Введение к работе
Актуальность проблемы. Исключительная прикладная значимость изучения иксодовых клещей состоит в том, что они являются переносчиками возбудителей опасных трансмиссивных заболеваний человека и животных, таких как весенне-летний энцефалит, болезнь Лайма и другие боррелиозы, различные геморрагические лихорадки, лихорадка Скалистых гор, паралич скота и многие другие. Одним из самых распространенных видов рода Ixodes в Российской Федерации является таежный клещ (Ixodes persulcatus Sch.), обладающий широким поясным ареалом, проходящим по южной части России (Романенко, 2007).
Знание конкретных механизмов реализации поисковой активности клещей как главного фактора, определяющего вероятность попадания особи на прокормителя, может быть использовано в разработке более эффективных средств управления поведением данных эктопаразитов. Внутри одного вида прокормителя существуют половые и возрастные различия особей по зараженности членистоногими эктопаразитами (Crooks, 2001; Hughes, 2001). Является ли это следствием различий в поведенческой активности или результатом разной ольфакторной привлекательности индивидуумов до конца не ясно. Существует всего несколько работ, выполненных на гамазовых клещах и их прокормителях – летучих мышах, посвященных изучению половых различий в привлекательности запаха хозяина (Christe, 2007). Согласно этим работам, запах самки летучих мышей является более привлекательными по сравнению с запахом самцов. В работе Романенко (2006) показана большая привлекательность запаха мужчины по сравнению с запахом женщины. При этом, не известны компоненты, ответственные за реализацию данного эффекта. Не изучена даже привлекательная значимость половых феромонов человека, многие из которых идентифицированы и синтезированы (Michael et al., 1975; Grosser et al., 2000) и, соответственно, доступны для исследования.
Известно, что запаховые стимулы играют ведущую роль в определении клещом наиболее вероятного места встречи с прокормителем. В поведенческих опытах, подтвержденных электрофизиологическими исследованиями, определен спектр аттрактивных для клеща веществ, являющихся компонентами запаха шерсти и выдоха млекопитающих, который во многом совпадает со спектром аттрактантов других паразитических видов (Guerin et al., 2000). Метод, использованный в большинстве работ, связанных с электрофизиологическим ответом клеща на запаховые стимулы, основан на регистрации первичной сенсорной информации. Этот метод позволяет судить о наличии рецепторов к данному спектру веществ, но не оценивать значимость стимула для клеща. Поэтому при поиске веществ для управления поведением клеща целесообразно регистрировать ответ на запаховый стимул в областях вторичной обработки информации, поступающей от органов восприятия в обонятельные ядра синганглия.
Среди причин, определяющих изменчивость поведенческих реакций клеща, заслуживают внимания вариации его внутреннего состояния, в частности, степень гидратированности и энергетические запасы, которые формируют конкурирующие мотивации – уход в подстилку для пополнения запасов влаги и стремление к поиску прокормителя как необходимые условия для ресурсного обеспечения следующих фаз жизненного цикла (Леонович, 1989). Кроме того, согласно результатам некоторых авторов, на поведение клеща влияет его инфекционный статус. В ряде работ продемонстрирована связь между наличием боррелии B. Burgdorferi sp. sl. в кишечнике Ixodes persulcatus и локомоторной активностью данного вида клещей (Наумов, 1999; Alekseev, 2000). Также известно, что, у клещей присутствуют суточные изменения активности. До конца не ясно, являются ли они лишь результатом дегидратации в процессе ожидания прокормителя, или же у клещей есть эндогенный ритм активности, который определяет изменения поисковой мотивации в соответствии со временем суток.
Внутренними механизмами, регулирующими пищевое поведение членистоногих, являются октопамин- и серотонинергические системы нейромедиаторов (Дьяконова, 2007). Известно, что в синганглии (мозге) иксодовых клещей в большом количестве присутствуют как октопаминовые, так и серотониновые рецепторы. Вместе с тем, их влияние на поисковое поведение клеща практически не изучено. При этом, нейротрансмиттерные системы мозга клеща могут являться мишенью для акарицидных средств.
Исходя из всего вышесказанного, были сформулированы цель и задачи исследования:
Цель исследования
Изучить поведенческий и электрофизиологический ответ таежного клеща (I. persulcatus) на половые феромоны человека в зависимости от индивидуальных особенностей данного эктопаразита.
Задачи:
-
Исследовать поведенческую реакцию I. persulcatus на синтетические половые феромоны человека и другие запаховые стимулы в условиях высокого (тест ольфакторного преферендума) и низкого (тест запахового поля) градиента концентрации данных стимулов.
-
Оценить влияние физиологического возраста, инфекционного статуса клеща, времени суток на его спонтанную двигательную активность и ольфакторное поведение.
-
Исследовать электрофизиологический ответ синганглия таежного клеща на половые феромоны человека и другие запаховые стимулы.
-
Исследовать роль серотонина и октопамина в регуляции ольфакторного поведения и электрофизиологического ответа синганглия таежного клеща на синтетические половые феромоны человека и другие запаховые стимулы.
