Содержание к диссертации
Введение
CLASS ГЛАВА 1. Обзор литературы CLASS 9
1.1. Особенности поддержания иммунного гомеостаза человека в условиях Севера 9
1.2. Участие гистамина в регуляции иммунологической реактивности 13
1.3. Участие серотонина в регуляции иммунологической реактивности 20
CLASS ГЛАВА 2.Материалы и методы исследования 2 CLASS 4
2.1. Общая характеристика обследуемых лиц 25
2.2. Иммунологические методы исследования 25
2.3. Статистическая обработка 28
CLASS ГЛАВА 3. Результаты исследования и их обсуждение 2 CLASS 9
3.1. Общая характеристика иммунного статуса обследуемых мужчин 29"
3.2. Влияние гистамина на иммунологическую реактивность 41
3.3. Влияние серотонина на иммунологическую реактивность 69
Заключение 87
Выводы 98
Практические рекомендации 100
Список литературы 101
- Особенности поддержания иммунного гомеостаза человека в условиях Севера
- Участие гистамина в регуляции иммунологической реактивности
- Общая характеристика обследуемых лиц
- Общая характеристика иммунного статуса обследуемых мужчин
Введение к работе
Актуальность исследования. В настоящее время существенный интерес для экспериментальной и теоретической физиологии, иммунологии и биохимии представляет освещение вопросов функционального взаимодействия вазомоторных аминов (гистамина и серотонина) с иммунологическими факторами регуляции, а также возможность использования данных медиаторов для направленного воздействия на метаболические процессы в организме [21, 40] .
Гистамин (5Р-имидазолилэтиламин) является одним из важнейших медиаторов человека, который. изучен- в основном на начальных стадиях анафилактических реакций. Гистамин присутствует во всех тканях,организма, преобладая в- метахроматических гранулах тучных клеток и базофилов [82, 104, 141]. Здесь вещество хранится в неактивном, связанном» состоянии и высвобождается, когда это- необходимо. В клетках периферической крови, гистамин обновляется медленно, однако заметный оборот последнего наблюдается в тканевых клетках, особенно интенсивен этот процесс в тканях ЦНС и желудочно-кишечного тракта.
Известное физиологическое действие гистамина проявляется в сокращении гладких мышц и повышении проницаемости сосудов, что достигается расширением терминальных артериол и сужением посткапиллярных венул. Кроме того, медиатор индуцирует секрецию кислоты в желудке [85].
Вначале считалось, что в иммунном ответе гистамин играет лишь ролы медиатора реакции гиперчувствительности немедленного типа. Но оказалось, что гистамин может ингибировать высвобождение лизосомальных ферментов из сегментоядерных лейкоцитов, угнетать дегрануляцию тучных клеток и базофилов, а также продукцию белков системы комплемента мононуклеарными фагоцитами [192]. Единичные публикации касаются изменения фенотипа лимфоцита под влиянием гистамина (CD4+ на CD8+) и повышении Fc-рецепторной активности [85]. Накапливаются данные о-том, что Т-лимфоциты могут усиливать биосинтез гистамина и его секрецию через интерлейкины [219].
Биологическое значение этих столь различных эффектов гистамина еще предстоит выяснить. Не известно также, как влияет данный медиатор на различные этапы иммунного» ответа и при различных дефектах иммунной защиты., •
Серотонин (5-гидрокситриптамин) содержится, в тромбоцитах и энтерохромаффинных клетках пищеварительного тракта, а также в- тучных клетках и базофилах [201, 211]. Секретированный серотонин быстро метаболизируется моноаминоксидазами. Влияние серотонина на сокращение гладкой мускулатуры и проницаемость сосудов подобно действию гистамина не не столь сильное. Серотонин может вызвать лихорадку и диарею. Также-медиатор усиливает реакцию- гиперчувствительности немедленного типа, вызванную гистамином, и, возможно, пролонгирует его влияние. Предполагается, что серотонин стимулирует миграцию- лейкоцитов1 через, сосудистую • стенку. Имеются сведения об увеличении чувствительности мононуклеаров к факторам хемотаксиса, а также о стимуляции синтеза факторов хемотаксиса Т-лимфоцитами [111].
