Введение к работе
Актуальность проблемы.
Зрение обеспечивает животное информацией о трехмерной структуре окружающего мира, а также о спектральном составе поверхностей окружающих его материальных объектов. Эти задачи выполняются путем регистрации зрительными сенсорами - фоторецепторами - электромагнитных волн, отраженных от окружающих объектов. Естественным источником освещения на Земле служит солнечный свет - прямой днем и отраженный от Луны ночью. В зависимости от времени суток, спектральное распределение солнечного света меняется под воздействием различных факторов. Кроме того, в течение суток очень сильно меняется интенсивность света - от 10-4 люкс безлунной ночью (свет звезд) до 1.3х105 люкс прямого полуденного солнечного света. Очевидно, что для успешного осуществления стратегии выживания зрительная система животного должна быть эффективна во всем доступном диапазоне интенсивностей и в возможно более широких спектральных границах солнечного света.
Адаптация зрительной системы подразумевает, что в ней участвуют в разной степени все её составляющие, от зрачкового рефлекса до перестроек в нервных сетях. С другой стороны, очевидно, что фоторецепторы задают пределы функционирования зрительной системы. Если фоторецептор неспособен реагировать на стимуляцию, так как а) интенсивность стимула недостаточна, или б) длина волны стимула находится за пределами спектра поглощения рецептора, или в) фоторецептор уже насыщен предыдущей стимуляцией, то такой стимул не будет воспринят и обработан зрительной системой.
Палочки позвоночных обладают уникальной способностью работать в режиме счета отдельных квантов при очень низких освещенностях и не насыщаться при интенсивностях до 104 квантов/секунду. Достигается это благодаря комплексу регулирующих воздействий, основой которых является кальциевая обратная связь. Смысл кальциевой обратной связи состоит в противодействии насыщению фоторецептора высокими уровнями фоновой стимуляции. Для этого кальциевая обратная связь увеличивает сродство цГМФ- управляемых каналов мембраны к своему лиганду, а также снижает удельную реакцию каскада фототрансдукции на световую стимуляцию. По современным представлениям, это происходит за счет активации гуанилатциклазы и ускорения выключения активного родопсина и активного трансдуцина.
Накопленный массив данных о каскаде фототрансдукции позволил создать несколько математических моделей его работы. При анализе их работы выяснилось, что использование только известных канонических регулировок не позволяет воспроизвести наблюдаемые в эксперименте эффекты светового фона на фотоответы. Это заставляет обратиться поискам других, пока неизвестных механизмов регулировки.
Одним из до сих пор плохо изученных аспектов G-белковой сигнализации является регулировка её выключения. Кинетика выключения каскада определяет его чувствительность и временное разрешение, и таким образом является критической для правильного функционирования. Выключение каскада должно быть направлено на инактивацию рецепторной молекулы, инактивацию эффекторного фермента и восстановление концентрации вторичного посредника. Эти процессы являются мишенью многих, пока плохо изученных, механизмов регуляции. Первой проблемой является полное понимание процесса выключения рецепторной молекулы. Резкое понижение сигнальной активности родопсина после поглощения кванта света достигается его множественным фосфорилированием родопсинкиназой и последующим связыванием со специфическим белком - аррестином. В общих чертах этот процесс считается понятным, но точный временной ход инактивации метродопсина II неизвестен. Кинетика фосфорилирования, наблюдающаяся в биохимических экспериментах in vitro (Calvert et al., 1995; Kennedy et al, 2000), кажется недостаточно быстрой, чтобы объяснить физиологический ответ. С другой стороны, данные о выключении родопсина, извлекаемые из записей электрического ответа, полагаются на сложную многопараметрическую математическую модель и поэтому неоднозначны.
