Содержание к диссертации
Введение
I. УЛЬТРАМИКРОСКОПЙЧЕСКОЕ СТРОЕНИЕ ПОПЕРЕЧНОПОЛОСАТОЙ СКЕЛЕТНОЙ МЫШЦЫ 9
1) Структура сократительного аппарата 9
Актин 10
Миозин 11
Тропомиозин 13
Тропонин . . 13
Роль ионов Са в регуляции сокращения 17
2) Морфология Т-системы и саркоплазматического ретикулума 18
П. ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ СВЕДЕНИЯ О ДЕЯТЕЛЬНОСТИ СКЕЛЕТНЫХ ПОПЕРЕЧНОПОЛОСАТЫХ МЫШЦ 20
Возбуждение 20
Распространение активации внутрь волокон 21
Проблема электромеханического сопряжения 21
III. ИЗМЕНЕНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ КАЛЬЦИЯ ПРИ АКТИВАЦИИ СОКРАЩЕНИЯ И РАССЛАБЛЕНИИ 27
ІV. МЕХАНИЗМ МЫШЕЧНОГО СОКРАЩЕНИЯ 31
Модели механизма генерации силы сокращений .... 35
Методика 42
Результаты исследований 48
Глава I. ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ЛОКАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ СПРОТИВЛЕНИЯ (ВЛИС) В ЦИТОПЛАЗМЕ МЫШЕЧНЫХ ВОЛОКОН ЛЯГУШКИ. . 48
Методика снятия мышечных сокращений 48
Результаты 50
Обсуждение 70
Глава II. ПРИРОДА СТРУКТУРЫ, ОТВЕТСТВЕННОЙ 78
Раздел І.
1. Исследование эффекта ВЛИС после разрушения Т-системы 78
1) Описание метода однородной поляризации 80
2) Оценка емкости мембраны мышечных волокон .... 86
3) Эффект локальных изменений сопротивления в норме
и после детубуляции ' 92
Обсуждение 101
2. Исследование эффекта ВЛИС при подавлении окисли
тельного метаболизма 103
Обсуждение С . 112
Раздел II. Оценка пространственных особенностей струк
туры, с которой связан эффект ВМС 115
Раздел III. Оценка влияния разрушения питоплазматичес-
ких микротрубочек на эффект ВЛИС 129
Обсуждение . 139
Глава III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ВЫЯСНЕНИЕ МЕХАНИЗМА ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА С ПОВЕРХНОСТНОЙ МЕМБРАНЫ МЫШЦЫ ЛЯГУШКИ НА ВНУТРИКЛЕТОЧНУЮ СТРУКТУРУ, ОТВЕТСТВЕННУЮ ЗА ЭФФЕКТ ВЛИС 144
Раздел I 144
Методические особенности 147
1. Эффект ВЛИС при удалении кальция снаружи .... 149
Обсуждение 149
2. Эффект ВЛИС в условиях блокады потенциал-зависи
мой кальциевой проницаемости 151
Обсуждение 170
Раздел П. Влияние внешних факторов на величину внутриклеточных локальных изменений сопротивления . . . 171
1. Влияние изменения рН омывающего раствора на величину эффекта ВЛИС 171
Обсуждение 182
2. Влияние этилового спирта на эффект ВЛИС .... 185
Методические особенности 185
Обсуждение .191
3. Влияние изменения температуры раствора на эффект ВЛИС 193
Методические особенности 193
Обсуждение 200
4. Эффект ВЖС после денервации 201
Методические особенности 201
Обсуждение > 208
Заключение 210
Выводы . 214
Список литературы 216
- Структура сократительного аппарата
- Распространение активации внутрь волокон
- Методика снятия мышечных сокращений
- Исследование эффекта ВЛИС после разрушения Т-системы
- Эффект ВЛИС при удалении кальция снаружи
Введение к работе
В настоящее время в электрофизиологических исследованиях широко применяется метод внутриклеточной'инъекции постоянного тока через стеклянный микроэлектрод, введенный в клетку. Метод часто используется с целью измерения электрических характеристик мембраны (постоянной времени, емкости, сопротивления).
