Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 12
1.1.1. Современные представления о гипоксических состояниях 12
1.1.2. Общая характеристика ишемии и циркуляторнои гипоксии 15
1.2. Окислительные метаболические пути и энергетический обмен в условиях гипоксии 17
1.3. Активные формы кислорода как источник повреждений в клетке 26
1.4. Система защиты клетки от свободнорадикального окисления 32
1.5. Окислительный стресс как нарушение баланса генерации и удаления активных форм кислорода 37
1.6. Механизмы цитотоксических эффектов активных форм кислорода и гибель клетки 41
Глава II. Материал и методы исследования 50
2.1. Биохимические методы исследования 50
2.2. Гистологические методы исследования 53
Глава III. Результаты работы и их обсуждение 58
3.1. Динамика биохимических показателей кислородзависимых процессов в печени на разных сроках острой циркуляторнои гипоксии 58
3.2. Динамика апоптозного индекса печени на разных сроках острой циркуляторнои гипоксии 77
3.3. Морфофункциональные изменения ткани печени на разных сроках острой циркуляторнои гипоксии 83
Заключение 88
Выводы 109
Библиографический указатель 111
- Современные представления о гипоксических состояниях
- Окислительные метаболические пути и энергетический обмен в условиях гипоксии
- Динамика биохимических показателей кислородзависимых процессов в печени на разных сроках острой циркуляторнои гипоксии
- Динамика апоптозного индекса печени на разных сроках острой циркуляторнои гипоксии
Введение к работе
Актуальность работы
Открытие механизмов биологического окисления является величайшим достижением современной науки о жизни. В стройной теории биологического окисления и теории дыхания кажутся незаметными пробелы, которые проявляются при изучении целостного организма. Это является выражением пока еще существующего определенного разрыва между теоретической биохимией и физиологией (Иванов, 1993). Всестороннее изучение кислородзависимых процессов in vivo, протекающих в условиях гипоксии, является актуальной проблемой практической медицины и фундаментальной биологии.
В нормальных условиях эффективность биологического окисления соответствует функциональной активности органов и тканей. При недостатке кислорода возникает состояние энергетического дефицита, приводящее к разнообразным функциональным и морфологическим изменениям, направленным на формирование повышенной резистентности организма к гипоксическому воздействию, а при глубокой степени гипоксии и продолжительном периоде действия - к деструктивным нарушениям вплоть до гибели организма (Агаджанян, Чижов, 2003).
Кислородное голодание встречается при многих физиологических состояниях. Изучению влияния гипоксии на показатели функций организма в целом, и печени в частности, посвящено большое количество работ. Но, в основном, изучается не состояние печени в условиях гипоксии, развивающейся в течение суток, а показатели хронической гипоксии (Апросина, 1981; Власова с соавт., 1990; Генинг, 1980; Логинов, 1977, Логинов, Матюшин, 1991; Матюшин, Логинов, 1998; Скобелева, 1994).
Одной из причин гипоксии циркуляторного типа является острая кровопотеря. Для успешного лечения постгеморрагических состояний
необходимо изучение отдельных звеньев патогенеза последствий кровопотери. До настоящего времени влияние острой кровопотери на процессы биологического окисления в печени остается мало изученным.
Как известно, изменения системного кровообращения, возникающие при острой кровопотере, закономерно отражаются на общем печеночном кровотоке (Ксейко, 2004). При ухудшении локального кровоснабжения в печени возникает состояние неполной ишемии. Вследствие сосудистых изменений ограничивается или прекращается доступ к ткани кислорода и субстратов. Достаточно очевидно, что адекватное энергообеспечение клетки может быть проблемой в условиях ограниченного доступа к субстратам окисления и кислороду. Это чревато необратимой деградацией ткани. В большей части случаев ишемия или гипоксия сменяется восстановлением адекватного кровоснабжения и клеточного питания. Встает задача осмысления двух проблем: как обеспечивается равное энергоснабжение и как защищается клетка от повреждения, вызванного сменой кислородного режима (Зоров, с соавт., 2005).
