Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Современные представления о коагуляционном звене гемостаза 11
1.1.1. Коагуляционное звено системы гемостаза. Внешний и внутренний пути активации 11
1.1.2. Петли положительной обратной связи. Образование сгустка 15
1.1.3. Фибринолиз 22
1.2. Гемофилии А, В, С 25
1.2.1. Гемофилия-природа заболевания, его виды и типы 25
1.2.2. Возможные механизмы нарушения свертывания при гемофилиях 29
1.3. Анализ сушествующих направлений работ. Экспериментальные модели 33
1.4. Постановка задачи 43
2. Собственные исследования 46
2.1. Материалы и методы исследований 46
2.1.1. Материалы 46
2.1.2. Доноры крови 47
2.1.3. Получение плазмы крови 48
2.1.4. Стабилизация молочной кислотой. Процесс дегазации 48
2.1.5. Рекальцификация плазмы 49
2.1.6. Культура фибробластов 50
2.1.7. Схема исследования 51
2.2. Экспериментальная система 52
2.2.1. Конструкция проточной камеры 52
2.2.2. Экспериментальная установка 55
2.2.3. Проблема контактной активации 55
2.2.4. Рекальцифицикация в потоке 57
2.2.5. Проблема дегазации 57
2.2.6. Крепление активатора 57
2.2.7. Программный комплекс обработки экспериментальных данных 59
2.3. Результаты собственных исследований 62
2.3.1. Влияние потока на форму тромба 62
2.3.1.1. Особенности формы тромба 62
2.3.1.2. Эффект роста тромба против потока 64
2.3.1.3. Эффект формирования сгустка без покрытия активатора 65
2.3.2. Влияние потока на процесс формирования тромба 66
2.3.2.1. Динамика формирования тромба в потоке плазмы крови 66
2.3.2.2. Зависимость времени задержки от скорости потока плазмы крови 69
2.3.2.3. Зависимость скорости роста сгустка от скорости потока плазмы крови 75
2.3.2.4. Зависимость угла переднего фронта фибринового сгустка от скорости потока плазмы крови 78
2.3.2.5. Зависимость толщины сгустка от скорости потока плазмы крови 79
2.3.2.6. Особенности кинетики светорассеяния 81
2.3.2.7. Особенности формирования сгустка плазмы доноров страдающих гемофилией А 84
2.3.2.8. Зависимость времени задержки от линейного размера активатора 88
3. Обсуждение результатов исследований 88
4. Выводы 94
5. Практические предложения 95
6. Список литературы 96
7. Приложения 108
- Коагуляционное звено системы гемостаза. Внешний и внутренний пути активации
- Анализ сушествующих направлений работ. Экспериментальные модели
- Программный комплекс обработки экспериментальных данных
- Обсуждение результатов исследований
Введение к работе
Актуальность темы. Повреждение кровеносных сосудов приводит к контакту субэндотелиальных структур (коллагеновые волокна, фибробласты, гладкомышечные клетки) с кровью. При этом происходит формирование сгустка, закрывающего место повреждения с целью предотвращения потери крови. Образование тромба является сложным пространственно-временным процессом, который происходит в условиях потока крови и начинается на поверхности поврежденного сосуда, углубляясь далее в сосудистое пространство. В последние годы как зарубежные, так и отечественные исследователи обращают особое внимание изучению биохимических реакций, ответственных за начало образования тромба, увеличение его размеров, а также физических процессов (диффузия, ток крови и др.), которые влияют на динамику формирования тромба. Одновременно актуальной остается проблема, связанная с диагностикой патологии системы свертывания крови. В настоящее время уже существуют экспериментальные модели, позволяющие регистрировать образование тромба как in vivo посредством регистрации изображений в живых организмах (A. Celi, G. Merrill-Skoloff, 2003; А. М. Shibeko, О. Е. Avilov, Е. S. Lobanova et al., 2006; Sh. Falatti, P. Gross, 2008), так и in vitro путем моделирования роста кровяного сгустка в искусственной среде (V. Balasubramanian, Е. Grabowski, 2007; О. Э. Авилов и соавт., 2011).
