Содержание к диссертации
Введение
Глава І Обзор литературы 11
1.1 Особенности адаптационной реакции у самок и самцов 11
1.2 Роль митохондрий в поддержании активной работы и обеспечении стресс-резистентности организма 15
1.2.1 Строение и функции митохондрий 15
1.2.2 Проявление стресса на уровне митохондрий 26
Глава II Материалы и методы исследований 29
2.1 Объекты исследований 29
2.2 Методы исследований 29
2.2.1 Получение митохондриального препарата 29
2.2.2 Методика выделения митохондрий 31
2.2.3 Измерение поглощения кислорода митохондриями печени 32
2.2.4 Определение параметров дыхания митохондрий 34
2.2.5 Измерение активности митохондриальной АТФ-азы 37
2.2.6 Определение активности сукцинатдегидрогеназы 37
2.2.7 Определение активности цитратсинтазы 38
Глава III Результаты исследований 40
3.1 Влияние введения адреналина и серотонина на митохондриальное окисление сукцината и а-кетоглутарата 40
3.2 Влияние ЭГТА в среде выделения на выявление эффекта адреналина 50
3.3 Особенности фосфорилирующего дыхания митохондрий самок и самцов в условиях покоя и острого стресса 53
3.4 Особенности разобщенного дыхания митохондрий самок и самцов в условиях покоя и острого стресса 60
3.4.1 Параметры дыхания митохондрий самок и самцов при разобщенном окислении сукцината в условиях покоя и острого стресса 60
3.4.2 Параметры дыхания митохондрий самок и самцов при разобщенном окислении а-кетоглутарата в условиях покоя и острого стресса 67
3.5 Активность сукцинатдегидрогеназы и цитратсинтазы у самок и самцов в условиях покоя и острого стресса 76
3.6 Активность митохондриальной АТФ-азы у самок и самцов в условиях покоя и острого стресса 80
3.7 Влияние кастрации самок и самцов на основные показатели митохондриального дыхания в условиях покоя и острого стресса 87
3.7.1 Особенности фосфорилирующего дыхания митохондрий кастрированных самок и самцов в условиях покоя и острого стресса 87
3.7.2 Особенности разобщенного дыхания митохондрий кастрированных самок и самцов в условиях покоя и острого стресса 92
Глава IV Обсуждение результатов исследования 103
Выводы 111
Список литературы 113
- Особенности адаптационной реакции у самок и самцов
- Роль митохондрий в поддержании активной работы и обеспечении стресс-резистентности организма
- Измерение поглощения кислорода митохондриями печени
- Влияние введения адреналина и серотонина на митохондриальное окисление сукцината и а-кетоглутарата
Введение к работе
Актуальность проблемы Одним из самых ярких проявлений феномена полового диморфизма является меньшая по сравнению с женщинами, продолжительность жизни мужчин, а также большая уязвимость последних к действию стрессорных и патологических факторов (Анищенко Т.Г., 2001, Vina J, Sastre J, Pallardo F, Borras C, 2003), Несмотря на имеющиеся сведения о различиях в стресс-устойчивости самок и самцов, вопрос о причинах этих различий остается открытым, а экспериментальная биология продолжает описывать механизмы стресса на примере самцов, что в конечном итоге скрывает от исследователей значительную часть проблемы.
Возможно, именно возникновение в процессе эволюции разных ролей мужского и женского пола в популяции определило их различную устойчивость к стрессу. Самки, обладая более пластичными адаптивными системами, лучше приспосабливаются к действующему негативному фактору, в то время как самцы ищут выход из неблагоприятных условий, в большей степени, чем самки, подвергаясь прессингу естественного отбора (Геодакян В. А., 1991).
Известно, что реакция на действующий стресс-фактор носит типовой характер и заключается в последовательной активации стрссс-реализующсй и стресс-л имитирующей систем, основными представителями которых являются соответственно адреналин и серотонин (Меерсон Ф.З., 1979). Каскад этих реакций в конечном итоге направлен на перераспределение энергетических ресурсов и повышение эффективности преобразования энергии окисляемых субстратов в форму АТФ митохондриями.
