Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Участие протеиназ гемостаза в сопряжении процессов свертывания крови и воспаления 9
1.1. Свертывание крови при воспалении 10
1.2. Активация PAR рецепторов специфическими и неспецифическими протеиназами 13
1.3. PAR-опосредованные механизмы передачи внутриклеточных сигналов 17
Глава 2. Физиологические функции активированного протеина С 20
2.1. Структурные особенности протеина С, образование АРС 20
2.2. Антикоагулянтные и противовоспалительные свойства АРС 25
Глава 3. Протекторное действие АРС при воспалении и репарации тканей 31
3.1. Механизмы неиммунной активации тучных клеток 31
3.2. Вклад N0 в секреторную активность тучных клеток 35
3.3. Механизмы заживления язвы желудка 37
Экспериментальная часть 45
Глава 4. Материалы и методы исследования 45
Глава 5. Участие протеиназ гемостаза в ответах организма на острое воспаление 55
5.1. Индекс дегрануляции тучных клеток, как характеристика воспаления 55
5.2. Динамика появления протеиназ системы гемостаза в перитонеальной жидкости при воспалении 56
5.3. Блокада гирудином активности тромбина в перитонеальной жидкости 60
Глава 6. Влияние АРС на секреторную активность перитонеальных тучных клеток 62
6.1. Влияние АРС на секрецию тучных клеток с разной функциональной активностью 63
6.2. Исследование активации тучных клеток, полученных от крыс с острым перитонитом 67
6.3. Сравнение эффектов АРС с действием других протеиназ на секреторную функцию тучных клеток 68
Глава 7. Механизмы действия АРС и других протеиназ на тучные клетки 74
7.1. Участие рецепторов PAR в действии АРС на тучные клетки 74
7.2. Роль PARI в действии фактора Ха и дуоденазы на тучные клетки 78
7.3. Дуоденаза, как агонист/антагонист PARI рецепторов тучных клеток 83
7.4. Вклад N0 в действие АРС на секреторную активность тучных клеток 87
7.5. Влияние активации тучных клеток PAR1-AP или АРС, на АДФ-вызванную агрегацию тромбоцитов 92
Глава 8. Влияние АРС и PAR1-AP на процесс заживления экспериментальной язвы желудка у крыс 95
8.1. Кинетика высвобождения PARI-АР из микрокапсул 97
8.2. Влияние инкапсулированного PAR1-AP на процесс заживления экспериментальной язвы желудка 98
8.3. Влияние АРС на процесс заживления экспериментальной язвы желудка 101
Обсуждение результатов 105
Заключение 111
Выводы 112
Список цитируемой литературы 113
- Антикоагулянтные и противовоспалительные свойства АРС
- Динамика появления протеиназ системы гемостаза в перитонеальной жидкости при воспалении
- Влияние АРС на секрецию тучных клеток с разной функциональной активностью
- Роль PARI в действии фактора Ха и дуоденазы на тучные клетки
Введение к работе
При повреждении тканей активируются процессы свертывания крови и воспаления, образуется ряд протеиназ, в том числе сериновые протеиназы системы гемостаза - тромбин, фактор Ха (фХа) и активированный протеин С (АРС). Тромбин - ключевой прокоагулянт, поскольку превращает фибриноген в фибрин - основу тромба, активирует факторы V, VIII, XI, XIII свертывания крови. Связывая рецепторы, активируемые протеиназами (PARI и PAR4), тромбин индуцирует агрегацию тромбоцитов, активацию клеток крови, соединительной ткани и запускает процессы воспаления (Coughlin 2000, 2005; Струкова 2001, 2006). Вместе с тем, тромбин регулирует свертывание крови по механизму отрицательной обратной связи, поскольку связывает на эндотелии нерасщепляемый рецептор -тромбомодулин и превращает протеин С в антикоагулянт - активированный протеин С. АРС, в свою очередь инактивирует факторы Va и Villa, участвующие в образовании протромбина, и тем самым блокирует процесс тромбообразования (Esmon 2003,2005).
В последнее время активно развивается представление о противовоспалительном и антиапоптотическом действии АРС на эндотелиальные клетки и моноциты, а также о его протекторном действии при системном воспалении и сепсисе (Joyce et al., 2004; Mosnier, Griffin 2006). Показано взаимодействие АРС с двумя мембранными рецепторами - эндотелиальным рецептором протеина С (EPCR) (Esmon 2000) и PARI эндотелия (Reiwald, Ruf 2005; Feistritzer et al, 2006). Рецепторы PARI экспрессируются всеми клетками, вовлекаемыми в процессы свертывания крови, воспаления и репарации тканей, что позволяет предполагать их участие в осуществлении острых защитных реакций организма и в патогенезе хронических процессов (Macfarlane et al., 2001; Струкова 2001, 2006). В связи с этим весьма актуальным является изучение рецептор-опосредованных механизмов противовоспалительного действия АРС.
