Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Функциональное значение серотонина в регуляции инотропной функции миокарда 15
1.1.1. Метаболизм серотонина 15
1.1.2. Серотониновые;рецепторы в регуляции инотропной функции миокарда 17
1.2. Функциональное значение симпатоадреналовои системы в регуляции инотропной функции миокарда 23
1.2.1. Метаболизм катехоламинов в крови 23
1.2.2. Адренорецепторы в регуляции инотропной функции миокарда 24
1.3. Определение, классификации, современные представления о патогенезе хронической сердечной недостаточности 25
1.4. Симпатоадреналовая система и хроническая сердечная недостаточность 33
1.5. Серотонин и хроническая сердечная недостаточность 37
Глава 2. Материалы, объем и методы исследования 41
2.1. Объект исследования 41
2.2. Эхокардиография 42
2.3. Метод исследования сократимости миокарда 43
2.4. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией
2.5. Метод иммуногистохимии 48
2.6. Методы статистического анализа 49
Глава 3. Результаты исследования 51
3.1. Серотонин в регуляции инотропной функции правого предсердия и правого желудочка десимпатизированных крыс 51
3.2. Концентрации серотонина, 5-ГИУК, катехоламинов, ДОФА в крови пациентов с диастолической и систолической сердечной недостаточностью 56
3.2.1. Концентрации серотонина, его метаболита 5-ГИУК в крови пациентов с хронической сердечной недостаточностью 58
3.2.2. Концентрации ДОФА, катехоламинов в плазме крови пациентов с хронической сердечной недостаточностью 60
3.2.3. Взаимосвязь между концентрациями серотонина и катехоламинов крови у пациентов с хронической сердечной недостаточностью 63
3.3. Влияние серотонина, агониста 5-НТ2В рецепторов, адреналина на инотропную функцию миокарда пациентов с диастолической и систолической сердечной недостаточностью 69
3.3.1. Влияние серотонина, агониста 5-НТ2В рецепторов на силу сокращения пациентов с хронической сердечной недостаточностью 69
3.3.2. Влияние серотонина на параметры инотропной функции миокарда пациентов с хронической сердечной недостаточностью 74
3.4. Иммуногистохимическое исследование 5-НТ2В рецепторов и мембранного переносчика серотонина в миокарде ушка правого предсердия пациентов с диастолической и систолической сердечной недостаточностью 76
Глава 4. Обсуждение результатов 80
Выводы 97
Список литературы
- Функциональное значение серотонина в регуляции инотропной функции миокарда
- Серотониновые;рецепторы в регуляции инотропной функции миокарда
- Метод исследования сократимости миокарда
- Серотонин в регуляции инотропной функции правого предсердия и правого желудочка десимпатизированных крыс
Введение к работе
В последние десятилетия широко обсуждается роль серотонина (5-НТ) в регуляции функций сердечно-сосудистой системы. Серотонин влияет на инотропную функцию миокарда [26], тонус сосудов [25]. Обсуждается роль серотониновой системы как звена в патогенезе атеросклероза, артериальной гипертензии [65, 214], легочной гипертензии [15]. У пациентов с ишемической болезнью сердца выявлено повышение концентрации серотонина в крови [164], увеличение захвата 5-НТ в тромбоциты [164, 217] мембранным переносчиком серотонина. Однако отсутствуют данные о концентрации серотонина в крови, его влиянии на инотропную функцию миокарда при диастолической, систолической сердечной недостаточности. Не показано наличие и функциональное значение мембранного переносчика серотонина в миокарде людей с хронической сердечной недостаточностью (ХСН).
В последние годы уделяется повышенное внимание хронической
сердечной недостаточности, что связано с неуклонным ростом числа случаев
этого заболевания, высоким уровнем смертности, госпитализации, а также
стоимостью лечения декомпенсированных больных [4]. В последние
десятилетия общепринятой гипотезой прогрессирования сердечной
недостаточности является нейрогормональная модель, согласно которой
активируется симпатоадреналовая система [90] и ренин-ангиотензин-
альдостероновая система [177]. Активация симпатоадреналовой системы
сопровождается повышением концентрации катехоламинов [162], ДОФА
[148, 200] в плазме крови у пациентов с ХСН. Несмотря на очевидные
успехи, достигнутые за последние десятилетия в лечении пациентов с ХСН -
прием Ь-адреноблокаторов [83], ингибиторов ангиотензинпревращающего
фермента [99] (степень доказанности А), она продолжает оставаться
заболеванием с прогрессивным характером течения. При ХСН в миокарде
происходят морфо-функциональные изменения, включающие
7 диастолическую дисфункцию (ДД), систолическую дисфункцию (СД). Диастола чаще является более ранней и уязвимой мишенью, так как энергоемкость инактивации кальция значительно превышает энергозатраты на его доставку к миофиламентам. Диастолическая дисфункция связана с нарушением расслабления миокарда вследствие повышения его жесткости за счет роста интерстиция. Гипертрофия миокарда также способствует развитию диастолической дисфункции. Систолическая дисфункция характеризуется снижением сократительной способности миокарда. Поскольку современные классификации ХСН, основанные на клинических проявлениях заболевания, не всегда полностью отражают тяжесть морфо-функциональных изменений сердца, перспективным представляется изучение состояния симпатоадреналовой системы в крови людей в зависимости от морфо-функциональных изменений сердца.