Однако, существующие данные о влиянии гормонов стресса на метаболизм митохондрий зачастую противоречивы и сделать по ним обобщение затруднительно. Существуют сведения об ингибировании ферментов цикла Кребса в условиях стресса (Покровский А.А. и др., 1968). В то же время сообщалось, что катехоламины активируют митохондриальные ферменты (Кулинский В.И., 1977) и, в частности, сукцинатдегидрогеназу (Вдовиченко Л.М., 1973). Одной из причин этого может являться то, что общепринятые методы работы с митохондриями не позволяют выявлять такие тонкие физиологические эффекты как влияние гормонов на ферментные системы митохондрий. Это побуждает к поиску таких методических подходов, благодаря которым получаемые митохондрии максимально сохраняли бы свои физиологические свойства, присущие им в целом организме. В частности, показано, что использование гомогенатов тканей, а не отмытых митохондрий, позволяет исследовать митохондрии в условиях, значительно приближенных к физиологическим (Kondrashova M.N., 2001). Есть сведения о том, что реакция на стресс или переход к интенсивной деятельности связаны с увеличением вклада сукцината в процессы окисления в митохондриях (Кондрашова М.Н., Григоренко Е.В., 1985). Открытие многих уникальных свойств сукцината позволило обособить его в ряду субстратов цикла Кребса и охарактеризовать его как наиболее мощный источник энергии в митохондриях (Кондрашова М.Н., 1991). Обнаружено, что мужские стероидные гормоны при добавлении in vitro существенно повышают сопряжение в дыхательной цепи, поддерживаемое окислением сукцината. Высказано предположение, что обеспечение максимального сопряжения под действием стероидных гормонов формирует резерв для развития более интенсивной работы мужскими особями (Starkov А.А., 1997) Учитывая зависимость скорости образования активных форм кислорода от величины мембранного потенциала митохондрий (Владимиров Ю.А. и др., 1972; Иванова Е.В., 1991) можно предположить, что такое преимущество может обернуться для самцов усилением повреждения ДНК и, как следствие, уменьшением продолжительности жизни (L. Borras, 2003).
7 Наличие открытых вопросов относительно участия митохондрий в реализации стрессорнои реакции и возможной роли половых гормонов в регуляции митохондриальных функций определило цель и задачи наших исследований.
Цель исследования Изучение влияния гормонов стресса и фактора пола на митохондриальный метаболизм в условиях покоя и острого стресса, а также исследование возможного влияния половых гормонов на ферментные системы митохондрий с предварительной модификацией метода получения митохондриального препарата.
Задачи исследования
Изучить влияние введения гормонов стресса - адреналина и серотонина in vivo на интенсивность окисления ключевых субстратов цикла Кребса — сукцината и а-кетоглутарата в митохондриях.
Выяснить возможность исключения хелаторов (ЭГТА) из среды выделения для наилучшего сохранения свойств митохондрий при их получении.
Исследовать половые особенности фосфорилирующего и разобщенного дыхания митохондрий в условиях покоя и острого стресса.
Изучить половые особенности в активности сукцинатдегидрогеназы, цитратсинтазы и АТФ-азы митохондрий в условиях покоя и острого стресса.
Выявить влияние кастрации на особенности фосфорилирующего и разобщенного дыхания митохондрий самок и самцов в условиях покоя и острого стресса.
8 Научная новизна:
Нами был модифицирован метод получения митохондриального препарата, что позволило впервые применить для представленных исследований гомогенаты тканей без использования ЭГТА в качестве хелатора. Получены оригинальные данные о стимулирующем влиянии адреналина и подавляющем действии серотонина на окисление сукцината.
Впервые проведен комплексный анализ особенностей митохондриального метаболизма в условиях покоя и острого стресса с учетом полового фактора. Обнаружено, что митохондрии самцов обладают исходно более высоким сопряжением и отзываются на стресс усилением окисления сукцината, в то время как митохондрии самок, находясь в более активном состоянии в покое, не проявляют выраженной реакции на острым стресс.
Новыми являются данные о влиянии кастрации на половые особенности фосфорилирующего и разобщенного дыхания митохондрий в условиях покоя и острого стресса. Выявлено, что уровень половых гормонов влияет на сопряженность митохондрий, но различия по параметрам фосфорилирующего дыхания, по-видимому, определяются другими факторами.
Научная и практическая значимость работы
Проведена модификация метода получения митохондриального препарата и показана целесообразность исключения ЭГТА из среды выделения с целью наилучшего сохранения физиологического состояния исследуемых митохондрий.
Полученные результаты расширяют представления о механизмах реализации стресса на субклеточном уровне. Обнаружено, что митохондрии участвуют в формировании стрессорного ответа, что выражается в
9 наращивании мощности окисления сукцината, в то время как окисление
НАД-зависимых субстратов не увеличивается или даже снижается.
Предотвращение гиперактивации митохондриального аппарата при длительном стрессе может обеспечивается торможением
Сукцинатдегидрогеназы серотонином - гормоном стресс-лимитирующеи системы.
Обнаруженные нами половые особенности метаболизма митохондрий и их стресс-реактивности позволяют включить данный фактор в комплекс причин, определяющих различную продолжительность жизни мужских и женских особей.
Положения, выносимые на зашиту
Действие адреналина и серотонина проявляется соответственно в усилении и ингибировании окисления сукцината, что может являться отражением работы стресс-реализующей и стресс-лимитирующей систем на уровне митохондрий.