Принято считать, что изменение тока, пропускаемого через микроэлектрод, обуславливающее падение напряжения на мембране, вызывает изменение во входном сопротивлении клетки. При этом исходят из допущения, что внутреннее содержимое клетки играет роль пассивного проводника с постоянным сопротивлением, а наблю-емые изменения сопротивления в цепи микроэлектрода являются результатом изменения сопротивления клеточной мембраны. Вероятно, в большинстве случаев это допущение справедливо. Однако впервые Томита ( Tb^wtiz, 1965), изучая свойства потенциалов, вызванных световой стимуляцией,- в горизонтальных клетках сетчатки карпа, обнаружил градуальные изменения сопротивления в цепи микроэлектрода, сопровождавшие эти потенциалы, которые не могли объясняться изменением сопротивления мембраны. В опытах Томиты при пропускании постоянного тока через внешнюю пипетку коаксиального микроэлектрода и регистрации потенциалов через внутреннюю пипетку, при одновременных сдвигах мембранного потенциала с помощью включения и выключения света, сопротивление цепи микроэлектрода возрастало в ответ на гиперполяризацию, вызванную световой стимуляцией сетчатки, и снижалось на деполяризацию в темноте. Поскольку эти изменения сопротивления развивались значительно медленнее, чем электрическая реакция горизонтальных клеток на свет, Томита сделал вывод, что они являются не причиной, а следствием изменения мембранного потенциала. - 6 ~
Применяя метод внутриклеточной инъекции тока через отводящий микроэлектрод для поляризации мембраны, горизонтальных клеток, Вызов и Трифонов обнаружили изменения сопротивления в цепи микроэлектрода, также не объяснимые за счет изменения сопротивления мембраны (Вызов, Трифонов, 1973). В этих опытах в некоторых случаях гиперполяризационный.ответ горизонтальных клеток на свет сопровождался повышением сопротивления цепи микроэлектрода на величину до 10-80 МОм. Искусственная гиперполяризация клеточной мембраны также вызывала возрастание, а деполяризация - снижение сопротивления цепи микроэлектрода. Прямыми опытами с двойным микроэлектродом в этой работе было показано, что эти изменения сопротивления происходят не в мембране клетки, а локализуются вблизи от кончика микроэлектрода, введенного в горизонтальную клетку. Авторы предположили, что обнаруженный эффект локальных изменений сопротивления обусловлен "затыканием" кончика микроэлектрода какой-то внутриклеточной структурой, сопротивление которой меняется при изменении мембранного потенциала.
Аналогичный эффект локальных изменений сопротивления во время реакции на световое раздражение удавалось наблюдать Г . (Вызов^рисроиоЫЭУЗ) на мюллеровских (глиальных) клетках сетчатки амфибий. Глиальным клеткам в некоторых случаях присуща способность генерировать медленные деполяризационные отклонения потенциала на включение и выключение света; соответственно, сопротивление цепи микроэлектрода снижалось во время этих деполяри-зационных отклонений.
Из всех этих данных можно сделать вывод: в исследованиях, в которых для измерения сопротивления клеточной мембраны используется отводящий микроэлектрод или второй ствол двуствольного микро- электрода, необходимо учитывать возможность локальных изменений сопротивления внутри клетки во время ее электрической реакции.
С другой стороны этот эффект представляет интерес с точки зрения проблемы сопряжения процессов, происходящих внутри клетки, с изменением мембранного потенциала. Применение электрофизиологических методов для изучения активности клеточных органелл могло бы представлять значительный интерес для цитологии.
Среди процессов передачи сигнала от поверхностной мембраны внутрь клетки наиболее изученными являются процессы освобождения медиатора из пресинаптических нервных окончаний в ответ на сдвиги мембранного потенциала, электромеханическое сопряжение в мышцах, изменение скорости движения протоплазмы, вызываемое изменениями потенциала на наружной мембране.