Анализ литературных источников показывает, что подавляющее большинство опубликованных учеными работ посвящено исследованию роста тромбоцитарного сгустка и эффектов системы свертывания крови, связанных с агрегацией тромбоцитов. Однако с учетом того факта, что в организме основным инициатором гемостаза в настоящее время признан исключительно внешний путь свертывания in vitro, поэтому моделирование роста фибринового сгустка обязательно должно включать данный способ активации, а именно посредством тканевого фактора. Кроме того, использование тромбоцитарного звена сильно искажает результаты, которые можно получить на начальной стадии инициирования механизмов свертывания крови. Отсюда разумным упрощением постановки
экспериментов будет исследование образования сгустка в потоке плазмы при ненасыщенности тромбоцитами крови. Следовательно, и наблюдаться должен тромб в системе, позволяющей запечатлевать его формирование в пространстве (И. А. Горяинова и со-авт., 2005; И. Н. Медведев и соавт., 2006; А. N. Balandina et al., 2008; А. М. Shibeko, 2009; О. Е. Avilov, 2010).
По данным Всемирной организации здравоохранения, в мире на сегодняшний день живет до 600 тыс. человек, страдающих гемофилией разных форм и степени тяжести (Ю. А. Жулев, 2011). Поэтому научно обоснованный подход понимания пространственных процессов свертывания крови, способствующий патогенетически эффективному лечению гемофилии, является актуальной проблемой современной биологии и медицины.
В этой связи целью нашей работы является экспериментальное изучение пространственной динамики формирования фибри-нового сгустка в потоке плазмы крови нормальных и страдающих гемофилией доноров.
Исходя из поставленной цели исследований, для решения были выдвинуты следующие задачи:
-
Определить пространственную динамику тромбообразова-ния в кровотоке разных доноров.
-
Изучить зависимость характера формирования фибриново-го сгустка от биофизических показателей крови (насыщенность или ненасыщенность тромбоцитами, замороженная или незамороженная плазма и скорость ее движения).
-
Исследовать влияние потока плазмы крови на физические характеристики тромба (скорость роста и угол переднего фронта, конфигурация и толщина, кинетика светорассеивания).
-
Разработать экспериментальную систему для моделирования формирования тромба in vitro и метод диагностики нарушений гемостаза in vivo.
Научная новизна. Впервые выявлены особенности пространственной динамики формирования фибринового сгустка в потоке плазмы крови нормальных и страдающих гемофилией доноров.
Установлена зависимость скорости роста, угла переднего фронта, формы, толщины и кинетики светорассеивания, определяющих физические характеристики тромба, от кровотока.
Показана корреляция биофизических параметров крови с особенностями тромбообразования в ее плазме.
Впервые использован метод темного поля для регистрации формирования тромба в потоке плазмы и определен биологический эффект использования препаратов, возмещающих дефицит факторов свертывания крови при гемофилии.
Экспериментально доказано положительное влияние замораживания плазмы страдающих гемофилией доноров на рост фибринового сгустка и его физические характеристики, а также зависимость от обработки синтетическим красителем.
Разработана экспериментальная система, позволяющая моделировать тромбообразование и предложен метод диагностики нарушений системы свертывания крови.
Новизна полученных научных положений, выводов и рекомендаций поддержана проектом ОАО «РОСНАНО» (Госрегистрация в реестре проектов № 687).
Теоретическая и практическая значимость. Результаты диссертационных исследований имеют фундаментальный характер и дополняют современную теорию о механизмах пространственной динамики формирования фибринового сгустка в потоке плазмы крови.
Разработан биофизический прибор для диагностики патологий системы свертывания крови доноров.
