Введение к работе
Актуальность исследования. Недавно установленные функции внеклеточной АТФ как трансмиттера и котрансмиттера, регулирующего разнообразные функции организма, в настоящее время находят все новые подтверждения и общее признание. Сегодня трудно найти клетку, в которой нет рецепторов для внеклеточной АТФ. А разнообразие и количество этих рецепторов превышает все известные подтипы рецепторов для «классических» нейромедиаторов и гормонов.
Одним из объектов, в котором пуриновые соединения могут играть важную роль является сердце. АТФ проявляет множество эффектов в сердечно-сосудистой системе, включая хронотропный, инотропный и сосудистый. Иммуногистохимический анализ тканей сердца показал широкое распространение чувствительных к внеклеточной АТФ Р2-рецепторов на сарколемме проводящих и сократительных кардиомиоцитах (T.Webb et al., 1996; M.Hansen et al., 1999). В сердце крысы обнаружены ионотропные Р2Х1,2,4,5 и метаботропные Р2У1,2,4,6,11 - подтипы пуринорецепторов (G.Vassort, 2001).
Интерес к изучению влияния АТФ на деятельность сердца основывается на различных, нередко противоположных результатах. По-прежнему остается нерешенным вопрос том, какое именно соединение оказывает эффект на пуринорецепторы сердца: АТФ или продукт ее гидролиза аденозин? Результаты ранее проведенных исследований привели к убеждению, что механизм действия АТФ основан на непрямом эффекте, наступающем в результате гидролиза АТФ до активного аденозина, действующего на собственные Р1-рецепторы (G. Burnstock and P. Meghji, 1983; G. Froldi et al., 1994, 1997; L.Ren et al., 2003). Согласно последним литературным данным вероятность собственного эффекта АТФ высока.
Действие АТФ может быть реализовано ее прямым влиянием на кардиомиоциты и изменением активности регуляторных каналов сердца. Механизмы положительного хронотропного и инотропного влияния экзогенной АТФ при стимуляции Р2-рецепторов представлены в работах Benham et al., 1987; F.Scamps et al., 1990; J.Zheng et al., 1992; A. Qi and Y.Kwan, 1996; M.Pucat and G.Vassort, 1996; M. Shoda et al., 1997; M.Jaconi et al., 2000; Q.Liu, R.Rosenberg, 2001; Q.Mei, B.Liang, 2001; J.Shen et al., 2007. В настоящее время известно, что АТФ находится в везикулах вместе с АХ или НА и участвует в передаче нервных импульсов, выполняя функции котрансмиттера (G.Burnstock et al., 1989, 1999, 2006, 2009; L.Fieber et al., 1991; A.Pelleg et al., 1997). Исследования подтверждают наличие совместной секреции норадреналина, ацетилхолина и АТФ из симпатических и парасимпатических нервов и способность АТФ модулировать нервную передачу в сердце, увеличивая или ослабляя эффекты, производимые классическими медиаторами (S.Ennion 2000; C.Sesti et al., 2002; S.Boehm et al., 2003). Показано, что АТФ ингибирует освобождение НА через пресинаптические Р2У-рецепторы и ослабляет положительный инотропный эффект при стимуляции симпатических нервов в предсердиях крыс, (I. Kugelgen et al., 1996; B.Sperlagh et al., 2000; D.McKitrick, 2000). Известно, что внеклеточная АТФ вызывает депрессорные рефлексы и брадикардию сердца за счет стимуляции Р2Х-рецепторов, расположенных на вагусных афферентных волокнах, что имеет важное значение при ишемии и гипоксии сердца (G.Katchanov, 1996; A.Pelleg et al., 1997; Z.Xiang, 1998; J.Xu, 2005).
Представление о физиологической роли пуриновых рецепторов будет неполным, если не рассмотреть их взаимоотношения с рецепторами для других нейромедиаторов. В литературе имеются сведения о функциональном взаимодействии пуриновых рецепторов с холинорецепторами (A.Шакирзянова и др., 2005; E.Silinsky, R.Redman, 1994; R.Giniatullin, E.Sokolova, 1998; T.Searl, 1998). Исследования, проведенные на кардиомиоцитах предсердий, показали, что экзогенная АТФ на фоне карбахолина двухфазно изменяет длительность потенциала действия, что подтверждает способность АТФ модулировать эффекты основного медиатора (Y.Hara, H.Nakaya, 1997). Взаимодействие между адренорецепторами и пуринорецепторами в сердце может проявляться и при активации внутриклеточных сигнальных путей (M.Pucat et al., 1998).