Митохондрии самцов, обладая исходно более высоким сопряжением и низким дыханием, отзываются на стресс усилением окисления сукцината, в то время как митохондрии самок, находясь в более активном состоянии в покое, не проявляют выраженной реакции на острый стресс.
Половые различия в параметрах разобщенного дыхания митохондрий определены наличием андрогенов в организме самцов.
Половые гормоны не играют принципиальной роли в обеспечении половых различий по параметрам фосфорилирующего дыхания митохондрий в покое и в условиях стресса.
Апробация работы
Основные результаты диссертационного исследования были доложены и обсуждены на заседаниях кафедры физиологии человека и животных,
10 Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной 150-летию со дня рождения И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 1999), Российской конференции «Нейроэндокринология - 2000» (Санкт-Петербург, 2000), 5' Symposium «Free Radical in Biology and Medicine»(Potand, Lodz, 2000), Восьмой международной конференции «Математика, компьютер, образование» (Пущино, 29 января-4 февраля 2001 года), Всероссийской конференции «Митохондрии в патологии» (Пущино, 28-31 мая 2001 года), XI европейском конгрессе по гипертензии «13th European Meeting on Hypertension» (Италия, Милан, 2001 г), Научно-практической конференции с международным участием «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 6-10 мая 2004 года).
Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов собственных исследований, выводов и списка литературы, включающего 78 отечественных и 93 иностранных источника. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 18 таблицами.
Особенности адаптационной реакции у самок и самцов
Стресс и вызываемые им последствия оказывают огромное влияние на жизнь и здоровье современного человека (Губачёв Ю.М., 1976; Инчина В.И., 1996; Ведяев Ф.П., 1983). Как известно, стресс является причиной возникновения целого спектра психосоматических заболеваний, прежде всего, сердечно-сосудистой системы, пищеварительной и т.д. На фоне резко возросшего уровня заболеваний стрессорного генеза отмечается повышенная склонность мужчин по сравнению с женщинами к этим патологиям и как следствие увеличение разрыва в продолжительности жизни (Анищенко Т.Г. 1991, Vina J., et al. 2003). Феномен различной устойчивости к стрессу и продолжительности жизни мужских и женских особей, скорее всего, основан на возникновении в процессе эволюции разных ролей мужского и женского пола в популяции. Оперативная роль самцов заставляет их находиться в его оставаться/ в зонах элиминации и подвергаться интенсивному отбору. Предназначение самок носит консервативный характер и заключается в производстве потомства и закреплении эволюционно выгодных признаков (Геодакян В.А., 1991). Такое распределение функций неизбежно приводит возникновению глубоких различий в физиологии и устойчивости к стрессу мужских и женских особей (Анищенко Т.Г., 1989). Медицинская статистика свидетельствует о том, что мужчины в большей степени, чем женщины, подвержены риску возникновения сердечно-сосудистой патологии и других заболеваний стрессорного генеза (Гринхалг P.M., 1984, Stoney С, Davis М., Matthews К., 1987, Tunstall-Pedoe Н., Kuulasmaa К., Amouyel P. et al., 1994, Roger V., Jacobsen S., Pellikka P. et al., 1998, Glynn L.M., Christenfeld N., Gerin W., 1999).
Согласно литературным данным, индивидуальная устойчивость организма к стрессорным воздействиям зависит от генетических факторов (Агаджанян Н.А., 2001, Gotshal R.W., 1994, Виру А.А., 1981, Selye П., 1976), от состояния стресс-реал изуюших и стресс-лимитирующих систем (Добромыслова О.П., 1986, Меерсон Ф.З., 1964, Судаков К.В., 1997), а также от устойчивости механизмов саморегуляции отдельных функциональных систем (Тигранян Р.А., 1988, Хайдарлиу С.Х., 1984) и особенностей эмоциональной реактивности организма (Анохин П.К., 1978, Суворова В.В., 1975, Фёдоров Б.М., 1977, Фролов М.В., 1974).
