Содержание к диссертации
Введение
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
I. Криогенные изменения в спермиях. Мембранный аппарат как основной объект криоповреждений 6
2. Механические свойства мембран и методы их изучения. Электромеханическая прочность как важный цитофизиологический параметр 15
3. Липиды спермы: функции, состав, изменение при замораживании 33
Резюме. Цели и задачи исследований 47
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ 49
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЕ! 51
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСЛЩЕНИЕ
I. Выяснение механизмов электрического пробоя мембран (модельные опыты на эритроцитах) 69
П. Электромеханическая прочность мембранного аппарата спермиев и физиологическое состояние клеток после замораживания
I. Электрический пробой мембран спермиев.Специфика спермы как объекта исследований 93
2. Электромеханическая прочность мембранспермиев и криорезистентность клеток 106
III. Липидный состав мембран спермиев и криорезистентность клеток 120
ІV.Состояние мембранного аппарата после обработки клеток желтком. К механизму защитного действия лилоидных соединений
I. Электромеханическая прочность клеточных мембран при обработке липоидами 147
2.Липидный состав мембран спермиев после инкубации с желтком 154
У. Широкий производственный опыт по прогнозированию криорезистентности клеток. Ш4
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 170
ВЫВОДЫ 175
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 178
ПРИЛОЖЕНИЯ 179
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 202
- Криогенные изменения в спермиях. Мембранный аппарат как основной объект криоповреждений
- Механические свойства мембран и методы их изучения. Электромеханическая прочность как важный цитофизиологический параметр
- Выяснение механизмов электрического пробоя мембран (модельные опыты на эритроцитах)
Криогенные изменения в спермиях. Мембранный аппарат как основной объект криоповреждений
Во многих работах по сохранению спермы животных вне организма при температурах как выше, так и ниже 0С большое внимание уделено изменению содержания ДНК в клетках. Как показали цитофотометрические исследования, инкубация спермы хряка при 2-4С в течение 1-Ю дней приводит к уменьшению ДНК только в погибших спермиях / Б.П.Кононов, И.И.Соколовская, 1968; Н.Б.Корбан, 1968; В.А.Наук, В.П.Кононов, 1968 /. Хранение спермы хряков и баранов в жидком азоте ( -I96C ) также не вызвало изменения содержания ДНК / В.А.Наук с соавт., 1970; С. Ваtcouuif , Cft/rnof-iadt, 1968 /. После размораживания и инкубации при 37С постепенная потеря ДНК происходит также в основном за счет погибших спермиев. Предполагается, что устойчивость ядер спермиев к внешним повреждениям, в том числе и криогенным, основана на включении в ходе сперматогенеза в хроматин аргининбогатых ядерных белков, образующих в соединении с ДНК губчатую сеть, препятствующую внешним воздействиям /. da&s&wy et od, , , 1977 /.Подтверждением этого служит тот факт, что аминокислоты цитоплазма-тическнх белков подвергаются разрушению, при этом их количество уменьшается на 15-31$ / В.А.Наук, 1971 / и, наоборот, аминокислоты, характерные для гистонов, не изменяются. Значительным изменениям в спермиях баранов подвергаются аминокислоты, входящие в состав мембран / В.А.Наук, 1971 /.
Е.М.Платов и А.М.Николаев, 1966 / показали, что после замораживания в среде без глицерина количество АТФ в клетке снижается в 4 раза, при замораживании с глицерином в 2-2,5 раза. Поглощение кислорода в расчете на живых спермиев при замораживании практически не изменилось, а количество АТФ даже несколько возросло. Как предполагает Е.М.Платов ( 1969, 1973 ), это связано с разобщением в митохондриях фосфорилирования и дыхания. Известно, что процесс анаэробного окисления, сопряженного с образованием АТФ, неразрывно связан с функционированием митохондриаль-ных мембран /RMi&heil , 1966, 1973 /. Потеря мембранами барьерных функций ведет к разобщению дыхания и окислительного фосфорилирования / Б.П.Скулачев, 1972 /. Такое разобщение особенно сально сказывается на сперме хряков, так как в этих клетках анаэробное окисление является основным и, практически, единственным источником энергии / Н.П.Шергин, 1967 /. Поэтому процессы разобщения дыхания и образования АТФ особенно резко снижают оплодотворяемость свиноматок, особенно большое значение дефицит энергии имеет в связи со спецификой половых путей свиней / Б.М.Прокопцев, 1977 /.
При сохранении спермы быков и хряков выявлены значительные потери ферментов - гиалуронидазы, глютамин-щавелевой трансами-назы, и, напротив, повышение активности акрозина /7? fllan , C.ltuivtbk-Мьнп , Ш5;6глАм г cut. , 1967, 1976; Б.М.Прокопцев, 1977 /. Под действием низких температур в спермиях хряков происходит снижение активности как аэробных изоэнзимов лак-татдегидрогеназы ДЦГу и ДДГ, локализованных в митохондриях, так и гликолитических фракций ДЦГ и ДЦГ . При замораживании спермы быков активность кислой АТФазы и пирофосфатаз не изменяется, в то время как активность щелочной АТФазы резко падает / Б.НЛух-рий, 1964, Г.Б.Зверева, Б.НЛухрий, 1972 /.
