Введение к работе
Актуальность проблемы. Физиологический гемостаз - сложный многоступенчатый процесс, основная роль которого - сохранение жидкого состояния крови и предупреждение кровопотери при повреждении сосудов. Формирование гемостатического потенциала определяется активностью и характером взаимодействия плазменных и тромбоцитарных факторов свертывания крови. Нормальный гемостаз обеспечивается равновесием между постоянно осуществляемой с невысокой интенсивностью активацией факторов свертывания и их ингибиторов, и функционированием фибринолитической системы /Гаврилов O.K., 1981/. Однако при существенном напряжении гемостаза (травмы, инфекционные процессы и т.д. /Бышевский А.Ш., Кожевников В.Н., 1986/), свертывающий потенциал крови преобладает над антикоагулянтным, антитромбоци-тарным и фибринолитическим, что может привести к закупорке просвета сосуда гемостатическим тромбом. Для предотвращения этого явления широко применяются прямые антикоагулянты и антиагреганты, арсенал которых, во-первых, недостаточен, во-вторых, имеющиеся эффекторы свертывания, как правило, полифункциональны, что существенно затрудняет их использование.
Так, прямой антикоагулянт - гепарин, отличается сильным, но кратковременным действием. Его недостатки - это сложность дозирования, связанная с зависимостью от уровня антитромбина III в плазме крови; способность вызывать агрегацию тромбоцитов /Bertele е.а., 1983; Cimo е.а., 1979/ и тромбоцито-пению /Borg, 1986/, "эффект бумеранга" /Nordon е.а., 1981/. Известны случаи гепаринрезистентности/Баркаган З.С. и соавт., 1982; 1988/.
К числу прямых антикоагулянтов относится гирудин /Ена Я.М., 1992/, обладающий антитромбиновым действием /Markwardt, 1985; Kaiser, Markwardt, 1988/. Широкого распространения гирудин и его производные не нашли из-за сложной технологии получения и дороговизны /Баскова И.П., 1991/.
В отношении ограничения агрегации тромбоцитов общая картина выглядит еще более удручающей: истинных антиагрегантов не существует, а применяемые помимо агрегации влияют на другие системы организма /Бышевский А.Ш. и соавт., 1996/. К антагонистам агрегации относится аспирин, необратимо ин-гибирущий циклооксигеназу тромбоцитов /Jaffe, Weksler, 1979/, синтез тром-боксана А2 и простациклина /Burch е.а., 1978; Fuster, 1994/. Однако, поскольку эндотелиальные клетки способны к регенерации циклооксигеназы, ингиби-рующее действие аспирина на эндотелиальный простациклин кратковременно и агрегация тромбоцитов может происходить в присутствии аспирина, так как он значительно не ингибирует такие активаторы тромбоцитов, как тромбин и АДФ. Длительное применение аспирина в высоких дозах вызывает негативные явления - образование желудочных язв, внутричерепные и желудочно-кишечные геморрагии и др. /CAPRIE Steering Committee, 1996; Hass е.а., 1989/.
Более новыми антиагрегантами являются производные тиенопиридинов, которые ингибируют АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов. По данным клинических исследований они эффективней аспирина, но вызывают тяжелей-
шиє побочные эффекты - нейтропению, апластическую анемию, тромбоци-топению и др. /Yeh е.а., 1998; Bennett е.а., 1998/.
В связи с этим остается актуальной проблема поиска новых антикогулянтов прямого действия и антиагрегантов. Проходят этап доклинических испытаний пептиды - антифакторы Ха /Ostrem е.а., 1998/, клещевой пептидный антикоагулянт /Lynch е.а., 1995/, полипептид из слюны медицинской пиявки /Kornowski е.а., 1996/. Исследования антиагрегантов тромбоцитов в настоящее время в основном сосредоточены на антагонистах GP ПЬ/Ша-рецептора ввиду его стержневой роли как медиатора агрегации. Среди них можно отметить искусственные антитела /Coller, 1995; Charo е.а., 1987/ и пептидные антиагреганты, имитирующие RGD-последовательность а-цепи фибриногена и действующие как конкурентные антагонисты фибриногена /Lefkovits е.а., 1995/.