Повышенная предрасположенность мужчин по сравнению с женщинами к патологиям сердца и сосудов выводит на первый план исследования посвященные изучению половых особенностей реактивности сердечно-сосудистой системы. Показано, что у женских особей сердечнососудистая система обладает более благоприятным режимом функционирования при стрессе и более высокой скоростью восстановительных процессов (Анищенко Т.Г., 2000). В условиях эмоционального стресса у мужчин наблюдается больший по амплитуде подъем систолического давления, а восстановление до исходного уровня идет медленнее, чем у женщин (Light КС, 1993, Allen МТ. 1997., Michael Т., 1997). Экспериментальная ишемия приводит к достоверному увеличению количества внутриклеточного Са2+ в кардиомиоцитах самцов, но не у самок, что является повреждающим фактором для миокарда самцов. Причиной этого может являться более высокая активность К-АТФазы в сердечной мышце самок, предотвращающая избыточное накопление внутриклеточного Са"+ (Ranki H.J., et al. 2001). Показано, что различная у мужчин и женщин устойчивость ССС к стрессорным повреждениям в значительной мере обеспечивается за счёт половых особенностей в реакциях на стресс симпато-адреналовой и холинергической систем в соотношении центральных и периферических механизмов, регулирующих кардиогемодинамические изменения при стрессе (Судаков К.В., 1983, Юматов Е.А., 1980, Carter D.A., Williams T.D., 1986). Поданным Беляева Ф.П. (Беляев Ф.П., 1983), у женщин в ситуациях стрессорных воздействий сердечная деятельность осуществляется интенсивнее и более экономично, чем у мужчин.
Более высокая, по сравнению, с самцами стресс-устойчивость самок может обеспечиваться более эффективным взаимодействием стресс-реализующей и стресс-л имитирующей систем в организме самок. Отмечается, что у самок уровень норадреналина в разных отделах мозга в 3 раза выше, чем у самцов (Siddiqui A., Gilmore D., 1988). Наряду с этим у самок обнаружен и более интенсивный метаболизм дофамина, и более высокая активность дофамин-декарбоксилазы (Vaccari A. et al., 1977).
При изучении активности ацетилхолинэстеразы в крови и отделах сердца у белых крыс разного возраста обнаружили, что активность фермента в крови и сердце самцов ниже, чем у самок соответствующих групп (Анищенко Т.Г., 1992). По мнению некоторых авторов, т.к. уровень активности ацетилхолинэстеразы в целом отражает уровень активности холинергической системы, то полученные результаты могут говорить о более высоком уровне функционирования холинергической системы у женских особей, по сравнению с мужскими (Bedran-de-Castro М.Т., 1992). Было показано, что в состоянии покоя у женщин более выражен холинергический тонус, а у мужчин - тонус симпатической нервной системы. В процессе возрастной социально-производственной адаптации также наблюдается преимущественная активация холинергических механизмов у женщин и адренергических - у мужчин (Jezova D., Jurankova Е., 1996).
Значительно различаются поведенческие реакции самок и самцов в ответ на стрессорное воздействие. При использовании стресса «хищник-жертва» опытные самки в большей степени, чем самцы проявляли оборонительное поведение (Klein S.L., et al.). Интересные экспериментальные данные приводит Макарчук Н.Е. (1998). Обнаружено, что лишенные обоняния самцы крыс проявляют повышенную двигательную активность, в то время как самки не изменяют типа своего поведения. Это еще раз иллюстрирует авангардную роль мужского и консервативную роль женского пола в популяции (Геодакян В.А., 2000). Под воздействием хронического стресса самцы крыс теряли в весе, а у самок такого изменения не наблюдалось (Faraday М.М., 2000).
Половые особенности в устойчивости к стрессу могут быть объяснены различной глюкокортикоидной и симпато-адреналовой чувствительностью самок и самцов. Показано, что в условиях холодового стресса у испытуемых женщин, но не у мужчин, в крови повышается уровень адреналина, адренокортикотропного гормона и кортизола (Gerra С, at al. 1992). Кроме того, есть сведения о том, что эстрогены активируют экспрессию гена кортикотропин-релизинг фактора, что обуславливает более высокие резервы для выброса глюкокортикоидов (Vamvakopoulos N.C., Chrousos G.P., 1993).
Повышенную устойчивость женского организма к сердечнососудистым заболеваниям можно объяснить более высоким у них уровнем антиоксидантов и более низкой интенсивностью перекисного окисления липидов (ПОЛ) (Dhalla А.К., 1994, Diaz-Velez C.R., 1996). Как известно, активация ПОЛ при стрессах является общим патогенетическим звеном ряда заболеваний, особенно сердечно-сосудистой системы, диабета (Manson J.F., 1993). Показано, что интенсивность свободно-радикальных процессов во всех возрастных группах у женщин меньше, чем у мужчин. При стрессорных воздействиях активируется не только ПОЛ, но и антиоксидантные ферменты в различных органах - в печени, почках, и особенно, в сердце (Singal К., 1998). Стрессогенная активация перекисных процессов несет в себе опасность повреждения ДНК и преждевременного старения. Обнаружено, что содержание продуктов ПОЛ и поврежденность ДИК в митохондриях самцов выше, чем у самок. Это может являться следствием активирующего действия эстрогенов, на экспрессию генов антиоксидантной защиты (Vina J., 2005).