Известно, что при воспалении активируются тучные клетки и освобождают широкий спектр провоспалительных медиаторов, в том числе гистамин, [3-гексозаминадазу, протеазы, цитокины, оксид азота (NO) и др. (Metcalfe et al., 1997). NO регулирует активность тучных клеток, повышая уровень цГМФ, секрецию медиаторов и ингибируя агрегацию тромбоцитов (Bunnett 2006). Тучные клетки тонкого кишечника секретируют дуоденазу (ЕС 3.4.21) - сериновую протеиназу,
обнаруженную в слизистой двенадцатиперстной кишки, которая помимо участия в активации протеиназ пищеварения, может играть роль в воспалении (Pemberton et al., 2002).
Роль АРС и других сериновых протеиназ в механизмах, ответственных за запуск, развитие и/или регуляцию воспалительных и репаративных процессов в тканях еще не достаточно исследована, хотя известно, что повышается экспрессия PAR на поверхности клеток, участвующих в основных этапах репарации тканей (воспалении, пролиферации клеток и созревании ткани) (Струкова 2001). Ранее в нашей лаборатории было установлено PARI-опосредованное действие тромбина и пептидов - агонистов PARI (PARI-АР) на тучные клетки и выявлена аутокринная регуляция оксидом азота ответа тучных клеток (Strakova et al., 1996, 1999). На модели острого перитонита у крыс было показано усиление секреции медиаторов тучными клетками в ответ на действие тромбина и PARI-АР, что свидетельствует о дополнительной экспозиции PARI на тучных клетках в условиях воспаления (Dugina et al., 2003). Иммобилизованный в полимерные матрицы PARI-АР ускоряет заживление кожных ран (у мышей и крыс), что подтверждает регуляторную функцию агонистов PARI при воспалении - первой фазе заживления ран (Strukova et al., 2001, 2002; Дугина и др., 2004). Однако до настоящего времени не было исследовано влияние АРС на активность тучных клеток при воспалении. В связи с этим изучение участия тучных клеток в реализации противовоспалительного действия АРС, а также влияние АРС на процесс заживления экспериментальной язвы желудка представляется весьма актуальным и перспективным.
Цели и задачи исследования.
Цель работы - выявление механизмов действия активированного протеина С (АРС) на секреторную активность тучных клеток при воспалении, и выяснение участия АРС в репарации тканей на модели экспериментальной язвы желудка.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Исследовать динамику появления протеиназ системы гемостаза (фХа, тромбина, АРС) в перитонеальной жидкости (на модели острого воспаления у крыс).
Изучить влияние АРС на секреторную активность перитонеальных тучных клеток в моделях спонтанной и вызванной активации. Оценить влияние АРС на активность тучных клеток, полученных от крыс с острым перитонитом.
Исследовать PAR- опосредованные механизмы действия АРС на тучные клетки.
Исследовать действие АРС на процесс заживления экспериментальной язвы желудка.
Научная новизна работы. На модели острого воспаления у крыс впервые обнаружено появление сериновой протеиназы системы гемостаза - АРС, вслед за появлением тромбина в перитонеальной жидкости.
Впервые показано, что противовоспалительное действие АРС может реализовываться через регуляцию активности тучных клеток. В моделях спонтанной и вызванной активации перитонеальных тучных клеток выявлено, что АРС дозозависимо в узком диапазоне низких концентраций блокирует секрецию медиаторов воспаления тучными клетками. Кроме того, впервые показано протекторное влияние АРС на секреторную активность тучных клеток, полученных от крыс с острым воспалением.
Впервые установлено, что действие АРС на тучные клетки реализуется через активацию PARI рецепторов, поскольку их десенситизация тромбином предотвращает вызываемое АРС снижение секреции р-гексозаминидазы, а инактивированный АРС не имитирует действие фермента на тучные клетки. Показано, что действие АРС на тучные клетки блокируется катепсином G и протеиназой желудочно-кишечного тракта и тучных клеток - дуоденазой, которая, как установлено, стимулирует секрецию медиаторов воспаления перитонеальными тучными клетками через PARI. Показано, что регуляция секреторной активности тучных клеток АРС обусловлена усилением генерации эндогенного оксида азота, о чем свидетельствует отмена защитного действия АРС в присутствии L-NAME -ингибитора образования N0.