В настоящее время хорошо известны основные принципы получения, освобождения и использования энергии в клетке. Известны многие и важные подробности соответствующих процессов. Однако последовательность и количественные отношения их во многих случаях остаются неясными. Поэтому и трактовка причин нарушений и прекращений жизненных отправлений клетки при недостатке кислорода и энергии оказывается очень трудной (Иванов, 1993). Достоверная оценка возникающих при этом нарушений структуры и метаболизма клеток возможна при анализе качества и количества промежуточных продуктов метаболической цепи (Жданов, Нодель, 1982).
Риск окислительного стресса - это цена, которую аэробным организмам приходится платить за более эффективную биоэнергетику (Скулачев, 1971, цит. по Андрееву, Кушнаревой, Старковой, 2005). Термин
7 «окислительный стресс» используется для обозначения широкой группы разнообразных взаимосвязанных явлений, включающих повышенную внутриклеточную генерацию активных форм кислорода (АФК) и окислительное повреждение молекулярных компонентов клетки. Причинно-следственные связи между этими явлениями не до конца выяснены, но, вероятно, включают петлю положительной обратной связи, в которой АФК вызывают окислительное повреждение, автокаталитически приводящее к усилению их генерации.
Истинной причиной окислительного стресса является не продукция АФК как таковая, а нарушение пространственно-временного баланса между их генерацией и удалением. Однако до недавнего времени эта концепция не была сформулирована (Андреев, Кушнарева, Старков, 2005).
В последнее время механизмы окислительного стресса привлекают особенный интерес исследователей из-за его широко признанной роли в этиологии как «нормального» старения, так и серьезных патологий, представляющих собой актуальную проблему для здравоохранения (Андреев, Кушнарева, Старков, 2005; Саенко, 2005).
Внутриклеточная генерация АФК является неизбежным, а иногда физиологически важным процессом (Андреев, Кушнарева, Старков, 2005; Дас, Молик, 2004; Зайцев, Закревский, 1998; Саприн, Калинина, 1999). Живые клетки содержат ферменты, которые одновременно производят АФК и внутриклеточный редокс-буфер в ответ на специфический стресс. АФК выполняют роль вторичного мессенджера, образование которого либо усиливается, либо уменьшается в ответ на физиологические стимулы типа ишемии (Дас, Молик, 2004). Чтобы противостоять свободнорадикальному окислению, клетка обладает многочисленными системами защиты от АФК, состоящими из специализированных ферментов и неферментативных антиоксидантов. Сложность этой сети еще более усугубляется тканеспецифичностью многих защитных механизмов и продолжающимся
8 открытием все новых элементов системы. Обширность и сложность данного предмета практически исключает возможность сколь-либо полного изучения его в одной работе (Андреев, Кушнарева, Старков, 2005). В литературе имеется ряд противоречивых данных о зависимости между активностью антиоксидантов и показателями перекисного окисления липидов (ПОЛ) (Биленко, 1989; Зайцев, Закревский, 1998; Саенко, 2005).
Данные исследований свидетельствуют о важной индуцирующей роли АФК и окислительного стресса в процессе гибели клетки (Саприн, Калинина, 1999). Если интенсивное развитие окислительного стресса приводит к некрозу, то его медленное развитие запускает процессы апоптоза (Малышев с соавт., 2000; Саенко, 2005). Согласно кислородно-перекисной концепции апоптоза Б. Н. Лю (2001), гипотезе Т. М. Buttke и P.A. Sandstrom (1994), работам В. П. Скулачева (1999, 2001) избыточные АФК и ПОЛ играют решающую роль в механизмах развития гибели клеток.
Цель работы: оценить параметры кислородзависимых процессов в печени на этапах острой циркуляторной гипоксии в зависимости от объема кровопотери.
Для достижения цели работы решали следующие задачи:
1. Оценить содержание АТФ в ткани печени спустя 3, 7 и 24 часа после
кровопотери объемами 1,5 % и 0,75 % от массы тела крысы.
2. Изучить динамику активности ферментов дыхательной цепи
митохондрий (цитохромоксидазы и сукцинатдегидрогеназы) в ткани печени
спустя 3, 7 и 24 часа после кровопотери объемами 1,5 % и 0,75 % от массы
тела крысы.