Реализация результатов исследований. Научные положения, разработки и практические рекомендации используются в учебном процессе ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный педагогический университет им. И. Я. Яковлева», Чебоксарского политехнического института (филиал) ФГБОУ ВПО «Московский государственный открытый университет им. В. С. Черномырдина» и могут быть использованы при написании учебных пособий по физиологии, биохимии и гематологии для студентов вузов медико-биологических специальностей.
Апробация работы. Основные научные положения, выводы и практические рекомендации диссертационной работы доложены на Международных («Modeling of Blood Deceases» в University Claude Bernard Lyon 1 (France, Lyon, 2007); XXI Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Switzerland, Geneve, 2007), «Математическая биология и биоинформатика» (Россия, Пущино, 2006), «Биология - наука 21 века» (Россия, Пущино, 2007)) конференциях, а также расширенном заседании НИЛ биотехнологии и экспериментальной биологии ФГБОУ ВПО «ЧГПУ им. И. Я. Яковлева» (Чебоксары, 2011).
Научные положения, выносимые на защиту:
-
Физиологические механизмы образования тромба в потоке плазмы у нормальных и страдающих гемофилией доноров определяются биофизическими параметрами крови.
-
Существуют корреляционные отношения между кровотоком и скоростью роста, углом переднего фронта, конфигурацией, толщиной, кинетикой светорассеивания фибринового сгустка.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 3 - в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях согласно перечню ВАК России.
Структура и объём диссертации. Работа включает следующие разделы: введение (5 с), обзор литературы (32), собственные исследования (40), обсуждение результатов исследований (30), выводы (1), практические рекомендации (1), список литературы (12) и приложения (10 с).
Диссертация изложена на 112 страницах компьютерного исполнения, содержите таблиц и 39 рисунков. Список литературы включает 107 источников, в том числе 96 зарубежных.
Коагуляционное звено системы гемостаза. Внешний и внутренний пути активации
Процесс гемостаза инициируется повреждением эндотелия сосуда и заканчивается образованием тромба, останавливающего кровопотерю [1]. В системе свертывания выделяют три звена - тромбоцитарное, плазменное и сосудистое. Тромбоцитарное звено обеспечивает адгезию и агрегацию тромбоцитов и формирование тромбоцитарной части сгустка, плазменное звено - свертывание плазмы крови и формирование сгустка в месте повреждения.
Свернувшаяся плазма представляет собой частично нерастворимые полимеры фибрина. Его предшественник, фибриноген, находится в плазме в растворимом виде, и появляется в результате каскада реакций, составляющих системы свертывания. В состав данного каскада входят 13 факторов свертывания, из которых семь активируются до сериновых протеаз (факторы XII, XI,. IX, X, II, VII и прекалликреин), три являются кофакторами этих реакций (факторы V, VIII и кинниноген с высокой молекулярной массой, ВМК), один — кофактор/рецептор (тканевой фактор, ТФ), еще один — трансглутаминаза (фактор XIII). На каждой стадии предшественник фактора превращается в соответствующий фермент (сериновую протеазу), который катализирует превращение следующего профермента в протеазу. Значительное усиление свертывания осуществляется через петли положительных обратных связей, охватывающих каскад (фактор Па- факторы Vila и Х1а, фактор Па-ишфакторы Va и Villa, фактор Ха- фактор Vila), и через образование фактор-кофакторных комплексов VIIаct , ф1Ха ІПа, фХа а), что увеличивает активность соответствующих ферментов, и как результат скорости соответствующих реакций в 10-10 раз. Это в свою очередь приводит к тому, что динамика свертывания обладает сильно выраженным нелинейным поведением.
Активация свертывания может осуществляться по двум путям -внутреннему и внешнему [5,7,8,62]. Внутренний путь осуществляется от контакта с искусственными (чужеродными) поверхностями, и практически не реализуется in vivo, и до сих пор не найдено физиологического активатора контактной фазы [10,32,100]. При активации контактной фазы сначала происходит адсорбция белков на поверхность, и в зависимости от свойств поверхности и скорости оседания белков время, за которое она оказывается, покрыта SAP (surface activated proteins, активируемые поверхностью белки) сильно варьирует. Далее конформационные изменения, которые происходят вследствие взаимодействия SAP с заряженными элементами поверхности, приводят к тому, что они способны запустить систему контактной активации [32]. Контактная активация участвует в запуске системы свертывания, и состоит из профермента фХП, кофактора кинниногена и профермента прекалликреина, которые объединены рядом положительных обратных связей (см. рис.1).