Роль митохондрий в поддержании активной работы и обеспечении стресс-резистентности организма
Митохондрии содержатся в цитоплазме клетки и представляют собой микроскопические палочковидные или иной формы образования, количество которых в одной клетке составляют сотни или тысячи (например, в одной клетке печени крысы содержится около 1000 митохондрий). Для одного и того же типа клеток число митохондрий более или менее постоянно (Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф., 1990).
Митохондрии - это везикулярные структуры, образуемые наружной и внутренней мембранами. Наружная мембрана гладкая. Внутренняя мембрана образует складки, или кристы, окружающие матрикс. Матрикс, примерно на 50% состоит из белка и имеет очень тонкую структуру. Внутренняя мембрана митохондрий непроницаема для большинства ионов, включая ионы водорода, натрия, калия, хлора. Но она, как и другие биологические мембраны проницаема для воды, поэтому, объем митохондрий зависит от концентрации ионов внутри и снаружи. В норме концентрации частиц по обе стороны митохондриальной мембраны равны, при патологии концентрация внутри обычно повышается и митохондрии «набухают» (Владимиров Ю.А., 1999). В митохондриях сосредоточено большое количество ферментов. Наружная мембрана не содержит ни одного из компонентов дыхательной цепи. Возможно, что наружная мембрана играет роль перегородки, отделяющей внутреннюю, рабочую часть митохондрии от всего остального пространства клетки (Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф., 1990).
Г. Кребс на основании простых, но выдающихся опытов с дыханием суспензий мышц открыл цикл лимонной кислоты как главный клеточный механизм окисления углеводов (Krebs Н.А., Kornberg H.L., 1957). В 1940 г. Клод (Claude А., 1946) начал систематическое изучение структуры, функции и химического состава митохондрий и микросом, изолированных центрифугированием из гомогената печени. Полное значение роли митохондрий в клеточном дыхании было раскрыто исследованиями полиферментной системы печени, которая катализирует окисление жирных кислот.
Дальнейшее раскрытие особенностей структуры и функции митохондрий происходило в экспериментах с использованием электронной микроскопии. Независимо друг от друга Sjostrand и Palade опубликовали снимки, демонстрирующие основные особенности структуры митохондрий. Было выяснено, что митохондрии имеют две мембраны и внутренняя образует кристы, которые делят матрикс на множество отсеков (Sjostrand F.S., 1956; Palade G.,1952). Применение электронно-микроскопической томографии к интактным митохондриям некоторых различных тканей в 1990 г. позволило выяснить истинную структуру митохондрий. Трехмерные изображения показали, что кристы не являются просто складками, а имеют трубчатую структуру (Mannella С. et al., 1994; Mannella С. et al., 1997; Penczek P. et al., 1995). Эта особенность имеет определенное функциональное значение, в частности для регуляции скорости образования АТФ в различных условиях. Особенности структуры внутренней мембраны митохондрий в значительной степени обусловлены природой её липидного бислоя. Фосфолипиды митохондрий содержат значительные количества ненасыщенных жирных кислот (36% общего количества жирных кислот), более 95% молекул, которых локализованы в р-положении фосфолипидов. Липиды биологических мембран - это не только структурные элементы: воздействуя на белки, они принимают участие в регуляции биохимических процессов. В первую очередь это относится к митохондриальным мембранам, содержащим ферментные системы биологического окисления. Большинство ферментов внутренней мембраны тесно связаны с липидами и не могут активироваться при их отсутствии. Вследствие чего дыхание и окислительное фосфорилирование очень чувствительны к липидному составу митохондрий, особенно к липидному составу внутренней мембраны (Самарцев В.Н., 2000). Деление митохондрий не прекращается в течение всего клеточного цикла. Так, митохондрии мышц растут и размножаются не только в процессе миогенеза, но также и в условиях мышечной нагрузки (Brunk C.F., 1981; Moyes CD., 1997). Размножение митохондрий может быть усиленно различными веществами, например: бензодиазепин, ингибиторы окислительного фосфорилирования, кальций (Bereiter J. et al., 1994; Vorobjev LA., Zorov D.B., 1983; Muller J. et al., 1986; Kawahara H., 1991). Кроме того, длительный холодовои стресс увеличивает количество митохондрий в жировой ткани, что является важнейшим механизмом поддержания энергетического баланса и температуры тела (Klaus S., et al., 1991).
Митохондрии демонстрируют разнообразие форм и типов распределения в клетке. Притом, что их внутренняя структура постоянна, внешняя форма весьма изменчива. Было показано, что кроме классических «бобовидных» органелл, наблюдаемых в электронный микроскоп, митохондрии часто обнаруживаются в виде разветвленной сети (Chen L.B., 1988). Подобные сети очень активны в растущих клетках. Септированные и трубчатые участки, соединяясь, образуют целую, сообщающуюся сеть (BereiterJ., 1990).