Изучаются пептиды, ограничивающие тромбинзависимое превращение фибриногена - аналоги N-концевого участка а-цепи фибриногена с последовательностью GPR/Laudano, Doolittle, 1978; 1979/. Эти пептиды выделены из плазмы крови и тканей внутренних органов человека и животных /Бышевский А.Ш., Чирятьев Е.А., 1986; 1990/, но их применение in vivo невозможно: они быстро элиминируются из кровотока /Бышевский А.Ш., Чирятьев Е.А., 1990/.
В лабораториях ТМА из ряда растений выделены гликопептиды, механизм действия которых имеет сходство с вышеописанными пептидами. По данным И.А. Дементьевой (1991) и О.А. Русаковой (1993) растительные гликопептиды действуют продолжительно (до 24 ч), не вызывают гиперкоагулемии и не обладают токсичностью. Однако их сырьевая база незначительна.
Пептидные эффекторы содержатся во многих водных растениях. Эти растения не отличаются высоким содержанием пептидов, но в процессе естественного концентрирования, при формировании сапропелей, их содержание может быть значительно /Яковлева Н.В., 1998/ при неограниченности сырьевой базы.
Предыдущие исследования подтвердили наличие в экстрактах сапропеля веществ, ограничивающих заключительный этап свертывания крови /Яковлева Н.В., 1998/. Однако однозначно трактовать результаты этих работ нельзя, т.к. используемая фракция содержала комплекс разнородных веществ. Кроме того, исследования не затрагивали тромбоцитарный компонент плазмокоагуляции, хотя фибриноген - ключевой субстрат заключительной фазы свертывания, участвует в процессах агрегации и адгезии тромбоцитов /Панченко Е.П., 1997/.
Цель исследования - получение индивидуальных эффекторов свертывания крови из сапропеля, определение их природы, изучение механизма влияния на плазмокоагуляцию и агрегацию тромбоцитов in vitro, предварительная оценка состояния гемокоагуляции при внутривенном введении эффекторов лабораторным животным.
Задачи исследования. 1. Разработать способ получения из сапропеля индивидуальных эффекторов свертывания крови. 2. Определить природу эффекторов. 3. Расшифровать механизм ограничения свертывающей активности плазмы крови эффекторами in vitro. 4. Определить влияние эффекторов свертывания на процесс агрегации тромбоцитов in vitro. 5. Дать предварительную характери-
стику влияния эффекторов на свертывающую систему крови при их внутривенном введении лабораторным животным.
Научная новизна. Впервые разработан способ выделения из сапропеля двух индивидуальных носителей антикоагулянтной активности. Установлено, что они имеют пептидную природу.
Расшифрован механизм ограничения эффекторами процесса плазмокоагуля-ции: ингибирование фибринообразования реализуется на уровне коагуляцион-ных превращений фибриногена.
Впервые установлено, что полученные эффекторы из сапропеля угнетают АДФ- и адреналин-индуцированную агрегацию тромбоцитов in vitro.
При внутривенном введении эффекторов лабораторным животным развивается продолжительная и дозазависимая гипокоагулемия, обусловленная угнетением плазменного и тромбоцитарного компонентов гемостаза.
Практическая ценность. Впервые разработан способ получения антикоагулянтов из сапропеля, позволяющий получать индивидуальные эффекторы свертывания в количествах, достаточных для их изучения в лабораторных условиях.
Эффекторы из сапропеля способны эффективно ограничивать плазменный и тромбоцитарный компоненты гемостаза in vivo, что может обусловить их ценность, как перспективного средства коррекции гемостаза.
Полученные данные могут быть использованы научными учреждениями, занимающимися проблемами свертывания крови и поиском новых средств воздействия на гемостаз.