Образование сгустка по внешнему пути запускается при помощи гликопротеина тканевого фактора (ТФ) [8,72]. ТФ - отсутствует на мембране тех клеток, которые в норме соприкасаются с плазмой крови (клеток крови и эндотелия), и присутствует на всех остальных, следовательно, при нарушении эндотелиального барьера ТФ попадает в кровь в области повреждения сосуда. Как только ТФ провзаимодействовал с плазмой - запускается механизм активации системы свертывания по внешнему пути. Сначала образуется комплекс внешняя теназа— фУПа-ТФ [24,79]. После сборки на фосфолипидной мембране, фермент Таблица составлена с использованием материалов [5, 7,62,34]. Концентрации факторов даны приблизительно: в норме у человека наблюдаются вариации (от -507+100% для фУШ, и до ±20% для большинства других факторов). Кроме того, существует разброс в данных разных авторов, вызванный разными подходами и методиками в оценке концентраций белков свертывания. В крови помимо фУП циркулируют следовые количества активированной формы фактора (0.1-0.01%) [102].
2) Современные данные показывают, что ТФ может находиться в крови: в составе лимфоцитов и, возможно, тромбоцитов; всего - не более 0.2 пМ [46].
Коферментный комплекс фVIIa-ТФ становится способным быстро активировать фактор X. Фактор Ха, в свою очередь, активирует протромбин и расщепляет молекулу фУП с образованием активного фермента фУПа. Число инициирующих свертывание комплексов фУПа-ТФ быстро растет в результате работы положительных обратных связей фХа фУПа и тромбин- фУПа. При этом, хотя фХа и активирует фУП примерно в 570 раз быстрее, чем тромбин [25], из-за значительной разницы в концентрациях фХа и тромбина, в фазе инициации свертывания (in vitro) основную роль играет последняя реакция [24].
Анализ сушествующих направлений работ. Экспериментальные модели
Следовательно, пока что не выяснено влияние потока на систему свертывания. В мире существует несколько научных групп, ведущих исследование свертывания в потоке.
Свертывание крови - это защитный поддерживает герметичность системы процессы, такие как атеросклероз, связаны с тромбообразованием, поэтому в группе Шарокка Фалати и Питера Гросса [39] считают, что исследования состояния сосудов живых организмов с подобными патологиями жизненно важны. Однако до недавних пор набор инструментов для подобного механизм, который кровообращения. Патологические наблюдения в «живой» среде был крайне ограничен. Поэтому Фалати и Гросс и др. поставили перед собой задачу: разработать такую систему, с помощью которой можно было бы наблюдать за работой системы свертывания прямо в потоке в живой ткани. Для отображения формирования тромба в потоке использовалась конфокальная и широкополостная микроскопия [39,30].
Построенная авторами система позволяет получать изображения сразу по нескольким каналам флюоресценции на разных длинах волн для разных веществ.. Повреждение стенки сосуда осуществлялось с помощью лазера, луч которого фокусировался микроскопической оптикой. Были исследованы расположение и образование сгустка в потоке, накопление ТФ при росте одиночном тромбе. Процесс инициации роста in vivo сопровождался начальным накоплением ТФ сверху по течению крови в потоке над местом повреждения. После же ТФ оказывался распределен в тромбе (ТФ при этом был биологически активен). Для получения флуоресцентной картины подопытным мышам вводились антитела на некоторые клеточные (тромбоциты) и белковые компоненты крови (тканевой фактор и фибрин). Это позволило Фалати и Гроссу не только точно обнаружить их местоположение но количественно их оценить. Однако свои результаты авторы приводят в виде относительных единиц флюоресценции, не давая количественной оценки для тромбоцитов. Места скопления соответствующих компонентов ХОроШО видны на РИС.5.