На модели экспериментальной язвы желудка у крыс впервые показано, что АРС при однократном введении сокращает фазу воспаления и сдвигает фазу пролиферации на более ранние сроки, что приводит к ускорению заживления язвы желудка.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты данного исследования имеют важное как теоретическое, так и практическое значение. Полученные данные расширяют представления о механизмах защитных функций активированного протеина С в процессах воспаления. Нами обнаружено появление протеиназ системы гемостаза (тромбина и АРС) в перитонеальной жидкости на модели острого воспаления у крыс. Впервые выявлено противовоспалительное действие АРС на перитонеальные тучные клетки в норме и при воспалении. Показано, что АРС блокирует секрецию медиаторов воспаления тучными клетками через высокоспецифичную активацию PARI рецептора и аутокринную регуляцию оксидом азота ответа тучных клеток.
Имеют практическое значение данные о том, что АРС, подобно пептиду-агонисту PARI, иммобилизованному в полимерные микрочастицы, способен ускорять (после однократного внутрижелудочного введения) заживление экспериментальной язвы желудка. Создание нового класса антиульцерогенных препаратов на основе АРС и пептидов-агонистов PARI представляется перспективным в связи с их высокой эффективностью.
Апробация материалов диссертации. Основные результаты работы были доложены на I Съезде физиологов СНГ (Россия, Дагомыс, 2005), Всероссийской конференции «Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром. Современные достижения» (Россия, Москва, 2005), Международной конференции «Биотехнология и медицина» (Россия, Москва, 2006), XIII Международной конференции и дискуссионном научном клубе «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Крым, Гурзуф, 2006), 18-м Международном конгрессе по фибринолизу и протеолизу (USA, San-Diego, 2006), заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ (Россия, Москва, 2006), III Всероссийской научной конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Россия, Москва, 2007), VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Россия, Москва, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ (в том числе 6 статей).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах и включает введение, обзор литературы, описание объекта и методов исследования, результаты, обсуждение, заключение, выводы, список цитируемой литературы (содержит 246 источников). Работа иллюстрирована 47 рисунками.
Антикоагулянтные и противовоспалительные свойства АРС
Антикоагулянтная активность АРС проявляется при его диссоциации от рецептора EPCR, и связывания с поверхностью активированных тромбоцитов, эндотелиальных клеток, микрочастиц или липопротеидов (например, липопротеидов высокой плотности - HDL). Образовавшийся АРС в присутствии кофактора протеина S (витамин К-зависимого белка), иммобилизованного на эндотелии и/или тромбоцитах, специфически расщепляет активные формы факторов Va и Villa ч свертывания крови, кофакторов прокоагулянтов - факторов Ха и 1Ха, блокируя тем самым образование тромбина (Рис. 6) [Mosnier, Griffin 2006; Bunnett 2006]. Способность АРС инактивировать факторы Va и Villa усиливается рядом белковых и липидных кофакторов, таких как протеин S, фактор V и липиды (напр., HDL, фосфатидилсерин, кардиолипин, глюкозилцерамид и др.). АРС также способен повышать фибринолиз [Krishnamurti et al., 1991]. АРС достаточно стабильный фермент и его период полужизни в крови человека составляет 23 мин [Okajima et al., 1990]. Снижение концентрации АРС в циркуляторном русле и устойчивость организма к его антикоагулянтному действию служит потенциальным фактором риска при ишемическом инфаркте [Masko et al., 1996; Fisher et al., 1996; Van der Bom etal., 1996].
Кроме антикоагулянтной активности у АРС обнаружены противовоспалительные и антиапоптотические свойства (Рис. 6, 8) [Yuksel et al., 2002; Esmon 2003; Струкова 2004]. Из известных антикоагулянтов, таких как антитромбин III и TFPI, только АРС оказывается эффективным при лечении системного воспаления и сепсиса [Joyce et al., 2001].
Непрямой противовоспалительный эффект АРС обусловлен антитромботическим действием фермента и реализуется через ингибирование генерации тромбина, обладающего в высоких концентрациях провоспалительной активностью. Тромбин повышает экспрессию Р-, Е- и L-селектинов, активирует хемотаксис лейкоцитов и адгезию тромбоцитов и лейкоцитов эндотелием, стимулирует высвобождение гистамина из тучных клеток крысы [Струкова 2004; Strukova 2006]. Провоспалительные эффекты высоких концентраций тромбина могут быть обусловлены его прямым действием, вызывающим дегрануляцию тучных клеток и освобождение медиаторов воспаления, повышение проницаемости эндотелия вследствие активации ММР-2, ускорения миграции клеток. Также эффекты тромбина опосредованы освобождением им из эндотелия мощного медиатора воспаления и вазодилататора - фактора активации тромбоцитов (PAF), который повышает проницаемость эндотелия сосудов вследствие дестабилизации межклеточных соединений и вызывает хемотаксис моноцитов (Табл. 1) [Струкова 2004]. Механизм действия разных концентраций тромбина отличается: рецептор-независимое расщепление матриксных металлопротеиназ (в частности - ММР-2) и PARl-опосредованный синтез ДНК, пролиферация клеток и активация тучных клеток.