На сегодняшний день известно два типа серотониновых рецепторов, мРНК которых выявлены в миокарде человека - 5-НТ2В [184] и 5-НТ4 [31]. У мутантных по 5-НТ2В рецепторам мышей наблюдается беспорядочное расположение миоцитов в сердце, дилатация левого желудочка, снижение диастолической функции сердца [144]. У крыс с ХСН увеличивается экспрессия мРНК 5-НТ2В и 5-НТ4 рецепторов [188]. 5-НТ4 рецепторы опосредуют положительный хронотропный [77] и инотропный эффекты серотонина в миокарде предсердий и желудочков [25]. При ХСН положительный инотропный эффект, реализуемый через 5-НТ4 рецепторы, усиливается [188]. Однако наличие 5-НТ2В рецепторов и их роль в регуляции инотропной функции миокарда пациентов при диастолической, систолической сердечной недостаточности не установлены.
Серотониновые и адренорецепторы имеют сходные внутриклеточные пути: 5-НТ4 рецепторы и (3-АР активируют аденилатциклазный внутриклеточный каскадный путь, тогда как 5-НТ2 рецепторы и ai-AP -фосфатидилинозитольный [112, 117]. Доказано, что регулярное применение адреноблокаторов для лечения сердечно-сосудистых заболеваний приводит к
8 компенсаторному увеличению количества 5-НТ4 рецепторов на мембране кардиомиоцитов. Наблюдается двухкратный прирост силы сокращения миокарда больных, длительно получавших адреноблокаторы, в ответ на серотонин [16, 179]. В связи с этим важным представляется изучение взаимосвязи между концентрациями серотонина и катехоламинов в крови и влиянием серотонина и адреналина на инотропную функцию миокарда пациентов с диастолической, систолической сердечной недостаточностью.
Цель исследования
Изучение роли серотонина и катехоламинов в регуляции инотропной функции миокарда при диастолической, систолической сердечной недостаточности.
Задачи исследования
Изучить влияние серотонина на инотропную функцию миокарда правого предсердия и правого желудочка десимпатизированных крыс.
Выявить наличие 5-НТ2В рецепторов и мембранного переносчика серотонина в миокарде ушка правого предсердия пациентов с диастолической, систолической сердечной недостаточностью.
Определить концентрации серотонина, его метаболита 5-ГИУК, ДОФА и катехоламинов в крови у пациентов при диастолической, систолической сердечной недостаточности.
Изучить влияние серотонина, агониста 5-НТ2В рецепторов, адреналина на инотропную функцию миокарда ушка правого предсердия пациентов с диастолической, систолической сердечной недостаточностью.
9 Объект исследования
Эксперименты по моделированию ХСН выполнены на 44 крысах. В группу больных с ХСН вошли 56 пациентов в возрасте от 46 до 61 года (54 мужчины и 2 женщины) с ХСН I-III функционального класса по классификации Нью-Йоркской ассоциации сердца (NYHA), осложнившей течение ишемической болезни сердца, гипертонической болезни и пороков сердца. Группу контроля по определению концентраций исследуемых веществ в крови составили люди в возрасте от 39 до 61 года (10 мужчин и 2 женщины), не имеющие сердечно-сосудистых заболеваний по анамнезу и данным эхокардиографического исследования.
Методы исследования
Для получения результатов исследования и их обработки были использованы методы: высокоэффективная жидкостная хроматография с электрохимической детекцией для определения концентрации серотонина и его метаболита в плазме крови и тромбоцитах, катехоламинов, их предшественников в плазме крови; метод определения инотропной функции миокарда на серотонин, адреналин, агонист 5-НТ2В рецепторов (т-СРР hydrochloride); иммуногистохимический метод для выявления 5-НТ2В рецепторов и мембранного переносчика серотонина в препаратах миокарда; статистический метод.
Научная новизна полученных результатов
Выявлено увеличение концентрации серотонина в плазме крови и в тромбоцитах у пациентов с ХСН. Наибольшая концентрация серотонина в тромбоцитах выявлена в группе с ДД. В группах ДД+ГЛЖ и ДД+СД повышена концентрация метаболита серотонина - 5-ГИУК. Увеличенная
10 концентрация серотонина в крови в группах с ДД и ДД+ГЛЖ сопровождается активацией медиаторного звена симпатоадреналовой системы. Максимальная концентрация норадреналина в крови наблюдается при ДД+ГЛЖ. В ' группе ДД+СД на фоне снижения концентрации норадреналина в крови концентрация серотонина остается высокой. Выявлена прямая положительная взаимосвязь между концентрацией норадреналина и толщиной межжелудочковой перегородки, толщиной задне-боковой стенки левого желудочка.
С нарастанием морфо-функциональных изменений миокарда при ХСН увеличивается количество корреляционных связей между концентрациями в крови серотонина, 5-ГИУК, катехоламинов, ДОФА. Прогрессирование ХСН характеризуется увеличением взаимосвязи с концентрациями серотонина в тромбоцитах и 5-ГИУК.
Впервые выявлено, что при фармакологической десимпатизации крыс реакция силы сокращения миокарда правого предсердия и правого желудочка на серотонин выше по сравнению с контрольными животными.
Установлена взаимосвязь морфо-функциональных изменений сердца и
преобладания влияний адреналина или серотонина на силу сокращения
миокарда правого предсердия. При ДД+ГЛЖ реакция силы сокращения
миокарда на серотонин выше, чем на адреналин и реализуется через 5-НТ2В
рецепторы в отличие от групп ДД и ДД+СД, где реакция силы сокращения
миокарда на серотонин ниже, чем на адреналин, и агонист 5-НТ2В
рецепторов вызывает отрицательный инотропный эффект.
Иммуногистохимическим методом показано наличие 5-НТ2В рецепторов и мембранного переносчика серотонина в миокарде ушка правого предсердия пациентов с хронической сердечной недостаточностью.