Секция а на рисунке — это изображения снятые обычной черно-белой камерой через оптику конфокального микроскопа, потом флуоресцентная фотография, потом наложенные друг на друга, и график зависимости светимости тромбоцитов от времени. Секции b и с — аналогичные данные для фибрина и ТФ. При многоканальном одновременном сканировании образца оказалось, что тромбоциты - это основной компонент сгустка при артериальном росте, при этом фибрин был локализован вверх по течению крови и далее распространился более чем на 75% объема тромба в процессе роста. Тканевой фактор находился вдоль стенки сосуда и на передней грани растущего сгустка (т.е. навстречу течению) [39]. Фалатти и Гроссу удалось показал почти никакой светимости, а следовательно, и наличия тромбоцитов. Через 4 секунды уже стало заметно их накопление на поврежденной поверхности стенки сосуда. Дальнейшую эволюцию во времени можно проследить по изображениям на рис.5, где красным цветом показано свечение тромбоцитов, фиолетовым — фибрина, зелёным — тканевого фактора, а эволюция показана для наложенных друг на друга трёх типов изображений.
На рис. 7 показано принципиальное устройство установки, созданной группой Фалатти и Гросса [38]. На предметном столе микроскопа лежит подопытная мышь, на которую сфокусирован микроскоп. Лазер соединен с оптикой микроскопа, что позволяет очень точно создавать маленькое по размерам место повреждения стенки сосуда. Микроскоп соединен через блок отследить расположение исследуемых факторов свертывания в процессе роста сгустка в реальном времени при помощи высокоскоростной четырехканальной фотографии. Для получения распределения клеток и основных веществ (ТФ, фибрин) в тромбе были использованы флуоресцентные метки (А1еха-350, 488 и 660). Снимок непосредственно сразу после повреждения не
На панелях рисунков показана кинетика накопления фибрина, тромбоцитов, ТФ - как в виде графиков в у.е., так и в виде флюоресценции сопряжения с персональным компьютером, который с помощью соответствующего программного обеспечения производит обработку и анализ полученных изображений.
В результате проделанной работы Фалати и Гросс смогли качественно охарактеризовать образование тромбоцитарного сгустка.
Количественная оценка (скорость роста тромба, концентрации фибрина, ТФ, количество тромбоцитов) по полученным данным на данный момент невозможна. На рис. 5. хорошо видно, что по достижении определённых размеров рост сгустка прекращается. Однако вопрос о биохимических причинах остановки роста тромба остается открытым. Разработанный авторами метод не позволяет варьировать параметры системы свертывания, что лишает возможности исследовать её в различных динамических режимах. Кроме этого на установке Фалатти и Гросса можно исследовать преимущественно тромбы, практически не касаясь плазменного звена системы свертывания и фибриновых сгустков.