Второй проблемой является выключение активированного G-белка - трансдуцина. Собственная ГТФ-азаная активность трансдуцина низка и не может обеспечить своевременное выключение каскада. Она резко увеличивается в результате связывания с эффекторным ферментом (ФДЭ) и дальнейшего образования комплекса с белком RGS9/Gp5 и с якорным белком R9AP, удерживающим RGS9 на мембране. Потенциально такая сложная система выключения эффекторного фермента допускает множество путей регуляции. Показано, что введение гипотетического ускорения инактивации ФДЭ в ходе световой адаптации позволяет значительно улучшить согласие модели фототрансдукции с экспериментом. Однако даже само существование какой-то регуляции времени жизни активной ФДЭ при физиологической стимуляции не показано ни в биохимическом, ни физиологическом эксперименте.
Многочисленные экспериментальные факты свидетельствуют, что помимо трех известных кальций-зависимых регулировок каскада фототрансдукции, существует другие, медленные и глубокие регулировки, биохимический механизм и даже мишени которых неизвестны. Одним из потенциальных посредников такой регулировки мог бы служить цАМФ. Показано, что уровень цАМФ в цитоплазме фоторецепторов подвержен циркадным ритмам. Внутри каскада фототрансдукции многие белки являются мишенями для цАМФ-зависимой протеинкиназы А (PKA) - гуанилатциклаза (ГЦ), ГЦАР, родопсинкиназа (GRK1), фосдуцин и CNG каналы. Более того, сейчас установлено, что фосфорилирование GRK1 является светозависимым (Osawa et al., 2008; Osawa et al., 2011). Существование циркадных ритмов цАМФ и мишеней для цАМФ-зависимой регулировки в каскаде фототрансдукции позволяет предположить, что цАМФ мог бы служить еще одним регулятором каскада. Однако такая регулировка in vivo не была до сих пор никем показана, и цАМФ не входит ни в одну из современных схем фототрансдукции.
Выключение активной формы родопсина, Метародопсина II, происходит путем его фосфорилирования родопсинкиназой (GRK1). Фосфорилирование не подавляет каталитическую активность родопсина полностью, и дальнейшая
инактивация происходит путем связывания фосфорилированного родопсина
*
(MII -p) с белком аррестина. Аррестин (Arr) блокирует сайты взаимодействия родопсина с G-белком, Gt и таким образом дополнительно снижает сигнальную
активность в каскаде. При относительно слабых стимулах, генерирующих
*
небольшое количество активных молекул MII , фосфорилирование и присоединение аррестина можно рассматривать как полное выключение каскада. В этом случае, остаточной активностью комплексов MII-p-Arr а также
последующих продуктов фотолиза, можно пренебречь. При сильных стимулах,
**
генерирующих много MII , продукты распада MII генерирует в совокупности достаточно большой сигнал, обеспечивающий высокий уровень возбуждения фоторецептора.
Полное выключение каталитической активности родопсина и регенерация «темнового» зрительного пигмента служит механизмом темновой адаптации - восстановления чувствительности зрения при переходе от высоких освещенностей к низким. Поэтому скорости взаимопревращений продуктов распада родопсина на поздних стадиях фотолиза, а также их относительные остаточные активности являются критичными параметрами при определении динамики темновой адаптации фоторецепторов. Однако, детальный вклад поздних продуктов фотолиза в выключение каскада in vivo до сих пор неизвестен.
Диапазон видимого света - примерно от 380 до 750 нм, - определяется разнообразием колбочковых пигментов. Зрительная система, обладающая несколькими типами колбочек с разными спектрами поглощения зрительных пигментов, позволяет хорошо различать цвета в условиях достаточного освещения. Удельное количество фотонов в солнечном спектре повышается с увеличением длинны волны. Для палочек, чья задача состоит в рецепции слабых стимулов, в том числе и одиночных фотонов, было бы выгодно иметь спектр поглощения ближе к длинноволновой границе спектра излучения солнца. Тем более странно, что подавляющее большинство известных палочковых зрительных пигментов позвоночных животных имеют максимумы поглощения отнюдь не в длинноволновой, а в узкой средней области спектра, в районе 500 нм. Полвека назад была высказана гипотеза о том, что более длинноволновые пигменты обладают большим собственным, т.н. «темновым» шумом, и поэтому положение их максимумов поглощения в средней части спектра есть эволюционный адаптивный компромисс (Barlow, 1956). Несмотря на всю привлекательность этой концепции, она долгое время не имела экспериментальной проверки. Неясным остается также сам механизм возникновения «темнового» шума. Существует гипотеза о генерации шума нестабильной фракцией родопсина с непротонированной формой Шиффова основания, также не проверенная пока в эксперименте.