Оценить интенсивность гликолиза в ткани печени спустя 3, 7 и 24 часа после кровопотери объемами 1,5 % и 0,75 % от массы тела крысы.
Изучить динамику перекисного окисления липидов в ткани печени спустя 3, 7 и 24 часа после кровопотери объемами 1,5 % и 0,75 % от массы тела крысы.
Изучить динамику ферментативного и неферментативного звеньев антиоксидантной защиты в ткани печени спустя 3, 7 и 24 часа после кровопотери объемами 1,5 % и 0,75 % от массы тела крысы.
Оценить уровень апоптоза в ткани печени спустя 3, 7 и 24 часа после кровопотери объемами 1,5 % и 0,75 % от массы тела крысы.
Оценить структурные изменения в печени спустя 3, 7 и 24 часа после кровопотери объемами 1,5 % и 0,75 % от массы тела крысы.
Научная новизна исследования
Автором работы впервые проведена оценка уровня апоптоза в печени крыс in vivo при острой циркуляторной гипоксии, обусловленной генерализованной кровопотерей разного объема. Сопоставлены биохимические параметры метаболических путей кислорода в печени in vivo после кровопотери разной степени тяжести. Произведена оценка системы ПОЛ-антиоксидант в печени in vivo в зависимости от сроков с момента кровопотери и степени ее тяжести. В работе показана корреляционная взаимосвязь между уровнем активности ферментов дыхательной цепи митохондрий и показателями системы ПОЛ-антиоксидант в печени. Оценены морфологические изменения ткани печени спустя 3, 7 и 24 часа после кровопотери объемами 1,5 % и 0,75 % от массы тела животного.
Основные положения, выносимые на защиту
При острой циркуляторной гипоксии, обусловленной кровопотерей объемами 0,75 % и 1,5 % от массы тела крысы, в ткани печени происходит нарушение баланса показателей системы ПОЛ-антиоксидант.
При острой циркуляторной гипоксии, обусловленной кровопотерей объемами 0,75 % и 1,5 % от массы тела крысы, в ткани печени происходят изменения активности ферментов дыхательной цепи митохондрий, активация гликолиза и снижение содержания АТФ.
2. В условиях острой циркуляторной гипоксии, обусловленной
кровопотерей объемами 0,75 % и 1,5 % от массы тела крысы, происходит
активация апоптоза в печени.
3. После кровопотери объемами 0,75 % и 1,5 % от массы тела крысы
наблюдается деструкция ткани печени, с восстановлением нормальной
структуры ткани к 24 часам с момента воздействия.
Научно-практическая ценность работы
Полученные результаты могут быть использованы при оценке и прогнозе функционального состояния печени в эксперименте и клинике в условиях острой гипоксии. Данные могут быть использованы при оценке адаптивных и резервных возможностей организма в условиях острой кровопотери. Понимание механизмов развития окислительного стресса в условиях гипоксии позволит целенаправленно воздействовать на внутриклеточные процессы с целью разработки схем адекватной коррекции окислительного стресса с тем, чтобы воспрепятствовать запуску механизмов клеточной смерти.
Апробация работы
Материалы, представленные в работе, докладывались на межкафедральном заседании сотрудников кафедр теоретического и терапевтического профиля медицинского факультета Ульяновского государственного университета (Ульяновск, 2004), международном форуме молодых ученых и студентов (Москва, 2004), XXXIX и ХХХХ научно-технических конференциях Ульяновского государственного технического университета (Ульяновск, 2005, 2006), IX и X международных школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005, 2006), международной 57 научно-практической конференции студентов и молодых ученых Витебского государственного медицинского университета «Актуальные вопросы современной медицины и фармации» (Витебск, 2005), всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и
медицина» (Санкт-Петербург, 2005), XI, XII, XIII международных конференциях «Ломоносов - 2004», «Ломоносов - 2005», «Ломоносов - 2006» (Москва, 2004, 2005, 2006), региональной конференции «Актуальные проблемы физиологии, физического воспитания и спорта» (Ульяновск, 2005), международном конгрессе молодых ученых (Санкт-Петербург, 2005), V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005), научно-практической конференции «Патология желудочно-кишечного тракта с позиций терапевта, хирурга, инфекциониста» (Ульяновск, 2006), XI Российской конференции «Гепатология сегодня» (Москва, 2006).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 12 работ.