Все вышеперечисленное является весомым основанием для включения указанных медиаторов в исследовательскую работу. Кроме того, выбор гистамина и серотонина для изучения обосновывается еще и тем, что эти биологически активные вещества быстро меняют свою концентрацию под воздействием различных факторов, в том числе неблагоприятных климатических и профессиональных факторов; напряженной физической работе, а также в зависимости от социальных условий жизни [49, 102].
Цель и задачи исследования. Цель работы - выяснить роль вазомоторных аминов (гистамина и серотонина) в регуляции иммунологической реактивности, развитии приспособительных и компенсаторных реакций иммунной системы и сохранении резервных возможностей человека.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Установить роль вазомоторных аминов в активности фагоцитарной защиты у практически здоровых людей, родившихся и проживающих на Севере.
2. Исследовать влияние вазомоторных аминов на процессы активизации и апоптоза лимфоцитов, а также цитокиновый профиль.
3. Установить особенности влияния повышенных концентраций гистамина на иммунологическую реактивность.
4. Изучить характер иммунологических сдвигов при низком содержании-гистамина в крови.
5. Выяснить механизм взаимосвязи содержания гистамина, серотонйна и процессов антителообразования.
Положения, выносимые на защиту. 1. Гистамин и серотонин регулируют активность клеточных механизмов иммунитета, снижая содержание активированных клеток и уровень их апоптоза. 2. Влияние вазомоторных аминов на цитокиновый профиль проявляется снижением концентраций провоспалительных цитокинов и повышением активности противовоспалительного цитокина IL-10. 3. Вазомоторные амины регулируют содержание сывороточных IgE и IgA, не влияя на инициальный синтез антителообразования.
Научная новизна работы. При исследовании иммунологических показателей крови практически здоровых людей, родившихся1 и проживающих на Севере, впервые выявлено снижение содержания TNF-a и увеличение количества IL-10 под влиянием гистамина и серотонйна. Впервые обнаружено, что снижение уровня гистамина влечет за собой ингибицию лимфопролиферации, пролиферации иммунокомпетентных клеток на фоне усиления клеточно-опосредованной цитотоксичности. Выявлено, что повышенные концентрации гистамина и серотонйна ассоциируются с увеличением содержания реагинового компонента и значительным дефицитом лимфоцитов CD4+. Установлено снижение уровня зрелых Т-лимфоцитов с подавлением активности их апоптоза под воздействием гистамина и серотонина.
Научно-практическая значимость исследования. Материалы диссертации рекомендуются для использования в учебном процессе на кафедрах физиологии, клинической иммунологии и биохимии высших учебных заведений, а таюке в научно-экспериментальных исследованиях в области иммунологии.
При исследовании уровня гистамина и серотонина средние их концентрации и границы колебаний, могут быть использованы в качестве нормативов, содержания изучаемых вазомоторных аминов у человека в различных состояниях. Установленные механизмы влияния гистамина и серотонина-на параметры иммунитета позволят уточнить тактику лечебных мероприятий.
Материалы исследования внедрены в практику работы врачей медицинской,компании «Биокор» (акт внедрения от 16.01.2008 г.), а также в учебный процесс на кафедре экологической физиологии и биохимии Поморского государственного университета (акт внедрения от 28.02.2008 г.).
Диссертационное исследование выполнено в Институте физиологии природных адаптации УрО РАН г. Архангельска в соответствии с планом НИР (№ государственной регистрации 20.0601941).
Работа поддержана грантом научных проектов молодых ученых и аспирантов УрО РАН «Корреляционные взаимосвязи фенотипической активности лимфоцитов и вазомоторных аминов» (постановление Президиума УрО РАН № ЫЗ от 18.01.2007).
Апробация работы. Материалы и основные положения» работы докладывались и обсуждались на заседаниях отдела экологической иммунологии Института физиологии природных адаптации УрО РАН (Архангельск, 2006-2008); на заседании проблемной комиссии по медико биологическим наукам Поморского государственного университета имени М.В. Ломоносова (Архангельск, 2008); Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006); VIII Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2007); международной молодежной научной конференции «Экология 2007» (Архангельск, 2007); VI Молодежной научной конференции Института физиологии КНЦ Ур0 РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2007); Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии» (Санкт-Петербург, 2007); Всероссийской медико-биологической научной конференции молодых ученых «Фундаментальная наука и клиническая- медицина» (X Всероссийская конференция «Человек и его здоровье») (Санкт-Петербург, 2007); ежегодной научно-практической конференции «Вопросы сохранения и-развития здоровья населения Севера и Сибири» (Красноярск, 2007); XI Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2007); VI конференции иммунологов Урала «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической иммунологии и аллергологии» (Ижевск, 2007); международной конференции «World immune regulation meeting» (Davos, Switzerland, 2007); Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология — междисциплинарные проблемы» (Москва, 2008).