Эффект внутриклеточных локальных изменений сопротивления, происходящих в ответ на сдвиги мембранного потенциала, является неизвестным ранее проявляением связи между мембранным потенциалом и процессами внутри клетки. Обнаружение этого эффекта в таких разных клетках как нервные и глиальные (горизонтальные клетки сетчатки глаза и клетки Мюллера) позволяет предположить, что он может быть обнаружен и в возбудимых клетках другого типа, Имело смысл, очевидно, исследовать этот эффект на таком объекте, для которого хорошо изучен механизм передачи сигнала от мембраны вглубь клетки. Таким объектом является скелетная мышца, в которой электромеханическое сопряжение является объектом интенсивных исследований.
Задачей настоящей работы явился поиск и изучение эффекта внутриклеточных локальных изменений сопротивления в мышечных волокнах.
В диссертации ставились следующие вопросы, которые и выносятся на защиту:
I. Выяснить возможность возникновения в цитоплазме скелетной мышцы эффекта локальных изменений сопротивления в ответ на изменение потенциала наружной мембраны.
П. Если удастся обнаружить эффект локальных изменений сопротивления в цитоплазме скелетной мышцы, попытаться выяснить сущность этого явления и природу структуры, с которой связан этот эффект.
Ш. Исследовать роль внешних факторов, влияющих на свойства эффекта локальных изменений сопротивления, с целью выяснить механизм передачи электрического сигнала с поверхности на структуру, ответственную за данный эффект.
В настоящей работе был сделан подход к решению этих задач. Впервые обнаружен и качественно исследован эффект локальных изменений сопротивления в цитоплазме скелетной мышцы лягушки при изменении потенциала поверхностной мембраны.
Проведено исследование стерических особенностей структуры, ответственной за эффект локальных изменений сопротивления, позволившее оценить ее размеры. Эксперименты по идентификации структуры, с которой связан данный эффект, позволили сделать предположение относительно ее природы.
Результаты проведенных исследований доложены на УШ (Москва, 1977) и IX (Москва, 1978) конференциях молодых ученых биологического факультета МГУ и опубликованы в виде статей (Трифонов, Саты-балдина, Каменская, 1979; Сатыбалдина, 1982; Трифонов, Сатыбалди-на, Каменская, 1982 а, в).
Структура сократительного аппарата
Мышца состоит из множества параллельных мышечных волокон диаметром от 10 до 100 мкм (Шмидт-Ниельсен, 1982) и длиной от нескольких миллиметров до нескольких сантиметров. Волокна, в свою очередь, состоят из более тонких фибрилл диаметром I мкм ( Ьъ&Аъл, &Ь cUL t 1969). В волокне имеются хорошо развитые митохондрии, овальные ядра, лежащие, как и митохондрии, между мио-фибриллами, агранулярная эндоплазматическая сеть (называемая здесь саркоплазматическим ретикулумом).
На продольных срезах через миофибриллу можно видеть чередующиеся темные и светлые полосы, так называемые анизотропные и изотропные диски (А и 1-диски). Полосы расположены в разных миофибриллах на одинаковом уровне, что и создает характерную поперечную исчерченность волокна. В центре А-диска видна светлая зона Н, зависящая от степени сокращения мышцы, и более темная М-полоса. В центре 1-диска отчетливо заметны плотные % -линии.
Единицей структурной организации миофибрилл является сарко-мер - область между двумя линиями & , регулярно повторяющаяся через каждые 2,5 мкм в расслебленной мышце (Шмидт-Ниельсен, 1982).