Митохондрии справедливо называют «энергетическими станциями» клетки, поскольку именно в этих органеллах в основном происходит улавливание энергии, поставляемой окислительными процессами. Митохондриальную систему сопряжения окислительных процессов с генерацией АТФ называют окислительным фосфорилированием (Рэкер Э., 1979). Митохондрии осуществляют важнейшую для клеточной биоэнергетики реакцию фосфорилирования АДФ с образованием АТФ за счет энергии окисления органических соединений, служащих субстратами окисления, молекулярным кислородом. Конечная стадия этого процесса перенос электронов от восстановленных пиридиннуклеотидов и сукцината на молекулярный кислород осуществляется по системе переносчиков электронов, которая в совокупности называется дыхательной цепью {Геннис Р., 1997). Дыхательная цепь-это своего рода силовая станция митохондрий, преобразующая энергию дыхания в энергию фосфатных связей, а также в механическую, химическую и осмотическую энергию (Ленинджер А., 1966). Аэробные ткани получают большую часть энергии от митохондриального окислительного фосфорилирования (ОФ). Процесс окислительного фосфорилирования управляется не только аллостерической и ковалентной регуляцией каталитической активности ферментных комплексов(Агпо1с1 S., 1998; Kadenbach В., et al. 1997), опосредованной соотношением АТФ/АТФ, но и большим числом других механизмов (Brown G.C., 1992; Chance В., Williams G., 2000). В частности, креатинфосфатный челнок влияет на интенсивность превращения адениловых нуклеотидоа в процессе ОФ (Balaban R.S., 1990; Jeneson J.A. et al., 2000). Скорость образования ПАДИ может регулироваться посредством изменения активности Са2+ чувствительных митохондриальных ферментов (Hansford R.G., 1994), но так же зависит и от доступности метаболических субстратов (Luzikov V.N., 1999).
Измерение поглощения кислорода митохондриями печени
Несмотря на все описанные выше преимущества использования тканевых гомогенатов в митохондриальных исследованиях, обойтись без выделенных митохондрий можно не всегда. Так, например, при изучении активности митохондриальной АТФ-азы должны быть использованы очищенные митохондрии, поскольку в гомогенате ткани могут содержаться и другие объекты, обладающие АТФ-азной активностью. Митохондриальную фракцию тканей сердца, печени и мозга получали по методу Шнейдера (Shneider C.W., 1948). После декапитации животного печень, сердце и мозг быстро извлекали и дважды отмывали в ледяном растворе 0,9% КС1. Затем ткани измельчали и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком до получения однородной массы. Гомогенат центрифугировали 10 минут при 3000g. Митохондриальную фракцию получали центрифугированием надосадочной жидкости в течение 15 минут при 12000g. Полученный осадок не промывали. Митохондрии суспендировалии в среде гомогенизации до концентрации 40 60 мг белка на 1 мл. Среда гомогенизации содержала 0,005М трис НО + 0,1М КО, рН 7,4. Полученную суспензию хранили при t=3-5C и использовали в течение 1 часа после выделения. Содержание белка митохондрий определяли по методу Лоури (Lowry О.Н., et al., 1951).
Одним из основных параметров, характеризующих энергетический обмен полученных митохондрий, является их способность к поглощению кислорода и зависимость скорости дыхания от присутствия акцепторной системы (АДФ + Фн ). В связи с этим, для изучения метаболизма митохондрий необходимо иметь метод, позволяющий точно измерить поглощение кислорода при окислении тех или иных субстратов. Чрезвычайно плодотворным оказалось применение для этих целей полярографического метода измерения концентрации кислорода с использованием стационарных твердых электродов.
Полярографический метод основан на электрохимической реакции восстановления растворенного кислорода до перекиси водорода и воды: 02 + 2е + 21Ґ -+ П202 02 + 4е + 4ІҐ- Н20
В условиях полного перемешивания ток в области насыщения пропорционален скорости диффузии кислорода из массы раствора в приэлектродныи слой. Так как полярографический анализ проводят в условиях, когда электрохимическая реакция на электроде не лимитирует скорости процесса, концентрация кислорода в приэлектродном слое близка к нулю и ток в цепи пропорционален концентрации растворенного кислорода в общей массе раствора. Линейная зависимость тока от концентрации кислорода при потенциале насыщения осуществляется в широком диапазоне концентраций, вполне достаточном для измерения дыхания биологических объектов, поэтому полярографический метод измерения потребления кислорода получил широкое распространение для изучения газообмена тканей и суспензий выделенных клеточных органелл.
