldi N.M. et al., 2003]. Церамиды и сфингозиньї, как правило, оказывают различные эффекты на пролиферацию и дифференцировку клеток, репликацию и транскрипцию jHannunY.A., 1994; Lee J.S. et al., 2001].
Топология ДНК является важным фактором в регуляции транскрипции, репликации и рекомбинации. Показано, что кардиолипин в совокупности с искусственно синтезированным фосфатидилглицеролом содержащим линоленовую кислоту (18:3) в концентрации 0,05 мМ ингибирует активность топоизомеразы I E.coli, кодируемую геном top A [Mizushima Т. et al., 1992]. Однако фосфатидилглицерол с насыщенной стеариновой кислотой (18:0) и фосфатидилэтаноламин не оказывают такого эффекта [TamuraH. et al., 1990];
Кардиолипин и фосфатидилглицерол сильно, а фосфатидилсерин и фосфатидилинозитол слабо ингибируют ДНК-релаксирующую активность, очищенной полимеразы I из асцита Эрлиха [Tamura Н. et al., 1990]. Ингибиторный эффект этих фосфолипидов связан с их прямым взаимодействием с ферментом, а не с субстратом, так как они сами не вызывают релаксацию ДНК [Simbulan C.M.G. et al, 1994]. При этом кислые фосфолшгады регулируют активность не только топоизомеразы I, но и топоизомеразы II.
Проведение частичной гепатэктомии [Higgins G.M., Anderson R.M.]
Операцию резекции печени проводили с соблюдением правил антисептики под поверхностным эфирным наркозом в среднем 15 мин. Разрез длиной 1,5-2,5 см проводился по средней линии живота от мечевидного отростка по направлению к пупку. В операционную зону выводили левую наружную и левую внутреннюю долю печени. На основании выведенных долей накладывали тугую шёлковую лигатуру, после чего выведенные доли отсекали скальпелем (рис. 2.2.1).
Культя печени вводилась в подреберье. Печень после резекции не выступала за края реберной дуги. На операционную рану накладывали швы. Точность удаления печени контролировалась путем сравнивания веса извлеченной во время операции части органа и остаточной части печени, получаемой после забоя животных. Масса удаленной части печени составляла 2/3 от исходной (рис 2.2.1. Ж, 3).
Мышей забивали декашттацией. В контрольной группе животных проводили ложную операцию - лапаротомию (вскрытие стенки брюшной полости без удаления части печени).
Выделение ядер проводили из печени декапетированных животных, охлажденной в ледяном растворе 0,24 М сахарозы. Ткань тщательно измельчали и переносили в гомогенизатор Поттера-Эвельмана и затем фильтровали через 4 слоя марли. Добавляли равный объем буфера, содержащего 0,05 М трис-HCl рН 9,0 с 0,25 М сахарозы, 0,005 М СаС12, 20 мМ NH4CI («Sigma», США), Затем пробы центрифугировали при 1000g в течение 10 мин. Дополнительную очистку ядер проводили в этом же буфере с 0,25% тритоном Х-100. Затем ядра осаждали центрифугированием через 1 М сахарозу при 1000g 10 мин при 4С. При таких условиях выделение и очистка ядер сводиться к минулому неконтролируемая фрагментация ДНК и протеолиз белков [Терентьев А.А. и др., 2001]. Частоту ядерной фракции контролировали при помощи световой фазово-контрастной микроскопии.
Хроматин фракционировали из ядер после кратковременной активации эндогенной Ca /Mg -ДНКазы., Для этого ядра помещали в 0,05 М Tris-HCI буфер, рН 8,0, с 0,25 М сахарозы, 1 мМ СаС12 и 10 мМ MgCl2 [Ходарев Н.Н., Вотрин И.И., 1982]; Через 15 мин инкубации при 30С из ядер экстрагировали хроматин буфером ТМ (10 мМ Tris-HCI, рН 7,5, с 0,2 мМ MgCl2).
После осаждения ядер центрифугированием при 2000g в течение 20 мин при 4С получали первую фракцию растворимого хроматина (Хр-1). После повторной экстракции ядер в ТМ буфере при 30С в течение 20 мин и осаждением при 2000g 20 мин при 4С получали вторую фракцию растворимого хроматина (Хр-2) [Миронова Н.М. и др., 1980].
Затем из ядер экстрагировали хроматин в ТМ-буфере с 2. М NaCl при 4С 20 мин и с последующим центрифугированием при 2000g при 4С 20 минут и получали высокосолевую фракцию хроматина (Хр-ВС). После отмывания остатка в ТМ-буфере, с 1% Тритоном Х-100 и последующим центрифугированием при 2000g в осадке получали конечную фракцию; хроматина связанного с ядерным матриксом (Хр-ЯМ);[Терентьев А.А. и др., 1998].
Реагент Кумаси бриллиантовый синий G-250 готовили растворением 100 мг G-250 («Sigma», США) в 50 мл 95% ЕЮН затем добавляли 100 мл 85% -ной (масса/об.) фосфорной кислоты и доводили водой до 1 л. К ОД мл пробы добавляли 5,0 мл реагента-красителя и хорошо перемешивают. Не ранее, чем через 5 мин и не позднее, чем через 1 час, измеряли поглощение при 595 нм относительно чистого реагента [Гаспаров B.C., и др., 1994],
Для расчета содержания белка использовали калибровочный график, построенный в пределах концентраций от 0,01 до 0,10 мг стандартного образца белка.