Объем и структура диссертации
Работа изложена на 130 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и библиографического указателя. Работа включает библиографический список из 193 литературных источника, 12 таблиц, 18 рисунков.
Современные представления о гипоксических состояниях
Гипоксия — широко распространенное состояние (Лукьянова, 2000). Термин «гипоксия» этимологически и содержательно трактуют двояко. Во-первых, гипоксию определяют как состояние, возникающее в результате недостаточного обеспечения тканей организма кислородом и/или нарушения его усвоения в ходе биологического окисления. В более широком смысле гипоксию понимают как типовой патологический процесс, развивающийся в результате недостаточности биологического окисления, приводящий к нарушению энергетического обеспечения функций и пластических процессов в организме. Это состояние приводит к нарушению жизнедеятельности организма в целом, расстройствам функций органов и тканей. Морфологические изменения в них имеют различный масштаб и степень, вплоть до гибели клеток и деструкции неклеточных структур (Агаджанян, Чижов, 2003; Литвицкий, 2002). Основы классификации гипоксических состояний были заложены в 30-е годы XX века. За всю историю изучения гипоксии предложено несколько ее классификаций (Баркрофт, Петере, ван Слайк, Барбашова, 1960; Ван Лир, Стикней, 1967; Колчинская, 1981 и др.) (цит. по Добровольскому, Степанову, 1993; Агаджанян, 2003; Сорокина, Ткачук, 2002). Согласно этиопатогенетической классификации гипоксии (Новиков, Шанин, Козлов, 2000; Шанин, 1998), выделяют экзогенную и эндогенную гипоксии. Экзогенная гипоксия связана с изменением парциального давления кислорода во вдыхаемой смеси, к ней относят гипоксическую и гипероксическую гипоксии. Эндогенную гипоксию вызывают расстройства внешнего дыхания, транспорта кислорода кровью и нарушение тканевого дыхания, разновидностями являются респираторная, гемическая, циркуляторная, тканевая гипоксии. А. 3. Колчинская (1981, 1983, 1991, 2002) выделяет еще гипербарическую гипоксию и гипоксию нагрузки. По критерию выраженности расстройств жизнедеятельности организма различают гипоксию легкую, среднюю (умеренную), тяжелую, критическую (опасную для жизни, летальную) (Литвицкий, 2002). По степени тяжести выделяют пять стадий гипоксии: скрытую гипоксию, компенсируемую, выраженную гипоксию с наступающей декомпенсацией, некомпенсируемую гипоксию, терминальную стадию (Добровольский, Степанов, 1993). По критериям скорости возникновения и длительности гипоксического состояния выделяют молниеносную (острейшую) гипоксию - развивается в течение нескольких секунд (часто причина смерти); острую - развивается через несколько минут (как правило, в пределах первого часа) после воздействия причины гипоксии (например, в результате острой кровопотери или острой дыхательной недостаточности); подострую - формируется в течение нескольких часов (но в пределах первых суток); хроническую, когда организм находится в условиях дефицита кислорода во вдыхаемом воздухе длительное время (дни, недели, месяцы, годы). В хронической гипоксии выделяют острый период, в который симптомы кислородного голодания проявляются достаточно ярко и имеют определенное сходство с симптомами острой гипоксии (Агаджанян, 2003; Литвицкий, 2002). Современную классификацию гипоксических состояний приводит Н.А. Агаджанян (2003) (рис. 1). Подходя к разбору классификации, следует понимать достаточную сложность выделения той или иной гипоксии в чистом виде. Любое Гемоглобинтоксическая "Деоксигемоглобиновая Оксигемоглобиновая Вазопаралитическая Шунтирования Рис. 1. Классификация гипоксических состояний, гипоксическое состояние - это сложный комплекс ответных реакций на гипоксический стимул, в который, как правило, включены все функциональные системы организма, в связи с чем гипоксия в большинстве случаев бывает смешанного типа (Агаджанян, 2003). Обязательным этапом в каждом из вышеперечисленных типов гипоксии является биоэнергетическая (тканевая) гипоксия. В настоящее время биоэнергетической гипоксией принято называть такую гипоксию, главным результатом которой является истощение клеточных запасов макроэргов и повреждение энергопреобразующих механизмов (Лукьянова, 1997). Термин биоэнергетической гипоксии впервые появился в 1961 году, и он получил быстрое признание в научных кругах, поскольку удачно раскрывает главную причину тех многочисленных изменений, которые имеют место при дефиците кислорода. Глубина происходящих функционально-метаболических изменений в клетке и скорость их прохождения зависят от тяжести и продолжительности гипоксического воздействия (Медведев, Толстой, 2000).