Схемтическая модель антикоагулянтного и цитопротекторного действия АРС [Mosm er, Griffin 2006]. Протеин С активируется тромбином, связанным с ТМ на поверхности клеток эндотелия. На мембране эндотелиальных клеток EPCR связывает протеин С и усиливает его активацию. АРС в комплексе с EPCR не проявляет антикоагулянтной активности. EPCR -необходимый кофактор для непосредственного эффекта АРС на клетки и активации PAR] рецептора.
Прямое противовоспалительное действие АРС обусловлено его способностью предотвращать адгезию лейкоцитов к поверхности эндотелия и их активацию [Murakami et at, 1996; Mizutani et al., 2000; Hoffmann et al., 2005]. АРС снижает продукцию цитокинов (в частности IL-1/3, IL-6, IL-8), адгезивных молекул (Р- и Е-селектинов, ICAM-1, VCAM-1) и других провоспалительных молекул, факторов роста и ряда транскрипционных факторов, что приводит к подавлению начальных стадий воспаления (Рис. 6) [Bernard et al., 2001; Ely et al., 2003; Esmon 2003; Струкова 2004; Ossovskaya, Bunnet 2004; Levi et al., 2004; Feistritzer et al., 2006]. Так, например, нокаутные no ICAM-1 мыши, устойчивы к сепсису [Xu et al., 1994].
Известно, что АРС повышает экспрессию гена eNOS и синтез NO, что в свою очередь играет важную роль в выживаемости эндотелиальных клеток. Антивоспалительное действие NO, в свою очередь, также может быть обусловлено ингибированием экспрессии гена ICAM-1 и других адгезивных молекул эндотелиальных клеткок. Исследования in vitro показали, что АРС через рецептор EPCR взаимоедйствует с протеиназой 3 и Мас-1 активированных нейтрофилов [Kurosawa et al., 2000] и предотвращает адгезию лейкоцитов, а также АРС взаимодействует с определенным сайтом на поверхности моноцитов, вызывает снижение экспрессии ими адгезивных белков, и тем самым блокирует воспалительный процесс [Hancock et al., 1992]. В экспериментах in vitro с применением дважды модифицированного тромбина (2-10 нМ) с отсутствием свертывающей активности и не вызывающего активации PARI, показана существенная генерация АРС, проявляющего PARI-опосредованный протекторный эффект на клетки эндотелия [Feistritzer et al., 2006]. Защитный эффект АРС на клетки эндотелия частично опосредован PARI-вызванной активацией циклооксигеназы 2 и образованием метаболитов простациклина [Brueckmann et al., 2005]. Введение стимулятора генерации эндогенного АРС - белка а-гранул тромбоцитов -тромбоцитарного фактора 4 (PF4) или PF4 - родственных пептидов применяют при лечении сепсиса [Slungaard 2004]. In vitro PF4 в 25 раз ускоряет образование АРС растворимым комплексом тромбина с ТМ, что может быть обусловлена 30-и кратным уменьшением Km связывания протеина С с комплексом тромбин-ТМ и зависит от Гла-домена протеина С и хондроитинсульфатного хвоста ТМ [Slungaard, Key 1994; Dudek et al., 1997]. Эти данные свидетельствуют о противовоспалительном действии АРС при сепсисе.
Известно, что у больных с дефицитом протеина Сиу экспериментальных животных наблюдают летальные исходы при системном воспалении (менингококковой инфекции и сепсисе), число которых уменьшается при лечении таких больных препаратами протеина С и АРС [Bernard et al., 2001]. В основе этого процесса лежит трансактивация EPCR и рецептора сфингозина (S1P1), а так же PARI - зависимая активация рецептора сфингозина, перестройка цитоскелета и усиление барьерной функции эндотелия, что является решающим при лечении препаратами АРС больных сепсисом (Рис. 7) [Feistritzer, Reiwald 2004; Finigan et al., 2005]. Кроме вышеописанных системных эффектов АРС участвует в регуляции воспалений кожи и иммунной защите кератиноцитов кожи [Xue et al., 2007]. Т.о., специфическое противовоспалительное действие АРС на эндотелий обусловлено его способностью взаимодействовать с рецепторами EPCR и PARI на клетках эндотелия и регулировать микроциркуляцию сосудистого русла.