Миофибриллы состоят из тонких и толстых филаментов. Тонкие филаменты начинаются от % линий и идут от них в обе стороны сар-комера; в промежутки между их конечными участками входят толстые филаменты. С помощью электронного микроскопа {{JMOW C&IJ , 1963; Воде, 1964) были установлены размеры актиновых и миозиновых фи-ламентов: длина миозиновых нитей 1,6 мкм, диаметр 120 А , длина актиновых нитей от одного конца до другого 1,95-2,0 мкм, диаметр 80 A {H Hwc&q , 1963; лЛ іаЛ t 1969). Толстые филаменты, определяющие анизотропию А-дисков, состоят из продольно ориентированных молекул миозина. Тонкая нить скелетных мышц позвоночных состоит из актина в фибриллярной форме, тропомиозина и тропонина. Структуре тонкой нити соответствует молярное отношение тропомиозина, тропонина и глобулярного актина, равное 1:1:7 ((MtUy , ftU M4Mt 1973).
Распространение активации внутрь волокон
Мышечные волокна являются электровозбудимыми клетками, и первая ступень в активации сокращения в норме включает потенциал действия (ЦД), возникающий, когда разность потенциалов мембраны фазных волонон уменьшается от -90 мВ (потенциал покоя) до -50 мВ (порог сокращения) {fadcJLcit, уН0гшІЇс& , I960). ЦД, генерируемый мышечным волокном, распространяется в обе стороны к концам волокна и радиально вглубь мышечного волокна через Т-систему.
Если мышечное волокно активируется прямой деполяризацией с помощью повышенной концентрации ионов калия в растворе, то влечение нескольких секунд мышца сокращается с последующим спонтанным расслаблением несмотря на продолжающуюся деполяризацию. Активация электромеханического сопряжения (ЭМС) для развития максимального механического напряжения происходит в случае фазных волокон Распространение активации внутрь волокон
Существование специфического механизма, проводящего возбуждение внутрь волокна и локализованного на уровне 2 -линий: в фазных волокнах амфибий, было показано в экспериментах с локальной стимуляцией постоянным током через микропипетку различных участков саркомера ( ЛЛщсши, сс сох, , Ш958). Структурой, ответственной за распространение возбуждения внутрь волокна, является поперечная тубулярная система. В настоящее время общепризнанным считается активный механизм распространения сигнала по Т-системе ( Jt.nMjcuuj 1971). Было показано, что электрическая проводимость в поперечных тубулах является регенеративным процессом, качественно сходным с таким же процессом в поверхностной мембране ( С ииши, , 1975). Известно, что ЦД в поперечных тубулах необходим для нормальных сокращений в мышце лягушки при 20 С, но: менее важен при низких температурах ( Вол ісш- ,
/ШІАІСИІЇ , 1974). Это объясняется тем, что при низких температурах продолжительность ПД увеличивается, а длительная деполяризация поверхностной мембраны увеличивает эффективность пассивной деполяризации, распространяющейся вдоль тубул.
Методика снятия мышечных сокращений
Для наших экспериментов было необходимо добиться снятия мышечных сокращений. Чтобы избежать мышечных сокращений в ответ на пропускание постоянного тока через мышцу, было испытано несколько экспериментальных приемов:
а) действие электрическим током подпороговой силы (до 0,5 мА);
б) обработка мышцы раствором новокаина;(2 10 г/мл);
в) растяжение изолированной полоски мышечных волокон;
г) растяжение целой мышцы при инкубации в гипертоническом растворе Рингера с добавлением сахарозы.
Первый прием оказался неудобен тем, что не позволял пропускать через мышцу токи большой силы вследствие развития мышечных сокращений. Поэтому этот метод был использован всего в нескольких опытах и в дальнейшем его не применяли.