Практическая значимость полученных результатов
Выявленный положительный инотропный эффект серотонина, превалирующий над эффектом адреналина у пациентов с ДД+ГЛЖ, свидетельствует о значимости влияния серотонина в регуляции инотропной функции миокарда в условиях сниженной реакции на адреналин и о возможности применения препаратов серотонина в качестве инотропных в условиях отсутствия эффекта от стандартно используемой терапии.
Обнаруженный положительный инотропный эффект агониста 5-НТ2В рецепторов у пациентов с ДД+ГЛЖ, отрицательный инотропный эффект в группах ДД и ДД+СД, свидетельствует о значимости 5-НТ2В рецептора при ГЛЖ. Поскольку данный рецептор связан с Gq-белком, гиперстимуляция которого приводит к апоптозу кардиомиоцитов, то можно предложить проведение исследований для использования блокаторов 5-НТ2В рецепторов у больных с ГЛЖ для предотвращения гибели кардиомиоцитов.
Высокая концентрация серотонина в плазме крови и в тромбоцитах у больных с ХСН повышает риск тромбозов и спазма сосудов. В связи с этим для предотвращения указанных осложнений возникает возможность использования ингибиторов 5-НТ2 рецепторов, которые на сегодняшний день в условиях стационаров Российской Федерации не используются.
Выявленное нами наличие мембранного переносчика серотонина в миокарде при увеличении концентрации серотонина в тромбоцитах у пациентов с ХСН увеличивает риск развития инфаркта миокарда. В связи с этим необходимо рассмотреть назначение ингибиторов обратного захвата серотонина в условиях стационаров.
Выявленная взаимосвязь между активностью САС и морфо-функциональными изменениями сердца заставляет задуматься о необходимости учитывать данные изменения морфологии миокарда при назначении Р-адреноблокаторов. Пациенты с ДД+ГЛЖ имеют самую высокую концентрацию НА, А в плазме крови по сравнению с группами ДД
12 и ДД+СД, но при этом самую низкую реакцию силы сокращения на адреналин, что свидетельствует о возможной десенситизации или снижении количества адренорецепторов в миокарде у этих больных.
Выявленные корреляции между нейрогормональным состоянием организма и морфо-функциональными изменениями миокарда больных с ХСН позволяют предложить использование определения этих показателей в крови для диагностики тяжести патологического процесса в сердце и для оценки эффективности проводимого лечения.
Внедрение результатов работы в практику
Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении семинаров на кафедрах нормальной физиологии, факультетской терапии и кардиологии Казанского государственного медицинского университета. На основе проведенных исследований внедрено применение ингибиторов обратного захвата серотонина у больных с хронической сердечной недостаточностью для снижения риска развития инфаркта миокарда в практической работе кардиологического отделения Межрегионального клинико-диагностического центра Республики Татарстан.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
1. Увеличение концентрации серотонина и 5-ГИУК в плазме крови или серотонина в тромбоцитах у пациентов с ХСН зависят от наличия диастолической и систолической дисфункций сердца. С нарастанием морфо-функциональных изменений сердца при ХСН увеличивается взаимосвязь концентраций серотонина, 5-ГИУК в плазме крови, серотонина в тромбоцитах с катехоламинами в плазме крови.
13 2. При диастолической и сочетанной диастолической и систолической дисфункциях положительный инотропный эффект адреналина выше, чем серотонина. У пациентов с ХСН, имеющих диастолическую дисфункцию с гипертрофией левого желудочка, положительный инотропный эффект серотонина выше, чем адреналина и реализуется через 5-НТ2В рецепторы.
Личный вклад соискателя
Диссертант участвовал в планировании, постановке цели и задач
исследования. Подбор и анализ литературы, организация забора
исследуемого материала (препаратов миокарда и крови) проводились
непосредственно соискателем. Проведение экспериментов по определению
сократимости миокарда, их компьютерная обработка,
иммуногистохимические исследования, создание базы данных,
статистическая обработка полученного материала проводились
непосредственно соискателем. Клиническое и инструментальное обследование исследуемой группы пациентов проводилось при участии соискателя.
Основные положения диссертации отражены в 19-ти научных работах написанных автором, в том числе 3 работы опубликованы в ведущих научных рецензируемых журналах, определенных высшей аттестационной комиссией. Общий объем публикаций составляет 2,6 усл. печатных листа, в том числе авторский вклад - 2,1 усл. печатных листа.
Апробация работы
Основные положения работы доложены на 9-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2005); Всероссийской научной конференции "Физиология сердца" (Казань, 2005); 79-ой Всероссийской студенческой научной конференции, посвященной
14 1000-летию Казани (Казань, 2005); Девятой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2006); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Современная кардиология: наука и практика» (Санкт-Петербург, 2007); XXXV-м Международном конгрессе по электрокардиологии (Санкт-Петербург, 2008); IV конференции Украинского общества нейронаук с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения академика НАН Украины Ф.М. Серкова (Донецк, Украина, 2008); Европейском фармакологическом конгрессе (Манчестер, Великобритания, 2008).
Исследования, проведенные в рамках диссертационной работы, поддержаны грантами РФФИ № 04-04-49055, № 07-04-01350, грантами Ведущей научной школы НШ - 4520.2006.4, Роснауки 08.120.02/014.
Структура диссертации, её объем
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 223 источников, из которых 28 отечественных и 195 на иностранном языке. Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, иллюстрирована 23 рисунками, 10 таблицами.