Схема внутриклеточных эффектов при осуществлении противовоспалительного действия АРС. Антиапоптотические свойства АРС проявляются в модуляции активности генов, вовлекаемых в апоптоз. Так, АРС повышает экспрессию антиапоптотических генов или маркеров клеточного выживания (таких как А1 ингибитор апоптоза (IAP), ядерный антиген клеточной пролиферации (PCNA) и др.), подавляет активность проапоптотических генов: гена супрессорного опухолевого белка р53, белка эндошшматического ретикулума - кальретикулина, маркера клеточного апоптоза RMP-2, каспаз 3 и 8, и увеличивает отношение белков Bax/Bci-2 [Cheng et al., 2003; Joyce et al., 2001]. Это проявляется в снижении апоптоза клеток. АРС защищает сосуды и оказывает нейропротекторное действие, блокируя опосредованный белком р53 индуцированный гипоксией апоптоз эндотелиальных клеток мозга человека при ишемии [Masko et а!., 1999; Cheng et al., 2003]. Кроме того, АРС, активируя PARI и PAR3 рецепторы, защищает кортикальные нейроны от апоптоза [Guo et al., 2004].
Динамика появления протеиназ системы гемостаза в перитонеальной жидкости при воспалении
Известно, что при воспалении фенотип эндотелиальных клеток меняется из тромборезистентного в прокоагулянтный и провоспалительный. Активируются проферменты свертывания крови в активные сериновые протеиназы [Schwartz et al., 2000]. Ключевой момент активации свертывания крови при воспалении - это экспонирование на клетках интегрального мембранного белка - ТФ, который в комплексе с фУНа превращает фактор X в активную форму, что стимулирует появление наномолярных концентраций тромбина, достаточных для активации PARI тромбоцитов и превращения протеина С (65-80 нМ в крови человека) крови в
АРС [Струкова 2004]. Концентрация АРС в крови человека даже при сепсисе - менее 0.2 нМ (10 нг/мл) [Macias et al., 2002]. На стадии распространения ТФ/VIIa активирует фактор IX и образует теназу, которая активирует фактор X. Далее следует образование протромбиназы, расщепляющей протромбин (концентрация которого в крови человека -1-2 мкМ) до тромбина (концентрация в крови человека -приблизительно 10 нМ) [Mannet al., 2003].
Ранее в нашей лаборатории было показано увеличение проницаемости эндотелия сосудов тонкого кишечника и появление тромбина в перитонеальной полости крыс в первые 30 минут острого воспаления [Киселева и др., 2004]. Мы предположили, что другие протеиназы гемостаза - фактор Ха, предшествующий тромбину и АРС, образуемый при активации тромбином (связанным с ТМ эндотелия сосудов) профермента - протеина С - могут проникать в очаг острого воспаления из кровотока.
В данной серии экспериментов на 76 самцах крыс линии Вистар весом 250 -300 г исследовали динамику появления сериновых протеиназ системы гемостаза (фактора Ха, тромбина и АРС) в перитонеальной полости при остром воспалении. В исследуемые временные точки после инициации воспаления крыс декапетировали и отбирали перитонеальную жидкость, в которой определяли содержания общего белка и активности фХа, тромбина и АРС по отношению к специфическим хромогенным субстратам.
Определение активности ферментов перитонеальной жидкости по отношению к амидазному субстрату Boc-Pro-Gly-Arg-pNA, специфичному к фактору Ха, не выявило появления фактора Ха в исследуемые промежутки времени (5-180 мин после индукции воспаления) в зоне воспаления (Рис. 16).
Вместе с тем, с помощью специфического хромогенного субстрата S2238 (Н-D-Phe-Pip-Arg-pNA) подтверждено появление тромбина в очаге воспаления. При этом максимум концентрации тромбина (2.37±0.88 нМ/мг белка, п=6) наблюдали уже на 10-й минуте после индукции перитонита (Рис. 17). Концентрация тромбина в перитонеальной жидкости оставалась достоверно высокой на протяжении первых 30 минут воспаления, а затем снижалась. Снижение концентрации тромбина в перитонеальной жидкости после первых 30-и минут воспаления объясняется его малым периодом полужизни в кровотоке [Rezaie 2003].