Окислительные метаболические пути и энергетический обмен в условиях гипоксии
Кислород, делающий возможным существование всего аэробного мира, в живом организме является окислителем. В клетке имеются системы утилизации кислорода, а одним из важных результатов окислительного обмена является создание систем энергетического буфера (Зоров с соавт., 2005). Многообразие процессов биологического окисления с обязательным вовлечением в них кислорода и потенциально высокая его токсичность обусловливают необходимость рассмотрения биохимических механизмов кислородного обмена (Абрамова, Оксенгендлер, 1985). В данном разделе в нашу задачу входит освещение узловых моментов метаболизма кислорода, которые необходимы для изложения проблемы дыхания и энергетического обмена печени в условиях гипоксии. Под биологическим окислением понимают ферментативное окисление различных естественных субстратов живыми организмами. В результате освобождается потенциальная энергия, значительная часть которой аккумулируется в форме макроэргических химических связей АТФ, некоторое количество энергии рассеивается в виде тепла (Николаев, 1989). Окислительное фосфорилирование осуществляется в дыхательной цепи, которая располагается на внутренней мембране митохондрий. Суть процесса состоит в сопряжении потока электронов, направленного от органических субстратов к кислороду, с перемещением протонов из матрикса митохондрий через мембрану в межмембранное пространство. Цепь состоит из четырех трансмембранных мультисубъединичных комплексов, растворимого цитохрома с и убихинона-10 (рис 2). . Электронтранспортный ансамбль дыхательной цепи митохондрий (Геннис, 1997). Дыхательная цепь не может функционировать как долгоживущий комплекс, однако, какая стадия является лимитирующей, оценить непросто (Геннис, 1997; Hackenbrock, Chazotte, Gupte, 1986). Перенос электронов через комплекс II (сукцинатдегидрогеназу - СДГ) не сопровождается переносом протонов. Однако реакции, катализируемые комплексом І (НАДН-дегидрогеназой), комплексом III (убихинол : цитохром с-оксидоредуктазой или Ьсркомплексом) и комплексом IV (цитохромоксидазой), сопровождаются векторным переносом протонов через мембрану. Эти реакции являются электрогенными и приводят к генерации трансмембранного электрического потенциала. Такие ферменты в составе цепи называются «местами сопряжения». Относительно механизмов перемещения протонов пока нет единого мнения, хотя в литературе обсуждаются конкретные модели, в частности для комплексов III и IV (Геннис, 1997; Gelles, Blair, Chan, 1987). Образующаяся трансмембранная разность электрохимических потенциалов протонов уменьшается за счет работы протонного канала АТФ-синтетазы (или ЬГчАТФ-азы). Энергия потока используется этим ферментом для синтеза АТФ (Геннис, 1997).
Субстратом терминального фермента митохондриальной дыхательной цепи - цитохромоксидазы (ЦХО) является кислород. Белок ЦХО - фермент, который, функционируя как ионный насос, сопрягает ионный транспорт (Н ) и реакции переноса электронов. Оксидаза катализирует окисление цитохрома с, локализованного в межмембранном пространстве митохондрий, и восстановление кислорода до воды. В этой реакции участвуют четыре иона НҐ на каждую молекулу Ог; протоны поступают из матрикса митохондрий (Геннис, 1997; Beavis, 1987).