Функциональное значение серотонина в регуляции инотропной функции миокарда
Более 95 % серотонина синтезируется клетками кишечника, оставшиеся 5% синтезируются в мозге, нейроэндотелиальных клетках легких и других тканей [62]. Серотонин в кишечнике синтезируется в клетках, относящихся к APUD-системе - функционально активной системе одиночных гормонпродуцирующих клеток нейроэктодермального происхождения. Клетки APUD-системы - апудоциты - встречаются во многих тканях желудочно-кишечного тракта, параганглиях, различных эндокринных органах (щитовидная и поджелудочная железы и др.), но нигде не образуют самостоятельного органа, располагаясь диффузно или небольшими группами среди клеток различных органов в эндокринных железах [12, 19, 20]. Из всех типов клеток APUD-системы серотонин продуцирует только один тип клеток - энтерохромаффинные -интегрированные в составе эпителия одиночные эндокринные клетки.
Серотонин (5-гидрокситриптамин, 5-НТ) - представитель биогенных аминов, синтезируется из незаменимой аминокислоты L-триптофана, которая поступает в организм только с пищей. В крови 90 % триптофана связано с альбумином, и только свободная фракция этой аминокислоты (около 10%) используется для синтеза серотонина. Биосинтез серотонина осуществляется в два этапа [61].
Содержание серотонина в плазме крови незначительно, основное депо - тромбоциты, в гранулах которых хранится около 99% всего серотонина [68]. Захват серотонина в тромбоциты осуществляется с помощью мембранного переносчика серотонина - специфического Ка+/К+-зависимого мембранного транспортера, состоящего из 12-ти трансмембранных доменов [137]. У животных мембранный переносчик серотонина обнаружен в сердце [138], сосудах [151], надпочечниках [182], эндотелиальных клетках. Серотонин также может захватываться и высвобождаться симпатической нервной терминалью [117].
Серотонин выделяется из тромбоцитов под влиянием стимулов, активирующих тромбоциты: тромбоксан А2, АДФ, тромбин, тканевой фактор, фактор роста фибробластов, фибриноген, 4 фактор тромбоцитов, р тромбоглобин, сам серотонин [207, 221]. Активация тромбоцита приводит к выбросу серотонина, который через 5-НТ2А рецепторы, находящиеся на мембране тромбоцитов, приводит к активации функции других тромбоцитов [65].
Основным органом, метаболизирующим серотонин, является легкое [132]. В эндотелиальных клетках сосудов легких под действием фермента моноаминоксидазы А (МАО-А) серотонин превращается в свой конечный метаболит - 5-гидроксииндолуксусную кислоту (5-ГИУК), которая в последствии выводится с мочой [101]. В течение суток отмечается быстрый метаболизм серотонина, примерно 50-98% серотонина в виде 5-ГИУК выводится с мочой, а 3-5% с калом [7]. В меньшей мере удаление серотонина из системы циркуляции происходит путем печеночной инактивации.
В настоящее время известно 7 типов и не менее 15 подтипов серотониновых рецепторов. Выделены 5-НТ1, 5-НТ2, 5-НТЗ, 5-НТ4, 5-НТ5, 5-НТ6, 5-НТ7 рецепторы, а также подтипы 5-НТ1 рецепторов: 5-НТ1а, 5-НТ1в, 5-HTlc, 5-HTlda, 5-HTld (3, 5-НТ1е, 5-HTlf [127], подтипы 5-HT2 рецепторов: 5-HT2A, 5-HT2B и 5-НТ2С [219]; 5-НТ4 рецепторов: 5-HT4L и 5-HT4S [197]; 5-НТ5 рецепторов: 5-НТ5а и 5-НТ5в, 5-НТ7 рецепторов: 5-НТ7а, 5-НТ7в, 5-НТ7с и 5-HT7d [106].
Передача сигнала на ферментную систему внутрь клетки со всех рецепторов серотонина, кроме 5-НТЗ рецепторов, происходит с помощью ГТФ-связывающих белков (G-белков). 5-НТЗ рецепторы образуют ионные каналы, регулирующие токи ионов Na+, К+ и Са44" [59].
Серотонин, как нейрогормон, оказывает влияние на сердце двумя основными путями: 1). связывание со специфическими рецепторами, находящимися непосредственно на сарколемме или других органеллах клеток миокарда (миоцитарные, интерстициальные) - прямой эффект [85, 115]; 2). регулируя высвобождение НА из симпатических нервных окончаний, иннервирующих сердце, через связывание серотонина со специфическими рецепторами на пресинаптической мембране симпатических терминалей - опосредованный эффект [97]. Кроме того, серотонин, связываясь со специфическими рецепторами на эндотелиальных, гладкомышечных клетках стенок сосудов, регулируя тем самым их тонус, влияет на трофику миокарда.
На сегодняшний день известно 2 типа серотониновых рецепторов, мРНК которых выявлены в миокарде человека и через которые серотонин может оказывать прямой эффект на сердце - 5-НТ2 [184], 5-НТ4 [31] рецепторы.