Механические свойства мембран и методы их изучения. Электромеханическая прочность как важный цитофизиологический параметр
Специфическая структура биологических мембран, их микроскопические размеры, резкая анизотропия по толщине, зависимость состояния мембраны от температуры, геометрии, состава примем-бранного окружения ставит перед исследователями механики мембран проблемы, которые отсутствуют при изучении свойств макроскопических тел / И.Ивенс, Р.Скейлак, 1982 /. Этим отчасти можно объяснить тот факт, что механические параметры мембран изучены гораздо меньше, чем другие физико-химические характеристики. Значительное количество работ посвящено исследованию формы эритроцитов при воздействии различных факторов /MSe&sti , 1975 и др. /, однако, механических характеристик мембран не приводится. Предприняты попытки гидродинамическими методами в потоке жидкости оценить прочность мембран. Клетки пропускают через микроскопическое отверстие /R.Ho&h#itt A/.tfohcwda4 , 1973 ; IB. Кг L &t t A,R \JilUa,nis , 1973 /, либо приклеивают к стеклу и прокачивают вдоль стекла поток жидкости /A/./iphavdai , 1981 /. В работе / У.КгСьеип d A. WitLieuns , 1973 / показано, что тангенциальное гидродинамическое напряжение, приводящее к 50$ гемолиза ( Hjь ) уменьшается с ростом температуры и при 49С Hj/2 - 0, что связывается с температурными перестройками мембран. Можно мерять изгибную жесткость путем деформирования фиксированных клеток тонкой металлической пластинкой /М/По/ілиЖм dat.%. 1980 /, либо втягивать клетки в микропипетки, регистрируя при этом избыточное давление всасывания и форму клеток / И.Ивенс, Р.Скейлак, 1982 /. Существенными недостатками данной группы методов являются большая трудоемкость и непригодность для клеток, обладающих жестким цитоскелетом ( например, спермин млекопитающих ).
Широко распространенным методом оценки состояния мембран является осмотическая резистентность клеток в гипо- ( реже в гипер- )-тонических растворах непроникающих веществ. Осмотическая резистентность клеток меняется с возрастом ///. fiztraat lla. - 17 -ВЫооке. , 1974 /, при различных патологиях ///./notice d u і6аіл 1980 /. Этот параметр сильно зависит от температуры /В.Along, , 1977 /, наличия ионов Са2+ ,/,а + /L Нсооысг i6d&. 1977 /» состояния спектринового каркаса мембран /З.З.З/ющ , 1980 /.Большое значение имеет липидный состав мембраны, в особенности содержание в них холестерина. Полагают, что разрыв мембран в первую очередь происходит в зоне контакта липидов с белками, там где отсутствует холестерин /3. АЕопе , 1977 /. Повышение содержания холестерина уменьшает осмотическую хрупкость эритроцитов /Я.Д.СООРЄ-Ґ it aZ. , 1975 ; С.П.Шашкевич с соавт., 1981 /. Вместе с тем,гипотонический гемолиз происходит в несколько стадий, соотношение времен которых сильно зависит от многих факторов. Все это затрудняет интерпретацию данных, полученных при определении осмотической резистентности клеток /3. Дои& , 1977 /.
Выяснение механизмов электрического пробоя мембран (модельные опыты на эритроцитах)
Нами изучена зависимость степени гемолиза и выхода внутриклеточного К+ от величины приложенного поля ( в дальнейшем -кривые полезвисимого гемолиза и ионного обмена ). Эти кривые отражают конечный процент погибших клеток и входа К+ после достижения равновесия, они проводились через 24-72 часа после обработки клеток ИЭПВН ( в дальнейшем - равновесные измерения ). Важное значение имеет изучение кинетики течения процессов ионного обмена и лизиса клеток, поэтому также определяли гемолиз и выход К+ через определенные промежутки времени Скинетические измерения ). Получено около 180 кривых полезависимого гемолиза и выхода 1С " для эритроцитов человека, телки, кролика и барана. Наиболее детально были изучены эритроциты телки (60 кривых). Результаты, полученные на эритроцитах человека, кролика и барана качественно аналогичны, отличаясь лишь в количественных аспектах, что говорит о едином механизме исследованных явлений.
Типичная кривая поле зави симого гемолиза и выхода К+ показана на рис.2. Она имеет - образный характер и аппроксимируется интегральной кривой распределения Лапласа ( см."Приложение 4" ). Форма кривой практически не меняется,.но ее положение значительно варьировало в зависимости от условий опыта и вида эритроцитов. Характерным параметром, определяющим положение кривой при ее неизменной форме, являлось поле 50$ - гемолиза ( Ej/ ) или 50% - выхода К+ (EKj/2). Эти точки определялись на основе экспериментальных данных поле зависимого гемолиза или выхода К+ стандартным методом наименьших квадратов. Интегральная функция Лапласа представляет собой не аналитическую зависимость, а интеграл от параметра, поэтому использовалось ее асимптотическое разложение в ряд Тейлора-Маклорена с применением микро-ЭВМ "БЗ-2ІМ". Для 30 точек на одной кривой достигалась точность в определении Ej/2 порядка - 0,01 кВ/см.
Известно, что гемолиз эритроцитов - многофазный процесс / V. Zimmwmcum dot, 1976 /, поэтому представляло необходимость раздельно рассмотреть факторы, непосредственно влияющие на сам процесс пробоя в клеточных мембранах и факторы, влияющие на клетку после действия ИЭПШ.
Ранее H.Hlnoslta, JtZTsong, ( 1977-1979 ) показали, что для эритроцитов температура слабо влияет па $пр » кроме того, термо-статирование кюветы ведет к усложнению методики, поэтому мы не исследовали влияние температуры на потенциал пробоя. Обработка клеток ЙЭПВН проводилась при комнатной температуре в пределах 18-г25С. Чтобы разделить остальные возможные факторы, нами была применена методика двух сред ( см."Материалы и методы" ). В первой среде непосредственно проводили обработку клеток электрическим полем ( т.н. "электро"-среда ), после обработки ИЭПШ клетки помещали в среду инкубации ( "лизис"-среда ), где происходил последующий гемолиз. На рис.3 и 4 показано, как изменяется величина поля 50$ гемолиза (Ej А,) при различных параметрах обработки и инкубации.