В настоящей работе будут рассматриваться две группы процессов адаптации. Одна группа включает в себя физиологические процессы световой и темновой адаптации в течение суточного цикла изменения освещенностей. Другая группа составляет эволюционные адаптации к условиям обитания, в зависимости от спектрального и яркостного диапазона естественного освещения.
Цель исследования
На примере фоторецепторов рыб и амфибий исследовать физиологические и эволюционные механизмы, обеспечивающие адаптацию зрительной системы позвоночных к работе в широком диапазоне естественных освещенностей.
Задачи исследования
-
Установить кинетику активации и инактивации эффекторного фермента каскада фототрансдукции - ФДЭ - и проанализировать ее зависимость от уровня фонового освещения.
-
Создать методику, позволяющую манипулировать уровнем цАМФ в изолированном фоторецепторе амфибии в пределах, близких к естественным колебаниям цАМФ во время циркадных ритмов. Изучить влияние изменения внутриклеточного уровня цАМФ на работу каскада фототрансдукции. Выявить молекулярные мишени воздействия цАМФ на работу каскада фототрансдукции, определить параметры этого воздействия. Оценить значение регулирующего воздействия цАМФ на каскад фототрансдукции.
-
Изучить in vivo динамику восстановления чувствительности фоторецептора после сильного обесцвечивания зрительного пигмента. Идентифицировать механизмы, определяющие скорость восстановления чувствительности фоторецептора при разных уровнях обесцвечивания зрительного пигмента. Определить относительный вклад поздних продуктов фотолиза в степень возбуждения каскада фототрансдукции у палочек и колбочек.
-
Определить факторы, определяющие выбор спектрального положения максимума поглощения зрительного пигмента палочек позвоночных. Определить зависимость скорости спонтанной активации молекул зрительного пигмента палочек от максимума поглощения пигмента. Экспериментально проверить ранее выдвинутые гипотезы о механизмах спонтанной активации молекул зрительного пигмента палочек.
Научная новизна
В нашей работе кинетика выключения родопсина и комплекса трансдуцин- ФДЭ вычисляется при помощи новой оригинальной методики, наиболее прямым способом, позволяющим избежать влияния различных регулирующих факторов в системе in vivo. Поэтому мы полагаем, что наши результаты являются наиболее близкой оценкой истинных параметров реакций выключения родопсина и комплекса трансдуцин-ФДЭ. Нами впервые показано, что скорость выключения комплекса трансдуцин-ФДЭ зависит от уровня фонового возбуждения фоторецептора, что является существенным дополнением к классической схеме работы кальциевой обратной связи в каскаде фототрансдукции. Совершенно новым является сделанное нами обоснованное предположение о том, что ни фосфорилирование метапигмента, ни инактивация трансдуцина не являются лимитирующими процессами, определяющими время выключения каскада.
Нами впервые показано существование в фоторецепторе дополнительной цепи регулировки каскада фототрансдукции, управляемой внутриклеточной концентрацией цАМФ. Определены мишени регулирующего воздействия цАМФ и высказаны обоснованные предположения о механизмах этого воздействия. Показано, что эта регулировка работает в пределах естественных колебаний уровня цАМФ в клетке, и увеличение уровня цАМФ сопровождается увеличением чувствительности фоторецептора и может иметь существенное адаптивное значение для зрительной системы в целом.
Для описания динамики восстановления чувствительности фоторецептора после интенсивного обесцвечивания пигмента нами применена математическая модель, основанная на кинетической схеме взаимопревращений поздних продуктов фотолиза. Применение модели для описания экспериментальных данных позволяет измерить в условиях целой клетки удельные активности метапродуктов и скорости их взаимопревращений. Данные о кинетике и об удельных активностях продуктов поздних стадий фотолиза зрительного пигмента колбочек получены впервые. Впервые показано, что удельные активности фосфорилированного и аррестированного метапродукта у колбочкового пигмента примерно в 100 раз больше, чем у палочкового, а скорости взаимопревращений колбочковых метапродуктов в 4-8 раз быстрее, чем палочковых.