Из литературы известно, что новокаин в концентрации 3 10 -5-Ю г/мл подавляет ПД в скелетных мышечных волокнах (Ходоров, Ворновицкий, 1967). Полагают (Ходоров, Ворновицкий, 1967), что действие новокаина связано с его способностью проникать в липо-идные слои мембраны и инактивировать какие-то неравновесные структуры в мембране, которые в покое активно поддерживаются трансмембранной разностью потенциалов и ионами Са. Было показано, что угнетающее действие новокаина на ГЩ обусловлено инактивацией натриевой проницаемости мембраны (Ходоров, Ворновицкий, 1967) и развитием медленной натриевой инактивации , (Ходоров, Пеганов, Шишкова, 1973). В результате этих изменений происходит повышение потенциала покоя, критического уровня деполяризации и порогового потенциала, снижение амплитуды спайка и развитие только градуальных ответов.
Метод фармакологического блока сокращений путем аппликации новокаина применяли в наших опытах с целью разобщения ПД мышечных волокон и сокращений. Однако, поскольку мышца начинала сокращаться, как только достигался порог сокращений, не взирая на отсутствие спайковой активности, этот метод также оказался малоэффективен и не позволял пропускать через мышцу сильные токи. Он был использован также лишь в очень небольшой части экспериментов.
Растянуть целую мышцу в обычном растворе Рингера так, чтобы она не сокращалась даже в ответ на пропускание максимального постоянного тока вдоль мышцы, в наших экспериментах не было возможности, т.к. сухожилие не выдерживало нагрузки и разрывалось. Поэтому часть волокон (примерно 2/3) удаляли, а оставшуюся мышечную полоску использовали в качестве препарата. Часть волокон при препаровке повреждалась, поэтому такой препарат использовали также лишь в части опытов при пропускании не слишком сильных токов через мышцу.
В большей части опытов для снятия мышечных сокращений целую мышцу содержали в гипертоническом растворе Рингера с добавлением сахарозы (344 мМ) и растягивали на 130-150 % относительно исходной длины.
Исследование эффекта ВЛИС после разрушения Т-системы
Известно, что в ответ на деполяризацию мембраны мышечного волокна происходит секреция ионов кальция из цистерн саркоплаз-матического ретикулума в миоплазму. При этом предполагается, что деполяризуется и мембрана цистерн саркоплазматического ретикулума, а значит .меняется их сопротивление (otU&ter , Л/аАа с рса,t 1974; SkJo , 1977).
Мы предположили, что эффект локальных изменений сопротивления в цитоплазме мышечных волокон лягушки отражает изменение сопротивления мембран саркоплазматического ретикулума в ответ на сдвиги потенциала наружной мембраны.
Поскольку передача сигнала с поверхностной мембраны кшате-ральным цистернам саркоплазматического ретикулума в скелетной мышце лягушки осуществляется посредством Т-системы {у Л иУ 1965), можно было ожидать в соответствии со сделанными предположениями, что для воспроизведения эффекта ВЛИС в скелетных мышечных волокнах лягушки необходима сохранность Т-системы. Чтобы проверить это предположение, были поставлены опыты с разрушением Т-системы.
Для разрушения Т-системы применяли метод детубуляции мышечных волокон. Детубуляция мышечных волокон осуществлялась путем предварительной нагрузки их низкомолекулярным неэлектролитом глицерином (400 мМ глицерина в физиологическом растворе) в течение I часа и последующего отмывания препарата обычным раствором Рингера также в течение I часа. Целым рядом авторов было показано, что скелетные мышечные волокна, подвергнутые такой обработке, не способны сокращаться при электрической стимуляции {/ІШ-ЄІІ, еш&# , 1967; / "&? I969; gg ,&Ші А$ , 1969 в; /ксМмЖ Ір , & $& , 1973 в), хотя потенциалы действия нормальной амплитуды могли регистрироваться в таких препаратах ( й й, i W , 1969а; /kcMutfty . % - , 1973 а). Полагают, что потеря мышцей способности сокращаться как в ответ на деполяризацию, так и в ответ на ПД, связана с избирательным разрушением Т-системы и, следовательно, нарушением электро-механического сопряжения (rCMd&Cc , fe tdet? , 1967; (4е МеР t 1969;Д Д , / , 1973 в; Кроленко, 1975).