Белковый состав препаратов оценивали при помощи электрофореза в присутствии ДЦС-Na в денатурирующих условиях по методу Леммли [Laemmli U.K., 1970] с модификациями.
Использовали прибор для вертикального электрофореза (ячейка для электрофореза МіпІ-PROTEAN, BIO-RAD, Швейцария). Разделение белков проводили в мини-гелях толщиной 0,3 см. В качестве разделяющего геля использовали 15% полиакриламидный гель, а в качестве концентрирующего 7% полиакриламидный гель (табл. 2.6.1).
Активность генетических процессов в хроматине, различающемся связью прикрепления к ядерному матриксу, в печени мышей после частичной гепатэктомии
Исследование динамики матричных синтезов после частичной гепатэктомии у белых мышей показало, что в регенерирующей печени мышей четко разграничены стадии активной транскрипции (1-6 час) и репликации (14-24 часы). Период с 1 по 6 час после частичной гепатэктомии характеризуется ускоренным синтезом белков (рис. ЗЛ.З). При этом уровень белков к 5 часу после гепатэктомии превышает контрольные показатели в среднем 4 раза. Повышение содержания суммарной РНК отмечается к 3 часу регенерации. Резкое возрастание количества ДНК в регенерирующей печени происходит к 21 часу после частичной гепатэктомии. В это же время общее количество РНК и белка снижается по отношению к 3-5 часу, но остается на высоком уровне по сравнению с контролем. Максимальная скорость синтеза ДНК наблюдается через 14-24 часа после частичной гепатэктомии и превышает максимальное значение, зарегистрированное через 5 часов после частичной гепатэктомии в 10-15 раз.
Представленные данные об изменении матричных биосинтезов в регенерирующей печени мышей согласуется с данными научной литературы [Алесенко А.В., Пантаз Э.А., 1989; Куцый М.Н. и др., 1992; Дятловицкая Э.В. и др., 2001; LugerK., 2003].
В печени мышей после частичной гепатэктомии в условиях разобщенного матричного синтеза была исследована динамика экспрессии генов раннего ответа (рис. 3Л.4.).
Наиболее мощная индукция c-fos наблюдается к 3 часу после частичной гепатэктомии. Однако к 14 часу регенерации ПЦР продукты мРНК c-fos не обнаруживаются. Повторный пик продукта амплификации мРНК гена c-fos проявляется к 21 часу после частичной гепатэктомии.
Экспрессия протоонкогена c-jun выражена менее интенсивно, чем у с fos. Максимум его экспрессии также приходится на 1-3 часы регенерации, при этом к 14-21 часу экспрессии не пропадает, хотя и остается на низком уровне.
Продукты амплификации мРНК генов типа c-fos, c-jun, и р53 в клетках печени мышей в различные часы после частичной гепатэктомии. 1-5 треки мРНК гена с-fos ; 6-10 треки мРНК гена c-jun; 11-15 треки мРНК гетр53. Норма - (1,6,11 трек); 1 час -(2,7,12 треки); Зчас (3,8,13 треки); 14 час(4,9,14 трек); 21 час (5,10,15 трек).
Мощная экспрессия протоонкогенов c-fos, c-jun, зафиксированная в первые часы после частичной гепатэктомии происходит на фоне активного синтеза мРНК. Второй менее выраженный пик накопления мРНК c-fos, c-jun наблюдается к 21 часу регенеративного процесса и совпадает по времени с репликативной активностью. Кинетика включения протоонкогенов c-fos, с-jun, наблюдаемая в наших экспериментах, характерна также для клеток, стимулированных фактором роста и для клеток подвергшихся воздействию циклогексемида, хотя последний увеличивает временной промежуток между транскрипцией и репликацией ДНК [Филипова Г.Н. и др., 1989].
Нами отмечено, что для генов c-fos, c-jun в клетках регенерируемой печени мышей характерна двухфазная экспрессия. Эти данные совпадают с результатами работы в которой приводятся данные о двухфазной экспрессии гена с-тус в клетках регенерирующей печени крыс [Thompson N.L. et al., 1989].
Экспрессия протоонкогена р53 выражена слабее и проявляется довольно продолжительное время, как в период стимуляции белкового синтеза, так ив период активной репликации ДНК (рис. 3.1.4).Через 3 часа после частичной гепатэктомии в клетках печени наблюдается достаточно высокое по сравнению с контролем содержание амплифицированных фрагментов мРНК протоонкогена р53. При этом в период репликации: количество мРНК этого протоонкогена находится на высоком уровне, хотя и снижается по сравнению с 3 часом регенерации (рис. 3.1.4).
Таким образом, экспрессия протонкогенов c-fos, c-jun усиливается в печени после часа гепатэктомии. При этом суперэкспресия этих протоонкогенов отмечается в фазе транскрипционной активности. Второй пик экспрессивной активности протоонкогена c-fos совпадает с репликативным синтезом ДНК. В тоже время экспрессия протоонкогена р53 увеличивается через 3 часа, после частичной гепатэктомии и присутствует вплоть до 21 часа регенерации. Полученные - нами данные согласуются с данными научной литературы. В частности Филиппова Г.Н соавторами (1989), разделяет протоонкогены на две группы с различной временной экспрессивной активностью: относя к первой группе c-fos, c-jun, а ко второй р53.
Похожие диссертации на Характеристика хроматина, различающегося транскрипционной активностью и связью с ядерным матриксом, в динамике регенерационного процесса в печени после частичной гепатэктомии