Согласно гипотезе Д. Бернстока (1972) функцию медиатора АТФ начала выполнять еще на начальных этапах эволюции, задолго до появления основных медиаторов. АТФ считается одним из наиболее филогенетически древних нейромедиаторов. Подтверждением этой гипотезы является тот факт, что внеклеточный эффект АТФ обнаруживается у примитивных организмов, включающих бактерии и диатомовые морские водоросли (G.Burnstock, 1996). Известно, что и в онтогенезе пуринорецепторы появляются одними из первых. Внеклеточные рецепторы к АТФ, наряду с М-холинорецепторами являются первыми функционально активными мембранными рецепторами, выявляемыми в период формирования зародыша (J.Liou, 1995; L.Sun et al., 1996; J.Shacher, 1997).
На сегодняшний день изучение пуринергической регуляции сердца в онтогенезе затрагивает только неонатальный период развития (T.Webb et al., 1996; Y.Bogdanov et al., 1998; M.Hansen et al., 1999; K.Cheung et al., 2003). Многие аспекты функционирования Р2-рецепторов на важнейших этапах раннего постнатального онтогенеза остаются малоизученными, а постсинаптические эффекты АТФ отличаются в различных тканях и на разных этапах онтогенеза. (G.Vassort, 2001).
Правомерно было бы предположить, что на ранних этапах постнатального онтогенеза, в условиях незрелости симпатических и парасимпатических регуляторных влияний на сердце, его рецепторного аппарата, возможны разные механизмы влияния АТФ на эффекты основных медиаторов и модулирующее влияние АТФ зависит от этапов биологического созревания организма.
Цель и задачи исследования
Целью исследования является определение семейства и подтипа Р2-пуриноцепторов, участвующих в регуляции сердечной деятельности и изучение влияния стойких аналогов АТФ на функциональную активность адрено- и холинорецепторов миокарда крыс в раннем постнатальном онтогенезе.
В работе решались следующие задачи:
1. Установить дозозависимое влияние АТФ на показатели сердечной деятельности крыс 14-, 21-, 56-, 100-суточного возраста in vivo.
2. Изучить влияние АТФ на хронотропную функцию сердца при блокаде -адренорецепторов и М-холинорецепторов сердца.
3. Изучить дозозависимое влияние стойкого аналога АТФ - ,-метиленАТФ на показатели сердечной деятельности крыс 14-, 21-, 56-, 100-суточного возраста in vivo.
4. Определить влияние АТФ и ,-метилен-АТФ на хронотропную реакцию сердца при блокаде Р2-, и Р2У- рецепторов.
5. Определить влияние , –метилен-АТФ на хронотропную реакцию сердца при блокаде Р2Х 1 - рецепторов.
6. Установить дозозависимое влияние АТФ на сократимость миокарда крыс 14-, 21-, 56-, 100-суточного возраста in vitro.
7. Изучить дозозависимое влияние стойкого аналога АТФ - 2-метилтиоАТФ на сократимость миокарда крыс 14-, 21-, 56-, 100-суточного возраста in vitro.
8. Изучить влияние 2-метилтиоАТФ на сократимость миокарда крыс 14 - 100-суточного возраста при блокаде Р2Х и Р2У-рецепторов.
9. Изучить дозозависимое влияние агониста Р2Х1-рецепторов –метиленАТФ на показатели сердечной деятельности крыс 14-, 21-, 56-, 100-суточного возраста в условиях in vivo и in vitro.
10. Определить влияние –метилен-АТФ на сократимость миокарда при блокаде Р2Х1 – рецепторов.
11. Исследовать влияние совместного внутривенного введения ,-метиленАТФ с норадреналином и ацетилхолином на показатели сердечной деятельности крыс 14-, 21-, 56-, 100-суточного возраста in vivo.
12. Исследовать совместное влияние 2-метилтио-АТФ и карбахолина, 2-метилтио-АТФ и изопротеренола на сократимость миокарда крыс 14-, 21-, 56-, 100-суточного возраста.
Положения, выносимые на защиту:
1. АТФ и ее стойкие аналоги повышают сократимость миокарда и частоту сердечных сокращений у крыс 14-100 – суточного возраста за счет активации Р2Х1-рецепторов.
2. На ранних этапах постнатального онтогенеза наблюдается гетерохронное проявление функциональной активности разных подтипов Р2Х-рецепторов в предсердиях и желудочках сердца крыс. Роль Р2Х-рецепторов в положительном инотропном эффекте от 14- к 100-суточному возрасту в предсердиях снижается, а в желудочках возрастает.
3. Чувствительность сердца к агонистам Р2-пуриноцепторов от 14- к 100-суточному возрасту снижается.
4. Стойкие аналоги АТФ модулируют адренергическую и холинергическую регуляцию сократимости миокарда разнонаправленно на разных этапах раннего постнатального онтогенеза крыс.