Другое направление работ осуществляет группа под руководством Грабовски [44,97]. Они исследовали процесс свертывания в потоке цельной крови, которая предварительно заготавливалась на антикоагулянтном растворе. В искусственной камере. Активация роста тромба производилась с помощью предметного стекла, на которое предварительно были нанесены коллагены, либо с помощью искусственного повреждения в монослое эндотелиальных клеток, выращенных на покровном стекле. На рис. 8 приведена принципиальная схема установки. Кровь с помощью насоса, совмещённого с термостатом, подается с заданной скоростью в камеру, где происходит рост сгустка. Термостат поддерживает температуру крови 36.6С. С одной стороны камеры находится источник света с другой микроскоп совмещенный с системой регистрации (іги(Ьровая камера которая позволяет получать изображение в реальном времени. Сигнал от камеры поступает через блок сопряжения в персональный компьютер где обрабатывается и анализируется кроме этого ПРоИСХОДИТ запись изображения на видеопленку
Своей задачей группа Грабовски изначально ставила исследование единичных тромбоцитов и структуры их малых агрегатов. Детектирование тромбоцитов производилось по флюоресценции после добавления соответствующих антител на них. Облучение образца производилось светом длиной волны 440 им, флюоресценция наблюдалась на длине волны в 505 им. Чтобы уменьшить возможные повреждения тромбоцитов, использовался электронно-оптический преобразователь. Это позволило наблюдать за взаимодействием тромбоцитов с монослоем эндотелиальных клеток и за параллельным потоком и расположением тромбоцитов на предметном стекле, покрытом коллагенами. Причем если монослой клеток был возрастом моложе 10 или старше 17 дней, то наблюдалось сильное уменьшение адгезии и агрегаций на нем тромбоцитов поэтому использовались монослои, возрастом от 10 до 17 дней. На рис. 8 представлена схема устройства проточной камеры. Нетрудно видеть что камера имеет небольшие геометрические размеры (6 35 х 2 54 X 0 90 см) Входные и выходные отверстия в камере находятся сбоку камеры
Программный комплекс обработки экспериментальных данных
Для получения экспериментальных изображений использовалась ранее написанная специальная программа. Программа была реализована на языке Delphi в среде Borland Delphi 5.0 на основе VXD драйвера видеокамеры ACD660X фирмы American Dynamics. После помещения собранной проточной камеры в термостат и присоединения подводящих трубок для плазмы и раствора СаСІ2 программе давалась команда сохранить первый кадр. Далее каждые 30 сек пространственная картина интенсивности светорассеяния записывалась на жесткий диск. Для снижения темповых шумов производилось накопление изображения. Для этого подряд без перерыва снимались несколько кадров (4-10 штук), но на жесткий диск сохранялось одно, усредненное ("накопленное") изображение. Полное время усреднения составляло не более 3 сек, и за это время сгусток успевал вырасти не более, чем на 2 мкм, что значительно меньше 30 мкм - пространственного шага между элементами ПЗС матрицы.
При обработке экспериментальных кадров по пространственным картинам светорассеяния использовалась специальная программа Shoot, которая вычисляла динамику образования сгустка на активаторе и спонтанных сгустков, эволюция распределений фибрина в сгустках во времени, скорость роста сгустков.
На первом этапе обработки данных по светорассеянию вычислялось двумерное изображение контуров, характеризующее динамику свертывания во всей наблюдаемой экспериментальной проточной камере. Для этого на одном кадре собирались контуры растущих сгустков, соответствующие последовательным тридцатисекундным интервалам времени (рис. 19).
Контуры (линии уровня) вычислялись на уровне половины средней максимальной интенсивности светорассеяния в сгустке. Контуры характеризуют спонтанное свертывание и свертывание, инициируемое активатором. Помимо сгустка, растущего на активирующей поверхности, в нормальной плазме спустя некоторое время после рекальцификации (15-20 мин) от стенок канала (силиконовая резина) по всей его длине возникали (А), (Г) исходные кадры растущего сгустка; Полоса, вдоль которой показаны построенные контуры, указана серым цветом; (Б) контуры растущего сгустка; (В) зависимость размера сгустка от времени. Скорость квазистционарного роста вычислялась по линейному участку этой кривой спонтанные сгустки, которые росли с постоянной скоростью.
При обработке все полученные изображения полагались симметричными относительно перпендикуляра к активатору. Это позволяет перейти от двумерных распределений интенсивности светорассеяния к одномерным на отрезках, проведенных вдоль распространения роста тромба. Для исследования роста сгустка от активатора мы выбирали область изображения проточной камеры свободную от артефактов, и в ней выбирали узкую полосу, перпендикулярную активирующей поверхности. Длина полосы составляла 0.5 4 мм, ширина - 0.15 мм (5 линий). Полоса показана на рис. 19А и 19Б в виде серого прямоугольника. Вдоль этой полосы для всех моментов времени вычислялись профили интенсивности регистрируемого сигнала (рис. 19А). При этом, для снижения шумов, производилось усреднение значений светорассеяния внутри полосы в направлении, перпендикулярно росту сгустка (т.е. параллельно активатору). Также учитывалось искажение пропорций изображения (фотография растянута в 1.16 раза вдоль горизонтальной оси вследствие неправильной формы (прямоугольник, а не квадрат) приемных элементов ПЗС).