Появление АРС в перитонеальной полости нами было обнаружено на 60-й минуте после индукции воспаления - в концентрации, в 3.6 раза превышающей исходную концентрацию (1 мин). Отсроченное появление АРС в перитонеальной полости можно объяснить мало эффективным протеолизом тромбином профермента протеина С, обусловленным блокадой экспрессии рецептора тромбина -тромбомодулина, при остром воспалении [Esmon 2003]. Максимальную концентрацию АРС регистрировали на 120-й минуте развития воспаления (4.91±0.9 нМ/мг белка, п=6) (Рис. 18). Этот пик образования АРС в перитонеальной полости при воспалении совпадает с пиком наибольшего индекса дегрануляции тучных клеток, наблюдаемым на 60 - 120 минутах острого воспаления (см. рис. 15). Кроме того, генерация АРС требует присутствия тромбина на поверхности эндотелия [Esmon 2003]. Образующийся на 60-й минуте АРС, возможно, оказывает непрямое противовоспалительное действие, ингибируя дальнейшую генерацию тромбина, который в высоких концентрациях обладает провоспалительной активностью [Dery et al., 1998; Strukova 2006]. Так же протеиназные ингибиторы стимулируют удаление свободного тромбина из перитонеальной полости. Известно, что тромбин в кровотоке подвергается инактивации быстрее, чем АРС [Rezaie 2003].
У животных контрольной группы (внутрибрюшинное введение физиологического раствора) не наблюдали развития острого перитонита и появления фактора Ха, тромбина и АРС в исследуемые временные точки.
Таким образом, нами установлено, что индукция экспериментального воспаления у крыс сопровождается появлением в перитонеальнои полости сериновых протеиназ системы гемостаза - тромбина и АРС. Максимум генерации тромбина наблюдается уже на 10-й минуте воспаления. Максимум генерации АРС наблюдали на 120-й минуте развития воспаления.
Влияние АРС на секрецию тучных клеток с разной функциональной активностью
В экспериментах in vitro нами было исследовано влияние АРС на секреторную активность спонтанных тучных клеток и клеток после их активации (известным дегранулятором - веществом 48/80, протеиназами, воспалительным стимулом) [Metcalfe et al., 1997]. Тучные клетки выделяли из перитонеальной полости крыс [Thon, Uvnas 1967] и исследовали их функциональную активность по способности к освобождению В-гексозаминидазы [Schwartz et al., 1982], секретирующейся из ПТК совместно с медиатором воспаления - гистамином [Metcalfe et al., 1997]. Из данных литературы известно, что in vilro агонист PARI рецептора - тромбин (30 нМ) полностью расщепляет и активирует рецепторы клеточной поверхности за 6 минут [Ludeman et al., 2005]. В связи с этим, в наших экспериментах время инкубации агонистов (в том числе и АРС) с тучными клетками было выбрано равным 10 минутам (при 37С). Активность р-гексозаминидазы определяли по расщеплению специфического хромогенного субстрата р-нитрофенила Ы-ацетил-В-О-глюкозаминида (см. методы).
В первой серии опытов исследовали влияние АРС на секреторную функцию перитонеальных тучных клеток, исходно различающихся по уровню спонтанной активности, определяемой по степени освобождения Р-гексозаминидазы. Перитонеальные тучные клетки, которые высвобождали 13,0±3,1% медиатора, относили к группе с низкой спонтанной активностью (ПТК]), а тучные клетки, которые высвобождали 23.2±8.0% р-гексозаминидазы - к группе с высокой спонтанной активностью (ПТК2).
Морфологические различия тучных клеток с разным уровнем спонтанной активности ПТК1 (А) и ПТК2 (Б) (толуидиновый синий, ув. х 400). Эти группы клеток различались морфологически, и на рисунке 21 представлены различия тучных клеток в этих группах клеток.
Как видно из данных, представленных на рисунке 22, А, в группе ПТК1 активированный протеин С в низких концентрациях (0.5 и 1.0 нМ) вызывал достоверное снижение секреции р-гексозаминидазы ПТК на 54% и 28.4% соответственно относительно спонтанного уровня секреции (13.0±3.1 %) (Р 0.05, п=6). При концентрациях АРС ниже 0.2 нМ (0.05 и 0.1 нМ) и выше 2.5 нМ (5 - 40 нМ) не наблюдали достоверного изменения спонтанной секреции клеток (Рис. 22). В группе тучных клеток с высокой спонтанной активностью (ПТК2) обнаружили усиление протекторного эффекта низких концентраций АРС (0.5, 1.0 и 2.5 нМ) на клетки: достоверное снижение секреции Р-гексозаминидазы ПТК на 43.8%, 36.7% и 25.1% соответственно относительно спонтанного уровня секреции (23.2±8.0%, РО.05, п=6).
Изменение секреции Р-гексозаминидазы перитонеальными тучными клетками крысы (с разной спонтанной секрецией) под действием АРС. РО.05, РО.01 по отношению к спонтанной секреции р-гексозаминидазы, п=6.