В настоящей работе измерение поглощения кислорода митохондриями проводили полярографическим методом в герметичной термостатируемой ячейке объемом 1,2 мл с постоянным перемешиванием магнитной мешалкой при 28С. Уровень кислорода измерялся при помощи электрода Кларка, подключенного к аппаратно-программному комплексу «Record-4». Количество кислорода, растворенного в 1 мл среды при 25 принималось равным 600 нг-атом 02. Скорость потребления кислорода рассчитывали в нг-атом Съ/мин/мг белка (Виноградов А.Д. и др., 1977). Среда инкубации содержала 125 мМ КС1, 10 мМ HEPES, 1,5мМ КН2Р04, рН 7,4. На рисунке 1 представлена полярографическая кривая поглощения кислорода митохондриями печени, добавленными в ячейку. Стрелками указано добавление гомогената и АДФ.
Интактные митохондрии, инкубируемые в среде, содержащей субстрат окисления и кислород, характеризуются низкой скоростью дыхания. В таких условиях дыхание может быть активировано в несколько раз добавлением акцепторов энергии, аккумулирующейся в дыхательной цепи (ЛДФ + Ф„). Активация дыхания акцепторами энергии наблюдается только в том случае, если перенос электронов по дыхательной цепи прочно сопряжен с фосфорилированием. Явление стимуляции дыхания митохондрий при добавлении АДФ в присутствии субстрата окисления, фосфата и кислорода носит название «дыхательного контроля». Количественная оценка этого явления позволяет получать информацию о степени сопряженности препарата митохондрий, выделяемого из различных органов и тканей. Рассмотрим типичные изменения скорости дыхания митохондрий при добавлении АДФ в условиях, обеспечивающих окислительное фосфорилирование (рис.1).
Гомогенат в расчете на 4-6 мг белка добавляли к инкубационной среде, содержащей субстрат, что приводит к медленному потреблению кислорода со скоростью V2. В качестве субстратов окисления использовали янтарную кислоту (сукцинат) или а-кетоглутаровую (а-кетоглутарат) по 4 мМ на пробу. Внесение в реакционную смесь АДФ в количестве 200 мкМ вызывает немедленную активизацию дыхания - состояние 3 (V3). После того, как весь добавленный АДФ фосфорилируется, превращаясь в АТФ, дыхание снижается, переходя в состояние 4 (УД Скорости поглощения кислорода в перечисленных состояниях использовали для оценки эффективности фосфорилирующего дыхания. Отношение V3/V4 называют коэффициентом дыхательного контроля. Величина этого коэффициента меняется от 1 (полное отсутствие дыхательного контроля) до 5-8 (прочно сопряженный препарат). Немаловажным критерием для оценки окислительного фосфорилирования является длительность (т) процесса фосфорилирования, которую можно регистрировать по протяженности состояния V3 - времени, за которое фосфорилируется добавленный АДФ (рис.1). Кроме фосфорилирующего, измеряли и дыхание, разобщенное добавлением в ячейку 10"6 М С1-ССР (chloride carbamilphenylhydrazone). Известно, что на относительно невысокую скорость дыхания при окислении а-кетоглутарата может влиять вклад окисляемого эндогенного сукцината, тем самым, в некоторых случаях, искажая истинную картину. Отмечено, что эндогенный сукцинат окисляется значительно интенсивнее добавленного. С целью выявления вклада эндогенного сукцината в дыхание в пробах была использована добавка специфического ингибитора сукцинатдегидрогеназы — малоната (МАЛ).
Влияние введения адреналина и серотонина на митохондриальное окисление сукцината и а-кетоглутарата
Активация адреналином энергетического обмена и физиологических функций в организме уравновешивается реципрокно действующими гормонами - инсулином, ацетилхолином и серотонином, которые обеспечивают восстановительные процессы. Ранее показано, что норадреналин и адреналин активируют сукцинатдегидрогеназу при добавлении in vitro (Sivaramakrishnan S., 1983). Ацетилхолин, являясь физиологическим антагонистом адреналина, активирует окисление а-кетоглутарата (КГЛ), тормозя при этом окисление сукцината {Шостаковская И.В., 1986). Задачей этого этапа работы было исследование регуляции окисления сукцината и а-кетоглутарата реципрокными гормонами - адреналином и серотонином.
При изучении регуляторного действия на окисление сукцината и а-кетоглутарата нужно учитывать, что значительно более мощное окисление эндогенного сукцината может вносить существенный вклад в окисление добавленного а-кетоглутарата и имитировать его активацию или ингибирование. С целью исключения вклада эндогенного сукцината в общее дыхание, вместе с субстратом в ячейку добавляли ингибитор сукцинатдегидрогеназы (СДГ) - малонат.
Предполагалось также, что ингибирующий эффект серотонина связан с торможением сукцинатдегидрогеназы щавелеуксуснои кислотой и может сниматься глутаматом. Для выяснения этого были проведены пробы с добавлением глутамата in vitro.