Из рис. 19А и 19Б видно, что в нормальной плазме растущий сгусток имеет довольно крутой фронт. Фронт светорассеяния в течение всего времени эксперимента распространяется вглубь плазмы, практически не меняя своей формы. Скорость роста сгустка при таком поведении профиля удобно измерять по скорости движения какой-нибудь точки фронта. Программой по сериям профилей светорассеяния строился график зависимости размера сгустка на уровне половины от максимальной интенсивности светорассеяния в сгустке от времени (рис. 19В).
Дальнейшая обработка проводилась в программе Origin 6.0/7.0/7.5 (Microcal Corp., США). По графику зависимости светорассеяния в приактиваторной области от времени определялось время свертывания на активаторе (время инициации). Для определения квазистационарной скорости роста мы на графике зависимости размера сгустка от времени выбирали прямолинейный участок, соответствующий практически постоянному росту сгустка и аппроксимировали этот участок прямой линией методом наименьших квадратов (рис. 19Г). По наклону прямой определялась скорость роста сгустка в мкм/мин.
Обсуждение результатов исследований
В данной работе изучена динамика событий, происходящих в тонком слое (1 мм) рекальцифицированной плазмы, как свободной, так и богатой тромбоцитами, приведенной в контакт с тромбогенной поверхностью -активатором свертывания. Роль активатора свертывания выполнял монослой фибробластов. Почему была выбрана именно такая постановка задачи, казалось бы, далекая от того, что реально происходит в организме в процессе образования тромба?
Прежде всего, необходимо отметить, что главными отличительными особенностями системы являются отсутствие перемешивания исследуемых образцов и наличие потока плазмы крови. Такой подход явно отличается от большинства известных гомогенных экспериментальных исследований свертывания. В ферментативном реакторе, пробирке с полным перемешиванием, как это практикуется в настоящее время, невозможно воспроизвести пространственные условия, в которых идет свертывание в организме. В пробирке или кювете агрегометра образуются множественные сгустки, и нельзя получить растущий тромб ограниченного размера. Распределение активаторов в гомогенной системе одинаково по всему объему перемешиваемого образца, тогда как in vivo процесс активации свертывания крови локализован в месте повреждения сосуда, в котором в большинстве случаев присутствует кровоток, и поэтому распределение активных факторов в пространстве сильно неоднородно.
Таким образом, рост сгустка от активатора в потоке плазмы крови является моделью пространственных процессов, которые происходят в плазме во время образования тромба вблизи поврежденной стенки сосуда в присутствие потока крови. Экспериментальная система (рис. 8) обладала следующими характеристиками [20]:
небольшой ( 1 мл) объем экспериментальной кюветы;
наличие регулируемого по скорости потока плазмы крови;
инициация роста сгустка по внешнему пути свертывания;
визуальная регистрация процесса свертывания по светорассеянию, позволяющая изучать пространственный рост фибринового сгустка в потоке;
автоматическая компьютерная обработка данных.
В процессе экспериментальных исследований была произведена оценка процесса формирования сгустка по следующим параметрам:
1. Время задержки свертывания - время от начала эксперимента до начала роста сгустка, т.е. когда эксперимент идет, но роста сгустка не наблюдается.
2. Скорость роста сгустка в середине активатора (в мкм\мин)
3. Угол переднего фронта сгустка в градусах (измеренный на 40-й минуте эксперимента)
4. Максимальна толщина сгустка в мм от границы канала (измеренная на 40-й минуте эксперимента).