По материалам диссертации опубликована 21 печатная, работа, в т.ч. в рецензируемых журналах.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 122 страницах и состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 23 рисунками. Список использованной литературы включает 220 публикаций, из них 111 отечественных и 109 иностранных.
Особенности поддержания иммунного гомеостаза человека в условиях Севера
В многочисленных исследованиях отмечается факт выявления повышенных концентраций IgE в периферической крови. Реагины обнаруживаются не только при аллергиях, но и при аутоиммунных, хронических воспалительных и злокачественных опухолевых процессах [19, 20, 76, 144]. Возможно, мобилизация IgE, обладающих наибольшими цитотоксичностью и цитотропностью и наиболее выраженным аффинитетом к связыванию в тканях, свидетельствует о напряжении иммунных механизмов, в связи с аутосенсибилизацией [59, 80, ПО]. Иммуноглобулин А-наоборот имеет сниженное содержание в сыворотке крови, при этом частота выявления уровней ниже общепринятого ( 1,0 г/л) достигает 29% [9, 13, 14]. Дефицит IgA не обеспечивает должным образом местные антителозависимые: иммунные реакции, способствуя низкой защищенности входных ворот, кожи, слизистых и снижая эффективность реакций, ограничивающих очаг воспаления [132, 157, 218]. Данное явление возникает в результате отставания, возрастного формирования иммунитета- детей, что следует признать критерием экологического неблагополучия.
Повышение общего уровня содержания иммуноглобулинов в какой-то степени является результатом более высокой активности аутоантителообразования [16, 199,- 217]. Действительно содержание аутоантител не только выше у северян, но и значительно шире по спектру специфичности. Выявляются аутоантитела к различным клеточным рецепторам, гормонам, к кардиолипину, антиядерные аутоантитела, каталитические, против самых разнообразных продуктов метаболизма, в том. числе липопротеинов. Повышенный уровень аутоантител отражает уровень напряжения метаболических процессов, а сами аутоатитела, участвуя-, в процессах некробиоза, утилизации и элиминации продуктов обмена, выполняют регуляторные функции по сохранению гомеостаза [58, 68, 96, 130]. С другой стороны, активизация этого процесса может по типу обратной связи тормозить антителообразование на другие антигены (вакцины, инфекция).
Интенсивность фагоцитоза на Севере очень высока, а фагоцитарные числа, как правило, имеют высокое значение, при относительно невысоких уровнях процента активных фагоцитов [2, 28, 33, 69]. Указанный факт, возможно, объясняется ориентацией в сторону воспалительных цитокинов [4, 44, 45, 46, 51, 193], что предполагает более высокий уровень реактивных метаболитов кислорода [165, 168, 175, 179]. Последнее приводит к высокой степени экспрессии поверхностных молекул адгезии и активации клеточной кооперации [101, 105, 181].
Таким образом, снижение уровня иммунной защиты чревато не только онкопатологией, но и увеличением случаев туберкулеза, хронических воспалительных болезней, кардиопатий, аутоиммунных заболеваний и новых вариантов аллергий [55, 60, 77]. Аутоиммунным сдвигам придают основное значение в патогенезе болезней сердца, сосудов, в том числе миокардитов, постинфарктного синдрома, атеросклероза, болезней печени и почек [98].