Полученные результаты представлены в таблицах 1, 2, 3 и на рисунках 2 (А, Б, В), 3 (А, Б) и 4 (А, Б).
Как видно из рисунка 2 Л, введение адреналина in vivo вызывает активацию фосфорилируюшего дыхания при окислении сукцината (V3) с 31,8 ± 2,4 до 40,1 ± 2,9 нг-ат Ог /мин /мг белка (р 0,05), чго составляет 126% от исходного. При этом наблюдалось и увеличение коэффициента дыхательного контроля с 2,1 ± 0,2 до 2,8 ± 0,3 (р 0,05) (табл. 1). Скорость поглощения кислорода при дыхании на а-кетоглутарате тоже повышалась с 19,2 ± 2.0 до 23,4 ± 2,1 нг-ат Ог /мин /мг белка, однако это повышение было не достоверным. (р 0,05) (рис. 2Б). Эта активация снималась добавлением малоната, что указывает на значительный вклад эндогенного сукцината в потребление кислорода. В присутствии малоната выявлено, что введение адреналина не изменяет скорость окисления а-кетоглутарата (рис. 2В). Тот факт, что процесс аутоингибирования разобщенного дыхания практически не выражен при окислении а-кетоглутарата в присутствии малоната говорит о том, что под воздействием введенного адреналина поддержание мембранного потенциала обеспечивается за счет окисления сукцината (рис. 2В).
Предполагается, что серотонин оказывает обратное адреналину действие, в том числе и на регуляцию митохондриальных ферментов. Изучение влияния серотонина на скорость окисления сукцината было проведено на гомогенатах печени и мозга. Измеряли скорость потребления кислорода на сукцинате и на сукцинате в сочетании с глутаматом.
В проведенных нами опытах обнаружено, что введение серотонина значительно снижает скорость окисления сукцината в митохондриях печени и мозга (р 0,05). Так, в митохондриях печени опытных животных скорость поглощения кислорода в состоянии 3 снизилась с 45,9 ± 3,3 до 34,5 ± 3.2 нг-ат 02 /мин /мг белка, что составляет 75% от исходного значения (р 0,05) (рис. ЗА). Па митохондрии мозга серотонин оказал еще больший эффект и вызвал снижение дыхания во всех исследуемых состояниях (табл. 3). Так, после введения серотонина скорость дыхания митохондрий мозга в состоянии 2 снижалась с 14,2 ± 1,6 до 8,5 ± 2,4, в состоянии 3 с 22,0 ± 2,3 до 12,4 ± 2,7, а в состоянии 4 с 16,0 ± 0,8 до 7,9 ± 1,9 нг-ат 02/мин /мг белка (р 0,05) (рис. 4А). При этом сопряженность митохондриального препарата практически не изменялась, и коэффициент дыхательного контроля оставался прежним (табл. 3). Добавление глутамата ш vitro снимало эффект серотонина на митохондрии печени и мозга (рис. ЗБ. 4Б). Это свидетельствует о том. что в митохондриях печени под действием введенного серотонина развивается торможение сукцинатдегидрогенаш щавслеуксусной кислотой, которое снимается усилением процессов переамииирования при добавлении глутамата.
В параллельных исследованиях было обнаружено, что введение серотонина приводило к уменьшению Са емкости, значительно более выраженному в мозге. Са + емкость увеличивалась при введении меньшей дозы адреналина и уменьшалась при введении большей (Федотчева Н.И.. 2002).
Ранее, при исследовании действия адреналина и анетилхолина на окисление разных субстратов было показано, что оно направлено только на окисление сукцината и а-кетоглутарата. Избирательное действие реципрокных гормонов на окисление этих двух субстратов может объясняться тем, что ферменты их окисления, СДГ и КГДГ, являются ключевыми в регуляции дыхания. Подобно тому, как СДГ является ключевым ферментом, определяющим поток электронов в дыхательной цепи в энергизованных митохондриях, КГДГ является общим входом для всех ПАД-зависимых субстратов (Olson M.S., 1973) и доминирует при деэнергизации митохондрий.
Полученные данные свидетельствуют о том. что адреналин и серотонин проявляют свое реципрокное действие и на уровне окисления субстратов ЦТК. Окисление сукцината активируется под действием адреналина и ингибируется под влиянием серотонина. Активация окисления сукцината адреналином может являться механизмом поддержания энергетического статуса организма в ситуации напряжения. Специфическая роль сукцината в обеспечении активной работы подтверждается фактом его ингибирования серотонином - физиологическим антагонистом адреналина. Принадлежность исследованных гормонов к двум различным системам регуляции позволяет предположить, что изменение окисляемости сукцината и а-кетоглутарата под влиянием адреналина и серотонина является проявлением деятельности симпатической и парасимпатической систем.