Тип 5-НТ2 рецепторов объединяет три подтипа: 5-НТ2А, 5-НТ2В, 5-НТ2С. Все эти рецепторы являются простыми протеинами, семикратно пронизывающими мембрану. В целом аминокислотные последовательности 3-х подтипов гомологичны на 50%, а их трансмембранные регионы - на 70-80%. Полагают, что все три подтипа рецепторов сопряжены с фосфолипазой С посредством а-субъединицы Gq белка [106]. Фосфолипаза С осуществляет гидролиз фосфатидилинозитола в инозитолтрифосфат и диацилглицерол (рис. 1.2). Агонисты этих рецепторов индуцируют гидролиз фосфатидилинозитола [66]. Вместе с тем, имеются экспериментальные данные о том, что передача сигнала с 5-НТ2В рецептора внутрь клетки может осуществляться независимо от гидролиза фосфатидилинозитола [57]. 5-НТ2А рецепторы расположены на постсинаптической мембране и регулируются принципиально иным способом по сравнению с рецепторами других моноаминов, количество которых, также как и чувствительность, увеличивается в условиях денервации, а агонисты и антагонисты при длительном применении оказывают противоположный эффект. Полагают, что нетипичное поведение 5-НТ2А рецепторов может быть обусловлено достаточно низким сродством этих рецепторов к серотонину, в связи с чем, в нормальных условиях рецепторы лишены возможности взаимодействовать с г серотонином [5]. мРНК 5-НТ2А рецепторов обнаружена в предсердиях и желудочках человека, крысы методом полимеразно-цепной реакции [173]. мРНК 5-НТ2В рецепторов широко распространена в периферических тканях (плаценте, легком, почке, кишечнике, желудке), в мозге [139], в том числе в тканях сердца мыши [58] и человека [161]. Взаимодействие агонистов с 5-НТ2В рецепторами вызывает активацию фосфолипазы С и фосфолипазы А, затем увеличивается образование цАМФ, что является митогенетическим сигналом, который включается в тирозинкиназный путь. Активированная фосфолипаза С осуществляет фосфорилирование различных ферментных, внутриядерных белков (гистоны) и белков ионных каналов по серину и треонину. Возможно, именно с этим механизмом и связан морфогенетический эффект серотонина на сердце. Интересен тот факт, что фосфолипаза С способна сама регулировать свою активность: усиливать её, путем повышения образования фосфатидилинозитол-4,5-дифосфата, являющегося субстратом для фосфолипазы С или угнетать за счет ингибирования гидролиза фосфоинозитидов. На мутантных по 5НТ2В-рецептору мышах доказано его участие в регуляции развития сердца в эмбриогенезе. В развивающемся сердце серотонин через 5НТ2В рецепторы регулирует дифференцировку и пролиферацию кардиомиоцитов [144].
Серотониновые;рецепторы в регуляции инотропной функции миокарда
Поступающий Са связывается с рианодиновыми рецепторами на саркоплазматическом ретикулуме и способствует выбросу Са из него. В свою очередь диацилглицерол прикрепляется к специфическому участку связывания на каталитической субъединице протеинкиназы С вместе с Са и фосфатидилсерином. Присоединение диацилглицерола увеличивает сродство протеинкиназы С к Са . Серотонин оказывает бифазное действие на содержание ионов кальция в цитозоле эндотелиальных клеток сердца: вначале отмечается временное увеличение Са2+ в цитозоле, благодаря выходу Са + из саркоплазматического ретикулума, а затем медленное увеличение внутриклеточного Са" из-за входа внеклеточного Са + (рис. 1.2). 5-НТ4 рецепторы (а) и (Ь) подтипов экспрессируются в предсердиях и желудочках сердца человека [31, 115]. 5-НТ4 рецепторы опосредуют положительный инотропный эффект серотонина в миокарде предсердий [25]. Положительный инотропный эффект агонистов 5-НТ4 рецепторов обусловлен повышением амплитуды тока Са2+ в предсердных кардиомиоцитах человека и свиней. Увеличение кальциевого тока зависит от протеинкиназы А (добавление в среду ингибитора фермента блокирует эффект агонистов) [155]. Серотонин регулирует концентрацию ионов кальция в предсердных миоцитах через 5-НТ4 рецепторы, положительно сопряженные с аденилатциклазой, повышая уровень цАМФ и активность цАМФ-зависимой протеинкиназы [31]. Кроме того, 5-НТ4 рецепторы располагаются в синоатриальном узле человека, опосредуя положительный хронотропный эффект [77]. 5-НТ4 рецепторы и pi; р2, Рз -адренорецепторы имеют общий механизм внутриклеточной регуляции [112]. Агонисты связываются с этими рецепторами и приводят к активации Gs-белка и последующей активации аденилатциклазы, которая образует цАМФ из АТФ. цАМФ связывается с регуляторной субъединицей протеинкиназы А и вызывает её диссоциацию с каталитическими субъединицами, т.е. приводит к активации протеинкиназы А. Протеинкиназа А, также как и протеинкиназа С фосфорилирует различные клеточные белки, в том числе и внутриядерные. Протеинкиназа А вызывает увеличение внутриклеточной концентрации Са2+ путем активации L-типа Са"+-каналов.
На пресинаптических норадренергических нервных окончаниях расположены 5-HTld и 5-НТ4 типы рецепторов. Пресинаптические 5-НТЫ рецепторы угнетают высвобождение норадреналина, в то время как 5-НТ4 рецепторы, наоборот, усиливают его освобождение. Находящийся на холинергических терминалях 5НТЗ-рецептор способствует выделению ацетилхолина из нервной терминал и [166].
Серотонин оказывает прямое действие на гладкую мускулатуру. В сосудистой системе это проявляется в виде вазомоторных, вазоконстрикторных и дилятационных реакций через 5-НТ2 рецепторы [24].
Влияние серотонина на сосудистый тонус реализуется через констрикцию и релаксацию гладкомышечных клеток при активации 5-НТ2А и 5-НТ2В рецепторов соответственно. Стимуляция 5-НТ2В рецепторов эндотелия приводит к активации Са - независимой NO-синтазы и высвобождению оксида азота с последующей дилятацией артерий среднего калибра [24]. При. дисфункции или повреждении эндотелия, при атеросклерозе снижается 5-НТ2В-стимулированный синтез N0, и начинают преобладать вазоспастические, «проишемические» эффекты серотонина. 5-НТ2С-рецепторы опосредуют серотонин-индуцированное сокращение периферических сосудов [105].