Общей для всех измеренных зависимостей параметров от скорости потока является эффект подавления тромбогенной активности при росте скорости потока плазмы крови. Данный эффект приводит к нелинейному ответу системы свертывания на повыщение скорости потока плазмы крови, а также появлению пороговых значений по скорости, начиная с которых появляется нелинейный ответ системы свертывания.
Выявленные пороговые значение по скорости потока плазмы в 1400 мин является таким значением скорости, начиная с которого формирования сгустка за здравое с физиологической точки зрения время не происходит. Однако, у живых организмов при подобных скоростях потока наблюдается устойчивое формирования тромба.
Было показано, что тромбоциты играют роль катализатора тромбогенной активности, что привело к потере системой чувствительности к потоку в исследуемом диапазоне скоростей. В этой связи становится понятна ещё одна сторона физиологического значения тромбоцитов в процессе гемостаза живых организмов. С одной стороны - фосфолипидная поверхность тромбоцитов играет роль катализатора в образовании теназных комплексов, что значительно повышает уровень тромбогенной активности. С другой стороны, процесс агрегации тромбоцитов на месте повреждения является естественным препятствием кровотоку, снижая скорость потока у места повреждения и ускоряя процесс покрытия фибриновым сгусток места повреждения.
Было показано, что при значениях скорости потока плазмы более 700 мин наблюдается уплотнение структуры сгустка со временем. Учитывая сказанное выше, можно сделать предположение, что подобные процессы имеют место в живых организмах, когда через агрегаты тромбоцитов активные факторы свертывания диффундируют внутрь сгустка, приводя к уплотнению его структуры.
Для описания динамики формирования тромба в потоке плазмы крови были естественным образом выделены следующие фазы свертывания: фаза инициации свертывания, которая отражает события у активатора, характеризуется временем от контакта плазмы с активирующей поверхностью до момента начала свертывания (время задержки) и кинетикой резкого возрастания светорассеяния в приактиваторной области; фаза роста (элонгации) сгустка от активатора вглубь кюветы, характеризующаяся особенностями распределения фибрин-полимера в пространстве (профиль интенсивности светорассеяния в сгустке), динамикой изменения размера сгустка во времени и скоростью квазистационарного роста сгустка, а также равномерным продолжительным ростом сигнала кинетики светорассеяния.
Следует отметить, что нелинейное поведение установлено для всех четырех измеренных параметров формирования фибринового сгустка. Для скорости роста, угла переднего фронта и значений максимальной толщины сгустка - наблюдалось нелинейное снижение значений измеряемых параметров при росте скорости потока плазмы крови, что также является подтверждением ингибирующего воздействия потока на систему тромбообразования.
Было показано, что для исследуемых параметров формирования сгустка у плазмы доноров, страдающих гемофилией А в тяжелой форме время задержки свертывания в зависимости от времени не отличается от этого же показателя для плазмы нормальных доноров. Вместе с тем для параметра скорости роста сгустка в середине активатора значения для плазмы доноров страдающих гемофилией А лежали у нижних границ диапазона значений скоростей роста даже при относительно малых скоростях потока плазмы (по сравнения с плазмой нормальных доноров). Данный факт позволяет сделать вывод о том, что у доноров, страдающих гемофилией часть системы свертывания, отвечающая за инициацию свертывания находится в нормальной состоянии, а поражению подвергнута часть системы свертывания, отвечающая за пространственное формирования сгустка вглубь сосуда. В этой связи, является наличия низких (относительно плазмы нормальных доноров) значений скоростей роста сгустка в середине активатора для плазмы доноров, страдающих гемофилией может быть использовано как диагностический признак для данного вида патологий системы свертывания.
В этой связи можно сделать вывод, что значение параметра времени задержки свертывания и скорости роста тромба является своеобразной мерой уровня тромбогенной активности системы свертывания - чем выше уровень тромбогённой активности, тем выше скорость роста тромба и меньше время задержки свертывания, и могут быть использованы для диагностики уровня тромбогенной активности у людей.