Как было указано выше, одним из ведущих климатических факторов, влияющим на иммунологическую реактивность, а тем самым на здоровье человека, является необычный фотопериодизм. Благодаря исследованиям, проводимым в отделе экологической иммунологии Института физиологии природных адаптации УрО РАН, было выяснено, что в период полярной ночи и биологических сумерек содержание активных Т-лимфоцитов (CD3+), Т-хелперов (CD4+), молодых форм лимфоцитов (CD10+) ниже, чем в полярный день. Также значительно снижена концентрация клеток с рецептором- к интерлейкину-2 (CD25+), клеток с рецептором к трансферину (CD71+), лимфоцитов с маркером HLADR, естественных киллеров, В-лимфоцитов и активных фагоцитов, однако наблюдается увеличение уровня IgE и ЦИК [146, 148, 149]. Данные различия наиболее характерны для периода биологических сумерек, в указанный момент времени также снижается содержание сывороточных IgM, IgG, IgA. Частота регистрации иммунных дисбалансов резко возрастает к концу полярной ночи: на 30% возрастает значимость дефицита Т-хелперов, в 2,5 раза чаще выявляются дефекты фагоцитарной активности нейтрофильных лейкоцитов, почти в 3 раза повышается частота регистрации дефицита IgA [27, 33, 74, 108]. Таким образом, в полярную ночь и, особенно в период биологических сумерек, заметно подавлены практически все иммунные реакции. С наступлением полярного дня наблюдается резко выраженная активизация иммунных механизмов, включающая увеличение активности фагоцитоза, пролиферативных процессов с участием IL-2, антигенов HLADR, естественных киллеров и антителообразования:
Исследования показали, что воздействие низких температур, в том числе и местное, способствует повышению содержания аутоантигенов. и, соответственно, аутоантител [115, 171, 178, 184]. Можно полагать, что на Севере адаптационный иммунный фон характеризуется,нестабильностью Т-клеточного равновесия: Об этом свидетельствует частота выявления аномально высоких концентраций аутоантител и их многообразие [24, 29]. Таким образом, иммунологическая реактивность северян характеризуется повышенным уровнем лимфопролиферации, содержания в крови провоспалительных цитокинов, антителообразования, преимущественно за счет аутоантител. Это приводит, с одной стороны, к торможению возрастного развития иммунной системы, а с другой — к сокращению резервных возможностей регуляции иммунного гомеостаза.
Участие гистамина в регуляции иммунологической реактивности
Windaus D. и Vogt W. (1931) получили его путем синтеза. Dole М. (1933) и его коллеги продолжили интенсивное исследование биологического действия гистамина [85]. Dale L. и Schultz К. (1933) независимо друг от друга показали, что реакция гиперситивности немедленного типа (анафилактическая реакция) является прямым следствием взаимодействия антигена и ткани, сенсибилизированной антителами. Dale L. (1946) показал, что нанесение гистамина на гладкую мышцу in vitro или (в определенной мере) внутривенная инъекция гистамина животным воссоздает многие признаки анафилактической реакции. В то же время Abel Т. (1951) и его-сотрудникам удалось экстрагировать гистамин из тканей, а впоследствии он был обнаружен практически во всех тканях млекопитающих. Особенно много гистамина в коже, легких, кишечнике, но больше всего - в слизистой оболочке желудка.
Таким1 образом, уже в самых ранних исследованиях было установлено присутствие гистамина в тех тканях, где активно протекают анафилактические и аллергические реакции [49, 112]. Кроме того, нанесение экзогенного гистамина на изолированные ткани и введение его животным воспроизводит ряд признаков таких реакций.
Некоторое время спустя Bartosch W. (1967) и его коллеги показали, что антигенная стимуляция сенсибилизированной ткани легких (модель гиперсенситивности немедленного типа) вызывает выделение гистамина из тканей. Последующие исследования доказали выделение данного вазомоторного амина кожей при воспалении, обусловленном высокой температурой.
После работы Dale L. (1972), где было продемонстрировано сокращение мышц в ответ на гистамин, и более позднего исследования, показавшего (более специфически) сокращение гладких мышц бронхиол, Lewis S. (1979) было установлено, что внутрикожная инъекция гистамина почти всегда воспроизводит утроенный ответ кожи на повреждение. Утроенная кожная реакция на повреждение заключается в локальном покраснении непосредственно в точке;повреждения, которое быстро распространяется (по окружности) на несколько сантиметров. По мере уменьшения красноты начинает развиваться локальный отек вокруг места травмы. Все эти признаки возникают после введения гистамина, но отсутствуют при введении изотонического раствора хлорида натрия: Покраснение при утроенном ответе кожи является результатом; расширения, артериол гистамином, тогда как отек обусловлен протеканием жидкости из посткапилярных венул, проницаемость которых, увеличивается? под действием данного амина. Ристаминовыш шок, развивающийся? после внутривенного введения: гистамина животным, характеризуется выраженной гипотонией и спазмом бронхов; что весьма напоминает анафилактический шок [75; 84].