Нами впервые экспериментально показана зависимость частоты спонтанной активации молекул зрительного пигмента от положения его максимума поглощения, что позволило подтвердить гипотезу об адаптивном характере расположения максимумов поглощения палочковых пигментов в середине спектра видимых волн.
Научно-практическая значимость работы
Полученные данные существенно расширяют наши представления о механизмах регулирования каскада фототрансдукции. В результате появляется возможность более детального описания его работы в норме, что повышает вероятность ранней диагностики патологических состояний. Открытие роли цАМФ в регулировке чувствительности фоторецептора дает новые возможности в поиске путей коррекции патологических состояний сетчатки, - таких, например, как нарушение сумеречного зрения. Каскад фототрансдукции является во многих отношениях модельной системой для других сенсорных и несенсорных сигнальных каскадов. Поэтому, выявление в его составе новых регулирующих
механизмов может привести к интенсивному поиску аналогичных регулировок и в других каскадах.
Положения, выносимые на защиту.
-
-
Из двух процессов выключения активных компонентов каскада фототрансдукции - родопсина и трансдуцина - оба зависят от уровня активации каскада. Этот результат позволяет включить инактивацию трансдуцина в число реакций каскада фототрансдукции, охваченных обратной связью, зависящей от уровня фонового освещения. Инактивация родопсина и трансдуцина не являются лимитирующими процессами, определяющими время выключения каскада.
-
Внутриклеточный уровень цАМФ способен регулировать работу каскада фототрансдукции. Повышение уровня цАМФ вызывает повышение внутриклеточной концентрации кальция, уменьшение темновой активности фосфодиэстеразы и уменьшение максимальной активности гуанилатциклазы. Вместе, эти эффекты приводят к повышению чувствительности фоторецептора.
-
Каскад фототрансдукции выключается в две различающиеся временные фазы. Быстрая фаза определяется фосфорилированием Мета II и связыванием его с аррестином. Медленная фаза контролируется распадом частично инактивированных метародопсинов на ретиналь и опсин и регенерацией родопсина. Она отвечает за темновую адаптацию. В колбочках все реакции зрительного цикла происходят на порядок быстрее, чем в палочках, что и обеспечивает более быструю темновую адаптацию дневного зрения.
-
Частота спонтанной активации молекул зрительного пигмента зависит от положения его максимума поглощения, что позволяет подтвердить гипотезу об адаптивном характере расположения максимумов поглощения палочковых пигментов в середине спектра видимых волн. Механизм спонтанной (термической) изомеризации родопсина скорее всего отличается от механизма светоиндуцированной изомеризации
Апробация работы
Материалы работы были представлены на 6-ти международных конференциях по зрительной рецепции «Visionarium» (Финляндия) в 2004, 2006,
2007, 2009-2011 гг., на 18, 20 и 21 съездах физиологического общества им. И.П. Павлова (2001, 2007 и 2010), на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино 2009, 2011 гг.); Международной конференции INMED/TINS (Франция, 2006); IV Европейском Форуме по Нейробиологии FENS (Швейцария, 2008), на V и VII Международном совещании по эволюционной физиологии в 2001 и 2011 г.
Публикации
Основные результаты диссертации представлены в печатных работах, в числе которых 12 статей в журналах, рекомендованных ВАК (в том числе 6 в международных журналах), 1 статья в сборнике и 21 тезис конференций.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на 224 страницах с использованием 68 рисунков и 12 таблиц. Работа состоит из введения, краткого общего обзора состояния проблемы, материалов и методов исследования, четырех глав, содержащих каждая обзор литературы, собственные экспериментальные данные и их обсуждение, общее заключение и выводы. Список литературы содержит 314 ссылок.
Похожие диссертации на Механизмы адаптации фоторецепторов позвоночных
-