Большое биологическое значение имеет серотонин при кровотечениях. Он выделяется из разрушающихся тромбоцитов и препятствует кровотечению, вызывая сужение просвета сосуда. Во второй фазе свертывания крови, после образования тромба, серотонин расширяет сосуды. Серотонин является одним из пусковых факторов активации тромбоцитов при агрегации и тромбообразовании, возникающих при ишемии, контакте с инородной поверхностью. Активация тромбоцита приводит к выбросу серотонина, который через 5-НТ2А рецепторы, находящиеся на мембране, активирует другие тромбоциты [65]. Серотонин вызывает агрегацию тромбоцитов и полимеризацию молекул фибрина, при тромбоцитопении способен нормализовать ретракцию кровяного сгустка. 1.2. Функциональное значение симпатоадреналовой системы в регуляции инотропной функции миокарда
Катехоламины синтезируются в ЦНС из заменимой аминокислоты -тирозина [135]. Тирозин под воздействием фермента - тирозин гидроксилазы превращается в предшественника катехоламинов - 3,4-диоксифенилаланин (ДОФА). Фермент тирозингидроксилаза выявлена в надпочечниках, в ткани мозга и периферической нервной системе. Декарбоксилирование аминовой группы превращает ДОФА в дофамин. Дофамин в ЦНС выполняет роль не только предшественника норадреналина, но и медиатора [193, 218]. Под воздействием фермента — дофамингидроксилазы происходит превращение дофамина в норадреналии - медиатор центральной и периферической нервной системы. Нейромедиатор норадреналии выделяется в кровь окончаниями симпатических постганглионарных нейронов. В мозговом веществе надпочечников, представляющими собой видоизмененные симпатические ганглии, норадреналин под влиянием метилтрансферазы превращается в адреналин. Выделение катехоламинов из мозгового вещества надпочечников регулируется со стороны центральной нервной системы. При возбуждении преганглионарных волокон у человека в кровоток обычно выбрасывается смесь катехоламинов, состоящая из адреналина (около 80%) и норадреналина (около 20%).
"Концентрация норадреналина в плазме зависит от баланса между поступлением норадреналина в плазму и его удалением. Инактивация норадреналина происходит путем обратного захвата адренергической терминалью, тканями организма и деградацией ферментами, включающими моноаминоксидазу (МАО) и катехол-о-метил трансферазу (КОМТ). МАО имеет две изоформы: МАО-А и МАО-В. Моноаминоксидаза является внутриклеточным ферментом и локализована внутри пресинаптической терминали, тогда как КОМТ связана с постсинаптической мембраной [135].
Основной метаболит дофамина — гомованилиновая кислота, метаболиты адреналина и норадреналина по пути О-метилирования -метанефрин и ванилинминдальная кислота, выделяемые с мочой.
Несмотря на существование в сердце 4-х типов Р-АР наиболее изученными являются (Зі, pVAP. Стимуляция pVAP активирует Gs-цАМФ-протеинкиназа А сигнальный внутриклеточный каскад, тогда как pVAP связаны не только с Gs-белком, но и с Gi-белком [44, 126, 222]. В норме желудочки и предсердия сердца человека содержат J3j и Рг-АР. Превалирующим типом является Pi-АР в сравнении с р2-АР. В желудочках здорового человека отношение рьРг составляет 77:23 [43]. Р-АР в норме участвуют в реализации положительного инотропного, хронотропного, люзитропного эффектов и увеличении скорости проведения возбуждения (положительного дромотропного эффекта).
Метод исследования сократимости миокарда
На установке Power Lab, датчик силы MLT 050/D (ADInstruments) in vitro проводились эксперименты по определению инотропной функции миокарда десимпатизированных крыс и пациентов с ХСН. Десимпатизация, как модель ХСН, создавалась ежедневным введением гуанетидина подкожно (Guanethidine Monosulfate, Sigma) в дозе 30 мг/кг крысам с рождения до 21 дня жизни. В качестве контроля в те же сроки вводился 0,9% раствор NaCl. У наркотизированных уретаном (800 мг/кг) крыс вынимали сердце.
Сегмент ушка правого предсердия получали при операциях аорто-коронарного шунтирования у пациентов с ишемической болезнью сердца и при протезировании митрального клапана по поводу ревматических пороков сердца, проводившихся в кардиохирургическом отделении Межрегионального клинико-диагностического центра Республики Татарстан. Сегмент ушка правого предсердия сразу же после забора помещался в охлажденный до 4С модифицированный раствор Кребса. Время от забора материала до начала эксперимента не превышало 50 минут. Сердце крысы, сегмент ушка правого предсердия людей помещали в чашку Петри с оксигенированным рабочим раствором при подключенном стимуляторе ЭСЛ-2 (Россия) с частотой стимулов 6 в минуту, амплитудой сигнала 10 MV, продолжительностью стимула 5 мс. Далее препарировали полоски миокарда длиной 4-5 мм и диаметром 0,8-1 мм. Препарат фиксировали вертикально одним концом к датчику силы, другим - к точке опоры, затем каждый препарат погружали в отдельный резервуар объемом 25 мл, в который подавали рабочий раствор при температуре 28С и карбоген (95% 02 и 5% С02). Состав рабочего раствора (цМ/л): NaCl-119,8; КСІ-5,4; СаС12- 1,8; MgCl2- 1,05; NaHP04- 0,42; аскорбиновая кислота - 0,28; глюкоза - 5,05. Для поддержания рН в пределах 7,3-7,4 в раствор добавляли основной и/или кислотный буферы Trizma (все вещества Sigma, USA). Препараты стимулировали через серебряные электроды выше приведенными характеристиками.