Как видно из данных, представленных на рисунке 22 А, в группе ПТК1 активированный протеин С в низких концентрациях (0.5 и 1.0 нМ) вызывал достоверное снижениет секреции Р-гексозаминидазы ПТК на 54% и 28.4% соответственно относительно спонтанного уровня секреции (13.0±3.1%) (РО.05, n=6). При концентрациях АРС ниже 0.2 нМ (0.05 и 0.1 нМ) и выше 2.5 нМ (5 - 40 нМ) не наблюдали достоверного изменения спонтанной секреции клеток (Рис. 22). В группе тучных клеток с высокой спонтанной активностью (ПТК2) обнаружили усиление протекторного эффекта низких концентраций АРС (0.5, 1.0 и 2.5 нМ) на клетки: достоверное снижение секреции Р-гексозаминидазы ПТК на 43.8%, 36.7% и 25.1% соответственно относительно спонтанного уровня секреции (23.2±8.0%, Р 0.05, п=6) (Рис. 22, Б).
Здесь и далее перитонеальные тучные клетки обрабатывали АРС фирмы Chromogenix, очищенным от примесей Са и сконцентрированным на пробирках Центрикон (см. методы). Однако, в качестве контроля, нами также был использован стандартный АРС фирмы Sigma. Было показано, что АРС (Sigma) в концентрациях 0.2, 1 и 2нМ так же вызывал достоверное снижение секреции Р-гексозаминидазы ПТК на 26.4%, 35.4% и 19.5% соответственно относительно спонтанного уровня секреции (22.9±3.9%, РО.05, п=6). При более низких (0.05 и 0.1 нМ) и более высоких концентрациях АРС (4 и 20 нМ) снижение спонтанной секреции было недостоверным.
Изменение секреции р-гексозаминидазы перитонеальными тучными клетками (ПТК) крысы под действием АРС (Sigma) в диапазоне концентраций от 0.05 до 20 нМ; Р 0.05 по отношению к спонтанной секреции, п=6. Во второй серии опытов исследовали влияние АРС на секрецию медиатора тучными клетками, активированными веществом 48/80, известным стимулятором экзоцитоза [Metcalfe et al., 1997].
В наших экспериментах вещество 48/80 в концентрации 400 мкг/мл вызвало высокую степень дегрануляции тучных клеток и высвобождение ими 6-гексозаминидазы. Под действием вещества 48/80 уровень секреции В-гексозаминидазы составил 53.6±5.7% (при спонтанной секреции, равной 13.0±3.11%). Установлено, что АРС в диапазоне концентраций от 0.5 до 2.5 нМ вызывал достоверное снижение секреции Р-гексозаминидазы тучными клетками, стимулированными веществом 48/80 (PO.0I, п=6). Секреции 3-гексозаминидазы такими клетками составила от 47.б1±0.8% до 38.34±1.7%. Более высокие концентрации АРС (3 и 5 нМ) не вызывали достоверных изменений индуцированной веществом 48/80 секреции В-гексозаминидазы .
Влияние АРС на вызванную веществом 48/80 секрецию р-гексозаминидазы тучными клетками ( Р 0.05, Р 0.01 по отношению к секреции, вызванной веществом 48/80, п=6).
Т.о., АРС в узком диапазоне низких концентраций проявляет противовоспаительное действие, снижая секрецию медиатора Р-гексозаминидазы тучными клетками с разной спонтанной активностью и секрецию, вызванную дегранулятором - веществом 48/80. Наши данные о защитном действии только низких концентраций АРС коррелируют с данными литературы, из которых известно, что концентрация эндогенного АРС в крови человека в условиях сепсиса -менее 0,2 нМ (10 нг/мл) [Macias et al., 2002], а фармакологическая концентрация вводимого АРС в крови больных - 0,9 нМ (45нг/мл) [Ludeman et al., 2005].
Роль PARI в действии фактора Ха и дуоденазы на тучные клетки
Как было показано выше (см. гл. 6.3) дуоденаза участвует в процессах воспаления, стимулируя секрецию Р-гексозаминидазы тучными клетками. Из данных литературы известно, что дуоденаза активирует фибробласты предположительно через активацию PAR2 [Pemberton et al., 2002]. Для выяснения, участвуют ли RAR рецепторы в реализации действия дуоденазы на тучные клетки, мы проводили две серии исследований. В первой изучали влияние инактивированной дуоденазы на тучные клетки. Во второй - до действия активной дуоденазы проводили десенситизацию PARI тромбином.