Положения, выносимые на защиту:
-
-
Ключевую роль в формировании поведенческого ответа таежного клеща на ольфакторные стимулы играет его мотивационное состояние, формирующееся, прежде всего, под действием эндогенных факторов.
-
Октопамин и серотонин регулируют поведенческую активность таежного клеща. Серотонин повышает уровень двигательной активности таежного клеща и не влияет на его мотивацию. Октопамин снижает уровень локомоторной активности клеща и меняет его мотивационное состояние.
-
Компоненты синтетического женского феромона человека являются аттрактивными сигнальными стимулами для таежного клеща. Мужской синтетический феромон не вызывает ни поведенческого, ни синганглионарного ответа клеща.
Научная новизна. Впервые у клещей в синганглии локализована область вторичной обработки сенсорной информации и зарегистрирована ее реакция на различные запаховые стимулы. Впервые показана корреляция между поведенческой реакцией и сдвигом фокального потенциала синганглия иксодового клеща (I. persulcatus) в ответ на различные запаховые стимулы. Впервые на основе и поведенческих, и электрофизиологических опытов продемонстрирована сигнальная значимость женского полового феромона для клещей. Впервые для клещей показано наличие эндогенного суточного ритма поисковой активности. Впервые исследовано влияние серотонина и октопамина на поведенческие и электрофизиологические ответы клеща, вызванные запаховыми стимулами. Показано, что серотонин повышает локомоторную активность и амплитуду электрофизиологической реакции синганглионарных центров обработки сенсорной информации в ответ на хемосигналы разной модальности, а октопамин подавляет поисковую мотивацию.
Практическое значение. Разработана методика регистрации электрофизиологического ответа областей синганглия клеща, ответственных за обработку сенсорной информации и формирование двигательного ответа на ольфакторные стимулы. С помощью данной методики можно осуществлять быстрый поиск аттрактантов и репеллентов. Эта методика является скрининговой, подходит для быстрой потоковой проверки большого количества химических соединений. Эффективность поведенческого и электрофизиологического скрининга возрастает при использовании клещей с высокой поисковой мотивацией. Для этого разработана методика автоматической поведенческой классификации клещей по уровню мотивированности на поиск прокормителя. Данные о роли серотонина и октопамина в модуляции поведения таежного клеща могут помочь в разработке новых средств управления поведением клеща. Так же, на основе наших данных можно заключить, что использование парфюмерных средств с добавлением синтетических половых феромонов привлекает клещей к местам, посещаемым людьми, и, соответственно, повышает риск укуса клещом и инфицирования.
Апробация и публикации. Основные положения работы были представлены на IX международной конференции по исследованию вкуса и запаха (Пекин, 2009). По теме диссертации опубликовано 4 работы.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования изложенных в 4 главах, посвященных спонтанной активности и поведенческому ответу таежного клеща на запаховые стимулы, влиянию нейротрансмиттеров на поведение данного вида; влиянию возбудителей трансмиссивных инфекций, физиологического возраста и времени суток на поведение клеща и исследованию его электрофизиологического ответа на запаховые стимулы. Работа содержит обсуждения, выводы и список используемой литературы, который включает 211 названий. Работа изложена на 177 страницах. Иллюстративный материал представлен 9 таблицами и 36 рисунками.
Сбор клещей проводили на территории дендрария Центрального Сибирского ботанического сада СО РАН (ЦСБС СО РАН) с 2006 по 2009 гг. во 2-3 декаде мая. После отлова клещей помещали во влажный бинт и содержали при + 4 0С. Через неделю их пересаживали в камеры дифференцированной влажности, которые представляли собой стеклянные пробирки с градиентом влажности между сухой ватной пробкой и влажной ватой на дне (Alekseev, Dubinina, 1996).
Использованные запаховые стимулы. В качестве запаховых стимулов использовали женский (осмоферин, OSMOPHERINE) и мужской (осмоферон, OSMOPHERONE) феромоны. В состав осмоферина входят производные жирных кислот (пирролин изовалерианат и бутират), которые, содержатся в вагинальном секрете женщин в рецептивную фазу менструального цикла (Michael et al., 1975). Осмоферон представляет собой производное андростенола (4,16-андростандиен-3-он), входящее в состав мужского пота (Michael et al., 1975). Использовали 0,25%-ые водные растворы феромонов, данная концентрация рекомендована компанией производителем в качестве добавки в парфюмерные композиции, имитирующие естественный запах мужчин или женщин. Кроме того, в качестве негативного контроля использовали вещества с известной химической формулой, обладающие репеллентным эффектом для клещей, 10% раствор аммиака и 96% этиловый медицинский спирт, а также 30% раствор ДЭТА.
В качестве препаратов, предположительно модулирующих поведенческий ответ таежного клеща, использовали два основных нейротрансмиттера беспозвоночных октопамин и серотонин. На основе пилотных экспериментов (данные не представлены) была выбрана концентрация 10-6 М для обоих нейротрансмиттеров. Это соответствует данным литературы об использовании этих веществ для модуляции активности других видов беспозвоночных (Barron et al., 2002; Claassen D.E., Kammer, 1986).