Последовательность опыта: После погружения препаратов в резервуары следовал период приработки в течение 40-60 минут, в ходе которой мышечным полоскам постепенно придавалось оптимальное натяжение. Оптимальным натяжением считалась такая точка растяжения препарата, после преодоления, которой начиналось снижение силы сокращения препарата. По окончании приработки 5 минут регистрировали исходные параметры сокращения, затем 20 минут - с добавлением в рабочий раствор исследуемого вещества. По окончании стимуляции препараты трехкратно отмывали рабочим раствором в течение 5 минут, затем регистрировали исходные показатели для каждой последующей концентрации исследуемого вещества.
Оценивали реакции силы сокращения полосок миокарда правого предсердия, правого желудочка сердца крысы на серотонин (5 45 hydroxytryptamine hydrochloride, Sigma) в трех последовательно возрастающих концентрациях-0,1 дМ, 1,0 дМи 10,0 дМ.
Оценивали реакции силы сокращения полосок миокарда ушка правого предсердия пациентов с хронической сердечной недостаточностью на серотонин (5-hydroxytryptamine hydrochloride, Sigma), адреналин (Adrenalini hydrochloride, Sigma), агонист 5-HT2B рецепторов (m-CPP hydrochloride, Tocris) в трех последовательно возрастающих концентрациях - 0,1 дМ, 1,0 цМ и 10,0 дМ. В качестве контроля использовался физиологический контроль.
Амплитудно-временные характеристики сокращения рассчитывали по Laer [173]. Силу сокращения выражали в граммах, реакцию на исследуемое вещество рассчитывали в процентах от исходного показателя. Обрабатывались изменения времени сокращения и расслабления на введение исследуемых веществ с последующим расчетом изменений скоростей сокращения и расслабления миокарда. Временные характеристики анализировали в абсолютных единицах (с). Общее время сокращения (t total) включает в себя время сокращения (t max) и время расслабления (t min).
Получение плазмы. Забор венозной крови проводился из локтевой вены у больных непосредственно после сна в 7.00-7.30, в положении лежа из заранее установленного катетера. Кровь в объеме 10 мл собиралась в охлаждаемую льдом пластиковую пробирку, содержащую 50 мкл гепарина "для инъекций". Из каждой пробы крови брали объём 10 мкл для подсчёта тромбоцитов в камере Горяева. Кровь центрифугировалась при t + 4С, 1000 оборотов в минуту в течение 10 минут. Надосадок (плазма, обогащенная тромбоцитами) центрифугировался при 2700 оборотах 15 минут для осаждения тромбоцитов.
Подготовка пробы для определения серотонина в плазме крови. К 0,5 мл размороженной плазмы добавляли 50 мкл внутреннего стандарта (3,4-дигидроксибензиламина (ДГБА) 5 нмоль/мл в 0,1 N НСЮ4) и 100 мкл 1,0 N НСЮ4. К осадку тромбоцитов добавляли 1.0 мл 0,1 N НСЮ4 с 0,5 нмоль/мл внутреннего стандарта ДГБА. Встряхивали 10 сек (Vortex) и затем для осаждения перхлоратов ставили на 5 мин в морозильник. Встряхивали и центрифугировали 3-5 мин при 8-10000 g на центрифуге Eppendorf. Надосадок (25 мкл) вводили в петлю инжектора ВЭЖХ с электрохимической детекцией. Условия разделения аналогичны применявшимся при определении катехоламинов.
Подготовка пробы для определения катехоламинов. В пробирку на 5 мл вносили 1,5-2 мл плазмы и добавляли 50 мкл 0,5 нмоль/мл внутреннего стандарта ДГБА. В стандартную пробу вносили 50 мкл смеси определяемых соединений (по 0,5 нмоль/мл каждого) в 2 мл фосфатного буфера. Добавляли 500 мкл 1,5 М трис-буфера рН=8,6, 25 мг адсорбента (активированного А1203 - Биохром, Москва).
Эксперименты проведены совместно с к.м.н. B.C. Кудриным, к.б.н. П.М. Клодт на базе Научно-исследовательского института фармакологии им. В.В. Закусова Российской академии медицинских наук. Пробы встряхивали на вибромиксере 30 с, затем встряхивали либо вручную 5 мин либо на горизонтальном встряхивателе 10 минут. Центрифугировали на центрифуге (ОПн-8) при 2000 об/мин. в течение 3 минут, надосадочную жидкость удаляли пастеровской пипеткой. Осадок адсорбента дважды промывали пипеткой по 2 мл бидистиллированной воды, встряхивая по 1 минуте, каждый раз удаляя воду досуха, а после второго раза центрифугировали при 2000 об/мин. в течение 3 минут, тщательно удаляя промывную воду. Для десорбции (выделения) катехоламинов к промытому адсорбенту добавляли 100 мкл 0,2 М НСЮ4, встряхивали на вибромиксере 1 минуту, центрифугировали при 2000 об/мин в течение 3 минут.