Дефицит кислорода в определенных условиях может приводить к необратимому подавлению активности ЦХО и, как следствие, к остановке дыхания и подавлению аэробного образования энергии. Кинетические характеристики ЦХО (КмОг =10" — 10" М Ог) свидетельствуют о ее очень высоком сродстве к кислороду. Это означает, что инактивация фермента достигается лишь при очень низких концентрациях кислорода, которые в реальных условиях могут появляться, например, при аноксии (Лукьянова, 2000). Однако нарушения энергетического обмена начинаются раньше, чем достигается критическая концентрация кислорода, приводящая к снижению его потребления, т.е. задолго до уменьшения активности ЦХО (Лукьянова, 2000). Изменения функции дыхательной цепи при недостатке кислорода начинаются не на терминальном (цитохромном), а на субстратном ее участке, в области митохондриального ферментного комплекса I (НАД-зависимый путь окисления). В ответ на снижение концентрации кислорода происходит вначале усиление, а затем подавление активности НАДН-окидазного пути окисления, приводящее к нарушению переноса электронов на участке НАДН-CoQ и сопряженного с ним процесса окислительного фосфорилирования (первая, компенсаторная стадия биоэнергетической гипоксии). При увеличении тяжести или длительности гипоксического воздействия нарушения электронтранспортной функции дыхательной цепи последовательно распространяются от субстратного к цитохромному ее участку - на область цитохромов b - с (вторая стадия биоэнергетической гипоксии, сопровождающаяся декомпенсацией энергетического обмена), и наконец к ЦХО, которая инактивируется только в условиях аноксии (третья, терминальная стадия биоэнергетической гипоксии) (Лукьянова, 2000).
Динамика биохимических показателей кислородзависимых процессов в печени на разных сроках острой циркуляторнои гипоксии
Естественная резистентность организма к гипоксии с позиций окислительного метаболизма во многом определяется состоянием энергетического обмена клетки (Корнеев, 1994). Для млекопитающих все последствия, связанные с недостатком или полным отсутствием кислорода -это последствия недостатка энергии. Трактовка причин нарушений и прекращений жизненных отправлений клетки при недостатке кислорода и энергии оказывается очень трудной (Иванов, 1993). Достоверная оценка возникающих при этом нарушений структуры и метаболизма клеток возможна при анализе качества и количества промежуточных продуктов метаболической цепи (Рябов с соавт., 1991). Снижение или прекращение поступления в орган кислорода приводит к быстрому изменению путей синтеза, транспорта и потребления легко утилизируемых тканями макроэргических фосфатов. Одним из наиболее важных макроэргов является АТФ (Биленко, 1989). В таблице 2 представлены данные по определению концентрации АТФ. Как видно из таблицы 2, в группе животных с кровопотерей 0,75% через 3 и 7 часов после воздействия концентрация АТФ достоверно падает на 36,02% и 32,84% соответственно, спустя 24 часа имеется тенденция к снижению на 3,08% по сравнению с уровнем АТФ у интактных животных. Концентрация АТФ после кровопотери объемом 1,5% спустя 3 часа достоверно уменьшается на 32,26%, через 7 часов наблюдается тенденция к снижению на 10,75%, через 24 часа - к увеличению концентрации на 4,5% по сравнению с интактным уровнем. Таблица 2. Концентрация АТФ в печени крыс на разных сроках после кровопотери в зависимости от объема. Примечания: - результаты достоверны (р 0,05) по отношению к показателям у интактных животных; в % указаны