Научная новизна
В работе впервые показано, что все используемые агонисты Р2-пуриноцепторов: АТФ, , –метиленАТФ, 2–метилтиоАТФ и ,-метиленАТФ вызывают дозозависимое увеличение частоты сердечных сокращений и силы сокращения миокарда предсердий и желудочков. Концентрации агонистов, вызывающие положительный инотропный и хронотропный эффект от 14- к 100-суточному возрасту повышаются, что указывает на более высокую чувствительность миокарда к агонистам Р2Х- рецепторов на ранних этапах постнатального онтогенеза, это 14- и 21- суточные животные. Использование селективного агониста и блокатора Р2Х 1 -пуриноцепторов , -метиленАТФ и TNP АТФ позволило установить подтип Р2Х-рецепторов, участвующих в повышении частоты сердечных сокращений и силы сокращения миокарда. Доказано, что в реализации положительного хронотропного и инотропного влияния принимают участие Р2Х1-рецепторы.
Впервые показаны возрастные особенности реакции сократимости миокарда на стимуляцию агонистами Р2-пуринорецепторов. Максимальная реакция силы сокращения миокарда на 2–метилтиоАТФ и ,-метиленАТФ наблюдается у 21- и 14-суточных крысят достоверно снижаясь к 100-суточному возрасту.
Проведенные серии экспериментов с использованием разнообразных агонистов и блокаторов позволили получить новые данные о возрастных особенностях реакции различных подтипов Р2-рецепторов в регуляции сократимости миокарда в постнатальном онтогенезе. Впервые показано гетерохронное проявление функциональной активности разных подтипов Р2Х - рецепторов в предсердиях и желудочках крыс в раннем постнатальном онтогенезе. Роль Р2Х - рецепторов в увеличении силы и длительности сокращения в предсердиях от 14- к 100-суточному возрасту снижается, а в желудочках возрастает. Участие Р2Х4 -рецепторов в повышении сократимости миокарда желудочков на ранних этапах онтогенеза незначительно и проявляется только у 100-суточных крыс.
При изучении совместного влияния 2-метилтиоАТФ, карбахолина и изопротеренола выявлено, что АТФ модулирует адренергическую и холинергическую регуляцию сократимости миокарда разнонаправлено на разных этапах раннего постнатального онтогенеза крыс. У крыс 21- и 56- суточного возраста совместное действие агонистов – адренорецепторов и Р2Х-рецепторов приводит к развитию однонаправленного, аддитивного эффекта в увеличении сократимости миокарда.
Эффект совместного влияния агонистов Р2-рецепторов 2-метилтио-АТФ и М2-холинорецепторов карбахолина на сократимость миокарда может быть усиливающим или ингибирующим в зависимости от возраста крыс. У 21-суточных крысят 2-метилтиоАТФ снижает угнетающий эффект КХ на сократимость миокарда предсердий и желудочков и усиливает у 14-суточных.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Полученные результаты значительно расширяют представление о физиологической роли внеклеточной АТФ, участии разных подтипов Р2Х-рецепторов в сердечной деятельности крыс в раннем постнатальном онтогенезе.
Результаты проведенного исследования углубляют имеющиеся на настоящее время сведения о роли АТФ в качестве модулятора эффектов классических медиаторов на ранних этапах постнатального онтогенеза крыс, в условиях незрелости регуляторных симпатических и парасимпатических влияний на сердце. Материалы исследований заслуживают внимания со стороны специалистов по возрастной и нормальной физиологии и кардиологии.
Апробация работы
Материалы исследований доложены на Всероссийской научной конференции «Физиология сердца» (Казань, 2005); I Съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005); ХХ Съезде Физиологического Общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007); VII Всероссийском научном симпозиуме «Растущий организм: адаптация к физической и умственной нагрузке», (Казань, 2006); Всероссийской конференции по физиологии кровообращения, ФФМ МГУ имени М.В. Ломоносова (Москва, 2008); VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008); IX Всероссийской научно-теоретической конференции «Физиологические механизмы адаптации растущего организма» (Казань, 2006, 2008); на заседании Татарского отделения Физиологического общества им. И.П.Павлова (Казань, 2009); Международной конференции «Физиология развития человека» Института возрастной физиологии РАО (Москва, 2009); на итоговых научных конференциях профессорско-преподавательского состава Татарского государственного гуманитарно-педагогического университета (2005-2008), на заседаниях кафедры анатомии, физиологии и охраны здоровья человека ТГГПУ (Казань, 2005-2009). Основное содержание работы отражено в 34 работах.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа объемом 290 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания организации и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит 48 таблиц и 37 рисунков. Список литературы включает 474 источника, из них 110 отечественных и 365 зарубежных авторов.