О необходимости протеолитической активности дуоденазы для проявления ее провоспалительного действия свидетельствуют эксперименты по ингибированию ее ферментативной активности. С помощью SBBI было заблокировано более 99% протеолитической активности дуоденазы по отношению к субстрату TosGlyProLys-pNA. Блокада активности дуоденазы привела к существенному ингибированию способности фермента стимулировать секреторную функцию ПТК. Секреция тучных клеток в ответ на дуоденазу (8нМ), инактивированную SBBI, составила 12.18±0.43% при спонтанной секреции Р-гексозаминидазы, равной 7.15 ± 0.28%. В то время как активная 8 нМ дуоденаза вызывала достоверное повышение освобождения медиатора до 20.43±0.07% (Р 0.05, п=4) (Рис. 31).
Эти результаты свидетельствуют о том, что для проявления действия дуоденазы на тучные клетки нужна протеолитическая активность. И эффекты дуоденазы реализуются при взаимодействии ее с протеолитически расщепляемыми рецепторами, по-видимому, принадлежащими к подтипу PARI, хотя не исключено участие PAR2 в реализации действия дуоденазы.
Следующим этапом работы было изучение активности тучных клеток после десенситизации PARI тромбином. Как видно из данных, представленных на рисунке 31 десенситизация тромбиновых рецепторов не влияла на секрецию медиатора ПТК, вызванную веществом 48/80, однако существенно снижала вызванную дуоденазой секрецию Р-гексозаминидазы. Так, если дуоденаза (20 нМ) вызывала достоверное увеличение на 38.7±1.9% секреции Р-гексозаминидазы относительно спонтанного уровня, то после десенситизации PARI рецепторов тромбином этот эффект дуоденазы отсутствовал (Р 0.05, п=4) (Рис. 32. Эти данные могут свидетельствовать о том, что рецептором дуоденазы на тучных клетках служит PARI. Для выяснения, участвуют ли RAR1 рецептор в реализации действия фактора Ха на тучные клетки, мы так же десенситизировали PARI тромбином. Установлено, что десенситизация тромбиновых рецепторов не влияет на секрецию медиаторов ПТК, вызванную 45 нМ фактором Ха (Рис. 33). Эти данные свидетельствует о том, что, в отличие от АРС и дуоденазы, действие фактора Ха на тучные клетки реализуется не через PARI рецептор.
Предварительная 10-минутная обработка тучных клеток АРС (0.9 нМ) так же не влияла на вызванную фактором Ха (2.4 нМ) секрецию В-гексозаминидазы (Рис. 34). Эти данные служат еще одним доказательством того, что фактор Ха проявляет свое стимулирующее действие на тучные клетки не через рецептор PARI, а через какой-либо другой рецептор. Возможно, рецептором фактора Ха на тучных клетках, как и на клетках эндотелия, служит PAR2 [Camerer et al., 2000, 2002; Riewald, Ruf 2001; Ruf et al., 2003; Ruf 2004; Strukova 2006], поскольку, как показано ранее в нашей лаборатории, пептид-агонист PAR2 стимулировал освобождение р1-гексозаминидазы и гистамина тучными клетками [Dugina et al, 2003].
В настоящее время известно, что все подтипы PAR рецепторов экспрессируются в желудочно-кишечном тракте [Vergnolle 2000] и их локальная экспрессия может регулироваться воспалительным процессом [Nelken et al., 1992]. Так же известно, что при воспалительных заболеваниях желудочно-кишечного тракта повышается экспрессия АРС [Nakamura et al., 2005]. В следующей серии опытов для проверки PARI-опосредованного действия АРС, как регулятора воспалительных процессов, мы индуцировали активацию тучных клеток эндогенной сериновой протеиназой двенадцатиперстной кишки - дуоденазой (80 нМ).
Из данных, представленных на рисунке 35 видно, что 10-минутная предварительная инкубация ПТК с АРС отменяла провоспалительный эффект 80 нМ дуоденазы на тучные клетки, возвращая их к уровню секреции, вызванной АРС.
Таким образом, как показали наши исследования, рецептором АРС на тучных клетках служит PARI и он же является рецептором дуоденазы. Об этом свидетельствуют две серии опытов: отсутствие регуляторного эффекта у инактивированных ферментов АРС и дуоденазы и отмена вызванного АРС и дуоденазой эффекта на тучные клетки после десенситизации тромбиновых PARI рецепторов. Противовоспалительное действие низких концентраций АРС на тучные клетки, обусловлено активацией PARI рецепторов. Дуоденаза действует через PARI, подобно другим неспецифическим низкоафинным активаторам этого типа рецепторов, таким как катепсин G, гранзим А, трипсин, плазмин, проявляющим провоспалительную активность [Strakova 2006; Ludeman et al., 2005; Ossovskaya, Bunnet 2004]. Рецептором для фактора Xa на тучных клетках является не PARI рецептор, а какой- либо другой протеиназами расщепляемый рецептор, возможно, PAR2.