Знания о существовании гистамина в тканях и его выделении под действием иммунных и воспалительных стимулов;значительно расширились, благодаря; классическим исследованиями Riley D: и West О.- (1981); идентифицировавших тучные клетки; как главный источник, гистамина». [126; 129] . Исследуемый амин; присутствует также в базофильных лейкоцитах крови,, однако? здесь» он обновляется медленно [194], заметный оборот гистамина наблюдаетсяев тканях ШНС и желудочно-кишечного тракта.
Идентификация тучных клеток; как; тканевых депо гистамина побудила к проведению исследований, показавших, что иммунные стимулы, способны инициировать выделение гистамина [172]; В ряде работ продемонстрировано ускорение синтеза гистамина вследствие воспалительных реакций; на физические, химические и бактериальные стимулы [208].
Для, выяснения? роли гистамина был использован интересный,, но не дающий окончательного решения; подход; с применением; конкурентных антагонистов: Первые мощные антагонисты гистамина; (называемые теперь Н]-антагонистами) эффективны in vitro в препаратах изолированных гладких мышц. Антагонисты частично подавляют эффекты экзогенного гистамина у животных.. Bain F. (1982) показал, что антигистаминные препараты уменьшают кожные реакции, вызванные воздействием гистамина. Однако те же препараты в основном неэффективны в экспериментальных Моделях воспаления, а также при аллергических заболеваниях человека. Было выдвинуто предположение, что гистамин, выделяясь локально в месте воспаления, достигает концентрации, которая может снимать эффекты клинически достижимых концентраций антигистаминных препаратов. Другим возможным объяснением было существование нескольких: типов рецепторов гистамина, которые обладают разной чувствительностью к блокаде антагонистами. Это представляется вполне вероятным, поскольку индуцированная гистамином секреция кислоты в желудке полностью нечувствительна к антигистаминным препаратам.
Исходя из наблюдений-Schild В. (1984) в отношении резистентности к антигистаминным препаратам, вызванной гистамином секреции желуд;0чной кислоты, Black V. (1985) разработал группу Н2-антагонистов вазомоторного амина, которые-подавляют эту секрецию. Таким образом, был открыт путь к исследованию значения Нр и Н2-рецепторов в иммунных реакциях [54-э 154].
Экспериментальная работа, выполненная- в последние десятилетия скорее осложнила понимание данного вопроса. Не вызывает особых сомнений то, что классические воспалительные эффекты - гистамина опосредуются Н]-рецепторами. Однако вазодилатация, вьізванная гистамином, сильнее подавляется Н]-антагонистами в присутствии Н2-антагонистов, что предположительно способствует действию Но-рецепторов [53, 188]. Не исключается также небольшой Нг-эффект в дополнение к выраженному Нрэффекту при вызванном гистамином повышении венозной проницаемости. Нг-рецепторы, по-видимому, участвуют и в возникновении зуда, вызванном гистамином. Однако комбинация. Ні - и Нг-антагонистов не обеспечивает существенно большей эффективности лечения ПрИ гиперсенситивности немедленного типа и воспалительных заболеваниях в сравнении с применением только Н]-антагониста, эффективность Которого лишь несколько выше маргинальной [163, 167]. Исключение из этого правила составляют некоторые воспалительные заболевания кожи.
Общая характеристика обследуемых лиц
Кровь для исследования брали из локтевой вены в объеме 10 мл в 9-10 часов утра, натощак. Сыворотку отделяли от эритроцитов центрифугированием, а затем замораживали.
- Были изучены общее содержание лейкоцитов в. венозной крови и лейкограмма с последующей оценкой концентраций лимфоцитов фенотипов GD3+, CD4+, CD5+, CD8+, CD10+, CD16+, CD25+, CD71+, CD95+, HLADR.
Общее количество лейкоцитов определяли в камере Торяева. Для этого брали пробирку с 400 мкл 3% уксусной кислоты, подкрашенной синькой (к Змл ледяной уксусной кислоты добавляли 97 мл воды и краску). В пробирку с кислотой пипеткой закапывали 20 мкл крови с гепарином. Полученную смесь взбалтывали перед просмотром под микроскопом и исследовали в камере Горяева на малом увеличении без иммерсионного масла [52].