Серотонин в регуляции инотропной функции правого предсердия и правого желудочка десимпатизированных крыс
Сила сокращения предсердий десимпатизированных крыс составляет 0,278 г и не отличается от исходного показателя животных контрольной группы. Серотонин в концентрациях 0,1 цМ, 1,0 цМ и 10,0 цМ увеличивает силу сокращения предсердий десимпатизированных крыс на 0,152 г (р 0,05); 0,331 г (р 0,001); 0,447 г (р 0,01) соответственно. Максимальная реакция на серотонин в концентрации 10,0 нМ у десимпатизированных крыс составляет 91,97±21,75%, что в 3 раза выше, чем у контрольных. Следовательно, у десимпатизированных крыс повышена положительная инотропная реакция предсердий на серотонин. Влияние серотонина на временные характеристики сокращения предсердий десимпатизированных крыс. Общее время сокращения предсердий контрольных крыс составляет 1,537 с, из них 0,542 с длится сокращение, а 0,978 с - расслабление (табл. 3.2). F,r К 0.327±0.044 0.386І0.049 0.53б±0.066 0.б05±0.064 д 0.278±0.02б 0.430±0.064 0.609±0.076 0.725±0.072 t total, с к 1.537±0.116 1.737±0.120 1.898±0.139 1.998±0.147 д 1.465±0.038 1.631±0.026 1.894±0Л12 1.913±0.117 t max, с к 0.542±0.019 0.587±0.019 0.б42±0.02б 0.662І0.025 Д 0.513±0.023 0.58R0.016 0.613±0.002 0.620±0.014 t min, с к 0.978±0.091 1.15Ш.103 1.27 НО. 116 1.294±0.132 Д 0.919±0.024 1.048±0.024 1.309±0.115 1.330±0.107 Примечание: 5-НТ — серотонин, К— контроль, Д— десимпатизация, F — сила сокращения, t total — общее время сокращения, t max — время сокращения, t min — время расслабления. - достоверность различий по сравнению с исходными показателями ( - Р 0,05; - Р 0,01; - Р 0,001).
Серотонин в концентрации 10,0 цМ увеличивает общее время сокращения миокарда на 0,461 с (р 0,05). Данный эффект реализуется через увеличение времени, затраченного как на сокращение, так и на расслабление. Наиболее выраженная реакция наблюдается на серотонин в концентрации 10,0 цМ, который увеличивает время сокращения на 0,12 с (р 0,001), а время расслабления - на 0,316 с (р 0,05). Следовательно, у контрольных крыс повышение силы сокращения предсердий на серотонин сопровождается увеличением общего времени сокращения за счет времени сокращения и времени расслабления, с большим вкладом последнего. Общее время сокращения предсердий десимпатизированных крыс составляет 1,465 с, из них 0,513 с длится сокращение, а 0,919 с расслабление. Серотонин в концентрациях 0,1 цМ, 1,0 цМ и 10,0 цМ увеличивает общее время сокращения миокарда на 0,200 с (р 0,001), на 0,361 с (р 0,001), 0,461с (р 0,001), соответственно. Данный эффект реализуется через увеличение времени, затраченного как на сокращение, так и на расслабление. Наиболее выраженная реакция наблюдается на серотонин в концентрации 10,0 цМ, который повышает время сокращения на 0,107 с (р 0,001), а время расслабления - на 0,411 с (р 0,001). Таким образом, повышение силы сокращения предсердий на серотонин десимпатизированных крыс (рис. 3.12) сопровождается увеличением общего времени сокращения за счет увеличения длительности сокращения и расслабления, с большим вкладом последнего.
Серотонин в регуляции инотропной функции правого желудочка десимпатизированных крыс. Серотонин в концентрации 10,0 цМ снижает силу сокращения желудочков контрольных крыс на 0,118 г (р 0,01), что свидетельствует об отрицательном инотропном действии серотонина (табл. 3.2). Сила сокращения желудочков десимпатизированных крыс не отличается от исходного показателя контрольных. Серотонин в концентрации 10,0 цМ увеличивает силу сокращения желудочков десимпатизированных крыс на 50,75±6,45% (рис. 3.13), что на 41% ниже реакции предсердий.
Следовательно, у десимпатизированных крыс серотонин обладает положительным инотропным действием на желудочки крыс по сравнению с отрицательным инотропным действием в контроле. Реакция желудочков десимпатизированных крыс на серотонин ниже, чем предсердий.
Влияние серотонина на временные характеристики сокращения желудочков десимпатизированных крыс. Общее время сокращения желудочков крыс составляет 2,237 с, из них 0,768 с длится сокращение, а 1,470 с - расслабление (табл. 3.3). Таблица 3.3. Влияние серотонина на параметры инотропной функции миокарда правого желудочка десимпатизированных крыс
Серотонин в концентрации 10,0 рМ ускоряет общее время сокращения на 0,674 с (р 0,05), что реализуется через уменьшение времени, затраченного как на сокращение, так и на расслабление. Наиболее выраженная реакция наблюдается на серотонин в концентрации 10,0 дМ, который уменьшает время сокращения на 0,221 с (р 0,001), а время расслабления - на 0,482 с (р 0,05). Таким образом, снижение силы сокращения желудочков на серотонин у контрольных крыс сопровождается уменьшением общего времени сокращения за счет ускорения сокращения и расслабления.
Общее время сокращения желудочков десимпатизированных крыс не отличается от временных показателей контрольных крыс. Серотонин в концентрации 0,1 цМ и 1,0 цМ увеличивает общее время сокращения на 0,280 с (р 0,05) и 0,61 с (р 0,01), соответственно. Данный эффект реализуется через увеличение времени, затраченного как на сокращение, так и на расслабление. Таким образом, увеличение силы сокращения желудочков на серотонин у десимпатизированных крыс (рис. 3.12) сопровождается увеличением общего времени сокращения за счет более продолжительного сокращения и расслабления миокарда.