изменения показателей в эксперименте по сравнению с интактными. Анализ данных показывает, что через 3 часа после гипоксического воздействия концентрация АТФ независимо от объема кровопотери снижается на довольно близкую величину (32,26% и 36,02% от нормы), спустя 7 часов при более массивной кровопотере (объемом 1,5%) содержание АТФ значительно выше, чем при меньшей кровопотере (объемом 0,75%). Снижение концентрации АТФ при гипоксии различного генеза показано во многих исследованиях (Биленко, 1989, Рябов с соавт., 1991, Лукьянова, 2000). А. Н. Леонов (1982) показал почти двукратное снижение содержания АТФ в печени крыс при острой кровопотере летального объема (2,5%) в первые минуты геморрагического шока, и нарастание дефицита АТФ на стадии агонии (Леонов А. Н., 1982; цит. по Рябову с соавт., 1991). Полученные нами данные о снижении содержания АТФ в условиях гипоксии согласуются с литературными. Восстановление концентрации АТФ спустя 24 часа после кровопотери можно объяснить включением адаптационных механизмов по поддержанию процессов жизнеобеспечения. В связи с тем, что в настоящее время установлено, что АТФ разного происхождения (аэробного или анаэробного) потребляется в различных внутриклеточных процессах, вопрос о том, какие пути синтеза АТФ повреждены, а какие компенсаторно временно усилены или могут быть усилены медикаментозно, приобретает особое значение (Биленко, 1989). Компенсаторную функцию по синтезу дополнительных количеств АТФ в условиях гипоксии берут на себя анаэробные энергопродуцирующие процессы, важнейшим из которых является гликолиз (Зиновьев, Козлов, Савельев., 1988). Усиление гликолиза является частным проявлением компенсаторной перестройки метаболизма, направленным на поддержание уровня энергетического обеспечения клеток в условиях усиления в них АТФ-зависимых процессов. Стимуляция анаэробного гликолиза в печени выступает в роли универсальной реакции метаболизма на стресс (Давыдов, Захарченко, Овсянников, 2005). В анаэробном гликолизе важную роль играет лактатдегидрогеназа (ЛДГ). Существует два основных пути реокисления внемитохондриального НАД, образующегося на окислительной стадии гликолиза: либо за счет пирувата с образованием лактата при участии внемитохондриальной ЛДГ, либо при участии дыхательной цепи митохондрий (челночный механизм) (Генинг, 1980; Ксейко, 2004). В анаэробных условиях лактат образуется в клетке вследствие того, что внемитохондриальный НАДН не может быть окислен дыхательной цепью и должен подвергнуться реокислению с участием пирувата. В присутствии кислорода, напротив, в большинстве клеток реокисление внемитохондриального НАДН должно происходить через дыхательную цепь, так как в обычных условиях лактат не накапливается в клетке. Однако в аэробных условиях лактат может образовываться путем реокисления НАДН пируватом, если не действуют челночные системы, обеспечивающие поступление внемитохондриального НАДН в митохондрии (Генинг, 1980; Ксейко, 2004). Таким образом, накопление лактата будет способствовать активации ЛДГ. С другой стороны, при действии продуктов липопереокисления нарушается процесс окислительного фосфорилирования. Это также ведет к нарушению образования макроэргических соединений и, в конечном счете, нарушению клеточной проницаемости (Зиновьев, Козлов, Савельев, 1988; Ксейко, 2004). Поэтому оба эти процесса определяют одно из патогенетических звеньев повышения содержания ЛДГ. В таблице 3 представлены полученные данные по определению уровня активности ЛДГ.