Содержание лимфоцитов изучали в мазках крови, которые вначале 20 мин. фиксировали в смеси Никифорова (50% спирта и 50% эфира), а затем 40 мин. окрашивали по Романовскому-Гимзе. Приготовленные мазки рассматривались под микроскопом при иммерсионном увеличении объектива х90 и окуляра х10 с подсчетом 100 клеток на клавишных лабораторных счетчиках. Состав лейкоцитарной-формулы выражался в процентах.
Для- получения лимфоцитарной взвеси венозную кровь с гепарином, добавляли в объеме 3 мл в пробирку с 2 мл физраствора. В другую пробирку наливали 2 мл фиколла и осторожно наслаивали в нее-все содержимое первой пробирки, а затем оставляли до появления хлопьев («красный снег»). Полученную смесь центрифугировали 30 мин. на 1500 оборотов. Образовавшиеся клетки («кольцо») переносили в третью пробирку и доводили, физраствором общий объем до 10 мл. После дважды проводили дополнительное центрифугирование отмытых форм. Осторожно отсасывали пипеткой жидкость до 1 мл. Готовую клеточную взвесь раскапывали на предметные стекла для постановки реакции непрямой иммуннопероксидазной реакции с использованием моноклональных антител на препаратах лимфоцитов типа «высушенной капли» производства НПЦ МедБиоСпектр г. Москва. Данная методика заключается в следующем: лейкоциты в объеме 0,5 мл выделяли в градиенте фикол-верографин и наносили на предметное стекло, которое затем помещали на 20 минут в холодильник при t+4C. По завершении инкубации остатки жидкости высушивали при комнатной температуре. На высушенную каплю наносили 20 мкл 3% раствора перекиси водорода на 10 минут для блокады эндогенной пероксидазы. Каплю промывали 5 раз 100 мкл физиологического раствора, наносили 20 мкл хорошо перемешанного раствора моноклональных антител, потом инкубировали в течение часа при комнатной температуре под чашкой Петри на влажной бумаге. Препараты промывали 5 раз 100 мкл физиологического раствора, затем наносили 20 мкл хорошо перемешанного пероксидазного конъюгата, инкубировали до появления коричневого окрашивания при комнатной температуре. Ядра клеток докрашивали раствором бриллиантового зеленого.
Для выявления поглотительной способности нейтрофилов использовали следующую методику: смесь 100 мкл латекса и 100 мкл крови с гепарином перемешивали и ставили в термостат на 30 мин. (при температуре аппарата 37С). Затем из пробирки отсасывали над осадочную жидкость, а оставшуюся взвесь перемешивали и делали из нее мазок. Предметные стекла с мазками высушивали при комнатной температуре, фиксировали в смеси Никифорова 20 мин и окрашивали по Романовскому-Гимзе 40 мин. Отмытые и высушенные предметные стекла микроскопировали при увеличении объектива х90 и окуляра х7. Полученные результаты оценивались с помощью фагоцитарного показателя (процента фагоцитирующих клеток из числа сосчитанных нейтрофилов), и фагоцитарного числа (количество поглощенных одним активным нейтрофилом частиц). - Дslя количественного исследования гистамина и серотонина использовался метод иммуноферментного анализа (ИФА) с применением диагностических наборов фирмы «IBL», Гамбург.
Микропланшет покрывается моноклональными антителами к гистамину или серотонину. В ходе реакции в лунки планшета добавляются стандарты, контроли и неизвестные образцы. Антигены, присутствующие в образцах в неизвестной концентрации, и фиксированное количество антигенов, коньюгированных с ферментом, конкурируют друг с другом за связывание с моноклональными антителами. После инкубации планшеты промывают, прекращая тем самым конкурентное взаимодействие антигенов. После добавления раствора субстрата ТМВ концентрация антигенов в образцах обратно пропорциональна измеряемой оптической плотности (ОП). Для построения калибровочной кривой измеряется ОП стандартов. Концентрацию антигенов в образцах находят по калибровочной кривой.