Тест на высоту подъема. Для измерения высоты подъема использовали установку, состоящую из стеклянного капилляра диаметром 1 мм и длиною 40 см, наклоненного под углом 750. Нижний конец капилляра был опущен в чашку Петри, заполненную водой, а верхний (около длины) был освещен 100 Вт лампой. Таким образом, клещ совершал вертикальные миграции в условиях градиента температуры и влажности.
Тест ольфакторного преферендума (ТОП). Для тестирования использовали установку, состоящую из расположенного горизонтально Y-образного стеклянного тройника, выходы из которого были закрыты для тестируемого клеща наконечниками, изготовленными из пластмассовых пробирок (эппендорф). Концентрации запаховых стимулов в рукавах тройника были исследованы методом газовой хроматографии на поликапиллярном хроматографе с фотоионизационным детектором ЭХО-В ФИД. Соотношение концентраций запахового стимула в разных рукавах тройника соответствовала пропорции - 0:0,5:1. В данной установке были созданы условия высокого градиента запахового стимула при переходе из одного рукава в другой.
Тест запахового поля (ТЗП). Для изучения поведения клещей в запаховом поле, использовали чашку Петри диаметром 9 см с нанесенным запаховым стимулом, помещенную в центр вентилируемого пластикового бокса (30 см Х 50 см Х 40 см). Скорость потока воздуха в месте размещения чашки составляла 0,5 м/с. Стимул наносили на внутреннюю поверхность чашки Петри. Для каждого стимула использовали отдельную чашку, которую после окончания тестирования тщательно отмывали и ополаскивали дистиллированной водой. Концентрации запаховых стимулов в разных точках установки были исследованы методом газовой хроматографии на поликапиллярном хроматографе с фотоионизационным детектором ЭХО-В ФИД. Для сбора проб использовали пассивные концентраторы на основе сорбента Tenax TA. Концентрация запахового стимула внутри чашки Петри менялась на порядок медленнее, чем в условиях ТОП (низкий градиент запаха).
Обработка видеозаписей. В работе использовали свободно распространяемую программу ImageJ (версия 1.43u, с ), написанную на языке программирования Java и предназначенную для обработки цифровых изображений. Дальнейшую обработку данных проводили с помощью программного обеспечения разработанного автором данного диссертационного исследования.
Электрофизиологические исследования были выполнены на отдельной группе самок таежного клеща (n = 25) методом вызванных потенциалов (ВП). Отведение суммарных (фокальных) электрических потенциалов производили от наружной поверхности синганглия в преэзофагальной области (см. рис. 1). Использовали стеклянные регистрирующие микроэлектроды, заполненные физраствором, с диаметром отверстия 20-30 мкм, индифферентный электрод находился в том же растворе, что и синганглий.
Рисунок 1.
Вид сверху на препарат клеща (Б), используемый в электрофизиологических опытах, с указанием места отведения на сагиттальном срезе синганглия (А). Штриховая стрелка указывает положение условного сагиттального среза. Штрихпунктирная стрелка указывает положение органа Галлера. Синганглий на рисунке находится в черном квадрате (А, Б). Положение электрода (El); подача стимула в область органа Галлера (Р1, Р2); эзофагус (E) проходит сквозь синганглий. (AcN) ассоциативные нервные волокна; (ChG) хелицеральный ганглий; (OpsG) опистоматический ганглий; (PG1-4) с 1 по 4 педальный ганглий; (PhN) фарингеальный нерв; (PpG) педипальпальный ганглий; (Pr) процеребрум; (PriN) первичный нерв; (RN) рекуррентный нерв; (SbP) постэзофагальная часть; (SpP) преэзофагальная часть; (StP) стомодеальный мост (Marzouk et al., 1987).
Определение наличия ДНК боррелии и РНК вируса клещевого энцефалита в организме клеща выполнялось сотрудниками ИБХиФМ СО РАН с помощью PCR и RT-PCR анализа, соответственно (Ткачев и др., 2007; Фоменко и др. 2006).
Определение физиологического возраста (истощенности жирового тела) клеща проводили методом световой микроскопии (в проходящем свете), на основе степени контрастности кишечника особи по отношению к окружающим тканям (модификация методики Разумовой (Разумова, 1975)).
Сравнение частот встречаемости проводили по критерию 2. Для показателей, чьи вариационные ряды приближались к нормальному, применяли дисперсионный анализ. При множественном сравнении средних применяли LSD тест, а при сравнении 2-х средних t-критерий Стьюдента. На графиках, в тексте и в таблицах данные представлены в виде среднее ± стандартная ошибка среднего (±SE).
Похожие диссертации на Поведенческий и электрофизиологический ответ таежного клеща (Lxodes persulcutus Sch.) на половые феромоны человека и другие запаховые стимулы
-