Динамика апоптозного индекса печени на разных сроках острой циркуляторнои гипоксии
Согласно Т. М. Buttke и P. A. Sandstrom (1994), N. Maulik at. al. (1998), В. П. Скулачеву (1999), Б. Н.Лю (2001), В. Н. Залесскому (2002) нарушение баланса АФК, ПОЛ и антиоксидантов в клетке (возникновение окислительного стресса) является интегративным фактором, объединяющим все апопто-тические сигналы, и универсальной формой реализации апоптотической программы. Общие представления о решающей роли избыточных АФК и ПОЛ в механизме апоптоза необходимо связать с действием конкретных исполнительных звеньев этого сложного процесса. В настоящее время внимание исследователей обращено на белки семейства bcl, р53 (Лю, 2001; Лушников, Абросимов, 2001), производные одноименных генов. Вс1-2 локализован на наружной поверхности митохондрий и регулирует заряд их трансмембранного потенциала, снижение величины которого является одним из проявлений апоптоза клеток (Бойчук, Мустафин, Фассахов, 2000). Выбор направления сигнализации в сторону апоптоза в большой степени зависит от экспрессии гена р53. Он связан с ДНК и реагирует на накопление нерепарированных разрывов ее нитей. Формирование большого числа разрывов ДНК вызывает апоптоз этих клеток, включаемый с участием р53 (Перевезенцева, 2001). При слабых повреждениях ДНК р53 останавливает прохождение клеточного цикла до репарации ДНК, а при грубых индуцирует апоптоз (Лю, 2001; Белушкина, Северин, 2001). Поэтому в качестве маркеров, по которым можно охарактеризовать клетки, подвергающиеся апоптозу, мы использовали выборочное иммуногистохимическое исследование продукта экспрессии р53 и bcl-2. На рисунках 3,4 представлены микрофотографии экспрессии белка р53 и белка bcl-2 при иммунногистохимическом определении в ткани печени крыс. Представленные микрофотографии отражают наличие клеток печени, вступивших в апоптоз. Однако анализ микропрепаратов показывает, что маркеры апоптоза р53 и bcl-2 избирательно окрашивают клетки печени. Так, р53 экпрессирован в гепатоцитах, в то время как bcl-2 локализован, в основном, вокруг триад. Согласно данным литературы, bcl-2 не найден в гепатоцитах, но обнаружен в малых желчных протоках (Аруин, 1998; Чиркин, 2000; Feldman, 1997; Patel, Gores, 1995). Поэтому для количественной характеристики апоптоза мы избрали метод окрашивания суспензии клеток печени акридиновым оранжевым (рисунки 4, 5). В таблице 11 представлены данные по определению апоптозного индекса (АИ) в суспензии изолированных гепатоцитов. Таблица 11. Апоптозный индекс в суспензии изолированных гепатоцитов крыс на разных сроках после кровопотери в зависимости от объема. Группы животных Интакгаые животные Экспериментальные животные Объем кровопотери 0,75% Объем кровопотери 1,5% Статистические показатели Время с момента кровопотери до декапитации (часы) 7 24 3 7 24 Примечания: - результаты достоверны (р 0,05) по отношению к показателям у интактных животных. Рис. 3. Иммуногистохимическое окрашивание печени на bcl-2. Экспрессия bcl-2 отражена более темным цветом. Световая микроскопия. Увеличение 400х. Рис. 4. Иммуногистохимическое окрашивание печени на р53. Темно-красным цветом отражена экспрессия р53. Световая микроскопия. Увеличение 400х. Рис. 5. Суспензия гепатоцитов при окрашивании акридиновым оранжевым. Зеленым цветом окрашены ядра клеток, не вступивших в апоптоз. Люминесцентная микроскопия. Увеличение 400х. / Рис.6. Суспензия гепатоцитов при окрашивании акридиновым оранжевым. Оранжевым цветом окрашено ядро клетки, вступившей в апоптоз. Люминесцентная микроскопия. Увеличение 400х. Анализ данных таблицы 11 позволяет говорить об увеличении апоптозого индекса во всех экспериментальных группах по сравнению с контролем. При этом наибольшие значения АИ наблюдаются через 24 часа после кровопотери объемом 1,5 %. Данных литературы, отражающих АИ печени после кровопотери, не обнаружили. Согласно литературе зоны апоптоза могут окружать зоны некроза (Новиков, 1996; Beilharz at. al., 1995), и это позволяет считать, что речь идет об ассоциированном феномене (Аруин, 2000; Li at. al., 1995). Как погибнет клетка - путем некроза или апоптоза - детерминируется уровнем АТФ в клетках (Eguchi, Shimizu, Tsujimoto, 1997). При высоком уровне АТФ возникает апоптоз, при удалении АТФ апоптоз блокируется. На уровень АТФ влияет, в свою очередь, проницаемость митохондрий, что и определяет выбор пути клеточной гибели (Аруи, 2000; Lieser at. al., 1998).