Общая характеристика иммунного статуса обследуемых мужчин
В данной главе будут рассмотрены показатели клеточного и гуморального иммунитета периферической крови, частота их дисбалансов, а также регуляторные механизмы взаимного влияния исследуемых величин. Анализ, иммунологической реактивности проводится в, общей группе обследуемых лиц, то есть охватывает 103 практически здоровых мужчины, родившихся и проживающих в, Архангельской области. Полученные результаты представлены в таблицах 1, 2 и диаграммах (рис. 1, 2).
Среднее содержание гистамина составило 0;86±0,07 нг/мл с колебаниями от 0,06 до 2,63- нг/мл в- пределах ± За (табл. 1). У 28,3 % обследуемых выявлены повышенные концентрации гистамина; а в 17,4 %-случаев его содержание было ниже общепринятых пределов (0,3-1,0 нг/мл). Средняя концентрация; серотонина соответствует пределам1 нормы, и равняется-38,77±1,46 нг/мл, где минимум и максимум составляет 0,28 нг/мл и 53,26 нг/мл соответственно в пределах ±1,5а; низкое содержание данного амина выявлено у 16,33 % обследуемых лиц (рис. 1).
Общее содержание лейкоцитов в средних результатах составляет 5,39±0,09хЮ9 кл/л, превышения относительно нормы не наблюдаются, однако в двух случаях выявляются достаточно низкие концентрации указанных клеток (1,9%). При исследовании состава лейкограммы обращает на себя внимание высокий уровень нейтропении (53;45±1,34х109 кл/л), в процентных величинах частота регистрации которой составляет 23,3%. Также хочется отметить значительную частоту дефицита фагоцитарной защиты (47,6% и 69,9%) на-фоне высокой интенсивности фагоцитоза (55,73±1,69%), при этом среднее значение фагоцитарного числа равняется 8,7±0,4 шт.
Следующей особенностью изменения состава лейкограммы является высокий уровень регистрации относительного лимфоцитоза (34,95%), который подтверждается значительной концентрацией лимфоцитов (32,66±1,11%). Г пал.н. эоз. 29 0,97 i.i Содержание эозинофилов и моноцитов находится в пределах физиологических границ (0,16±0,01 и 0,41 ±0,03x109 кл/л), однако наблюдается превышение нормы в 19,4 и 14,6% случаев соответственно.
Что касается количества зрелых Т-клеток (CD3+), то здесь обнаружена аномально высокая частота регистрации дефицита (97%) с резким снижением абсолютного и относительного содержания (0,55±0,02х10ч кл/л и 32,54±0,72%) (табл. 2). Подобная закономерность установлена и для содержания CD5+ (0,57±0,02х 104 кл/л), при этом пониженные уровни встречаются в 30,1% случаев (рис. 2). В абсолютном значении средняя концентрация лимфоцитов с маркером CD4+ равняется 0,55±0,02 109 кл/л, в 12% наблюдается снижение уровня данного показателя по сравнению с нормой. Относительное содержание цитотоксических лимфоцитов (CD8+) составляет 24,52±0,55%, а средняя концентрация абсолютного их значения равняется 0,42±0,02хЮ9 кл/л; следует отметить, что во многих случаях она находится на верхней границе нормы или превышает ее (в 47,6%).
Концентрация лимфоцитов, способных к пролиферации (CD 10+), составляет 20,06+0,64%, в абсолютном выражении количество указанных клеток в средних результатах равно 0,34+0,02x109 кл/л, что вполне укладывается в их общепринятые пределы, однако регистрируется значительный дефицит в 16,8% случаев.
Содержание активных клеток с рецептором к IL-2 (CD25+) в процентах составляет 23,6±0,78%, в абсолютных величинах - 0,41 ±0,02x109 кл/л. Средняя концентрация CD71+ снижена по отношению к CD25+ и равняется 19,8±0,75% и 0,34±0,02ХЮ9 кл/л соответственно, частота встречаемости повышенных уровней составляет 78,6%. Отмечается значительный уровень содержания активных клеток с маркером HLADR+ (25,73±0,88% и 0,47±0,02 109 кл/л), который характеризуется 29,1% случаев превышения нормы.
Содержание естественных киллеров (CD16+) в среднем составляет 24,15±0,82% и 0,41±0,02х10 кл/л соответственно, повышенные значения наблюдали у 21 % обследуемых.