Электронная микроскопия детубулированных волокон обнаруживает наличие триад без центрального элемента, нарушение целостности мембран трубочек Т-системы, отрыв трубочек от поверхностной мембраны и срастание их в большие округлые, а иногда разорванные везикулы, разбросанные нерегулярно в пределах саркоплазмы (/&ш№ % fa J&b , 1967; /& №$ 1969). Причиной набуха -SOBER и в конечном итоге разрушения Т-системы является выход молекул глицерина в сопровождении воды из волокна в наружную среду при отмывке от глицерина. Сопротивление потоку вдоль тубул ведет к увеличению гидростатического давления, растяжению тубул и, наконец, отрыву трубочек от поверхностной мембраны {$ими лш 0#А1 1973 в; Кроленко, 1975).
Известно, что при детубуляции изменяются пассивные электрические свойства мембраны мышечных волокон, в частности, уменьшается емкость (6 f& , Щек&Щ , 1969 а; Х) Мш (k%& , 1973 a; fa ffkh 9A/afyb A. , 1972). В наших опытах контролем на разрушение Т-системы служило снижение емкости мембраны в детубулированных препаратах. Для оценки емкости мембраны в экспериментах был использован метод однородной поляризации мембраны постоянным током, пропускаемым через внеклеточные электроды (Трифонов, Чайлахян, 1975).
В контрольных опытах мышцы содержались в гипертоническом растворе Рингера с сахарозой. Отмывающий раствор Рингера был всегда без сахарозы. В нескольких опытах использовали отмывающий раствор Рингера с повышенным содержанием ионов Са+ и Мо.+ (5 мМ) с целью увеличить МП. Состав этого раствора был следующим (мЭД/л)://аС& - 115; КС& - 2,5; СаС&2 - 5; MgQ 2 - 5; 0,02 М трис-НС буфер, рН = 7,3 (модифицировано по иш&Щ , lUiMt , Vauafouu , IWI).
class5 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ВЫЯСНЕНИЕ МЕХАНИЗМА ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА С ПОВЕРХНОСТНОЙ МЕМБРАНЫ МЫШЦЫ ЛЯГУШКИ НА ВНУТРИКЛЕТОЧНУЮ СТРУКТУРУ, ОТВЕТСТВЕННУЮ ЗА ЭФФЕКТ
ВЛИС class5
Эффект ВЛИС при удалении кальция снаружи
Было поставлено два опыта по изучению влияния удаления кальция снаружи на эффект ВЖС. В одном из опытов мышца, предварительно отпрепарированная с венера, инкубировалась до опыта в течение 20 часов при температуре 5-7 С (рис.33). Оба опыта ставили при комнатной температуре 20 С. В двух опытах эффект ВЖС сохранялся, что можно видеть из рис.32 и рис.33. Обсуждение
Концентрация примеси ионизированного кальция в бескальциевом растворе с I мМ ЭГТА в опытах Черандини и Стефани (CIuCL-XJkMxtiul , A&Lb 0 , 1973) составила 3«10 М. Вероятно, можно принять, что и в наших опытах концентрация примеси ионов кальция была близка к этой цифре, либо несколько выше за счет кальция; содержащегося в солях. В то же время, концентрация свободных ионов Са в саркоплазме покоящейся мышцы не может превы-шать ЮМ при общем содержании Са в большинстве скелетных мышц от 1-Ю"3 до 2-Ю"3 М ( НаААЛ і&егі, 1964; Бендолл, 1970). Основная часть из общего содержания кальция в скелетной мышце связана с актином, миозином и тропонином - до 1,2-10" моль/кг (для скелетной мышцы кролика, Бендолл, 1970). Принято считать, что только около 0,4 10 моль/кг Са из общего количества, связанного с основньми структурами, могут легко обмениваться и удаляться кальциевым насосом (Бендолл, 1970). Из приведенных цифр
