Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
I. Общая характеристика денервационно-реиннервационного синдрома 10
-
Влияние аксотомии на нейроны 10
-
Влияние аксотомии на скелетную мышцу 13
П. Процесс регенерации и роста поврежденных аксонов в ПНС 13
III. Факторы роста периферических нервов 14
III. 1. Фактор роста нервов (NGF) 15
-
Мозговой нейротрофический фактор и нейротрофины 15
-
Цилиарный нейтротрофический фактор 16
Ш.4. Инсулиноподобные факторы роста (IGF) 16
III.5. Пептиды семейства меланокортинов 17
IV. Нейротрофические эффекты АКТГ и структурно сходных пептидов 17
V. Источники и механизмы действия АКТГ и родственных пептидов на рост и
активность нервно-мышечного аппарата 20
V. 1. Источники АКТГ в организме 20
V.2. Механизмы действия пептидов семейства АКТГ 20
V.3. Эффекты АКТГ in vitro 23
-
Клиническая практика использ овадя пептидов семейства а-МСГ/АКТГ для лечения нервно-мышечных заболеваний 23
-
Пептидный препарат "СЕМАКС" и его свойства 24
-
Общая характеристика строения и свойств урокиназы и тканевого активатора
плазминогена 26
VIII. 1. Химическая структура фермента урокиназы .26
VIII.2. Химическая структура тканевого активатора плазминогена 27
-
Роль и функции урокиназы и тканевого активатора плазминогена в регенерации и росте нервной ткани in vitro и in vivo 29
-
Содержание и функции урокиназы и ТАП в ПНС 30
X. 1. Во время эмбрионального развития 30
Х.2. В синаптической пластичности 31
Х.З. Во время посттравматической регенерации нерва 32
МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 35
I. Объекты исследования 35
П. Хирургические методы 36
-
Мофометрические методы 36
-
Электрофизиологические методы 36
IV. 1. Метод регистрации суммарного потенциала действия в мышце in situ
(миограмма) 38
IV.2. Метод регистрации суммарного потенциала действия нерва in vitro 38
IV.3. Метод регистрации суммарного ПД нерва скелетной мышцы EDL
in vitro 39
IV.4. Обработка и анализ данных 40
V. Методы введения веществ 40
VI.1. Хроническое введение препаратов 40
VI.2. Однократное локальное введение веществ 40
VI. Используемые в работе вещества 41
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 42
I. Исследование процессов регенерации аксонов в составе малоберцового
нерва мыши после его раздавливания. Морфометрический и
электрофизиологический анализ 42
-
Морфометрический анализ 42
-
Электрофизиологический анализ 48
1.2.1. Исследование электрической активности моторных волокон
малоберцового нерва мыши в первые две недели после пережатия
нерва 48
1.2.2. Исследование хода реиннервации EDL мыши в первые две недели
после пережатия нерва с помощью М-ответа мышцы 56
1.2.3. Исследование хода регенерации сенсорных волокон малоберцового
нерва в первые две недели после пережатия нерва 61
П. Исследование воздействия пептидного препарата семакс на процесс
регенерации аксонов малоберцового нерва мыши 68
II. 1. Морфометрический анализ влияния хронического внутрибрюшинного введения семакса на регенерацию аксонов малоберцового нерва мышей.68
II.2. Электрофизиологический анализ 69
II.2.1. Исследование влияния хронического введения семакса на процесс
регенерации моторных волокон (и реиннервации мышцы EDL) на 11
сутки после пережатия нерва 69
П.2.2. Анализ влияния хронического внутрибрюшинного введения семакса,
а-МСГ и рибоксина на процесс регенерации моторных волокон на 11
сутки после пережатия
нерва 71
П.2.3. Анализ влияния хронического внутрибрюшинного введения семакса,
а-МСГ и рибоксина на процесс регенерации чувствительных волокон
малоберцового нерва 72
П.2.4. Исследование зависимости эффектов хронического интраназального
введения семакса от дозы введения 76
III. Исследование воздействия сериновой протеиназы урокиназы на регенерацию
аксонов периферического нерва 84
III. 1. Исследование влияния локального введения урокиназы на процесс
регенерации моторных волокон (и реиннервации мышцы EDL) на 11
сутки после раздавливания нерва 85
Ш.2. Сопоставление действия локального одноразового введения урокиназы
на регенерацию моторных и сенсорных аксонов периферического
нерва 88
-
Исследование влияния локального введения тканевого активатора плазминогена на процесс регенерации моторных волокон (и реиннервации мышцы EDL) на 11 сутки после раздавливания нерва 92
-
Исследование влияния локального введения форм урокиназы на процесс регенерации моторных волокон (и реиннервации мышцы EDL) на 11 сутки после раздавливания нерва 94
IV. Исследование эффектов совместного введения урокиназы и семакса на
регенерацию аксонов малоберцового нерва 98
IV. 1. Анализ латентного периода М-ответа реиннервированной EDL мыши..98
IV.2. Анализ параметров суммарного ПД сенсорной части аксонов
малоберцового нерва 99
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 104
ВЫВОДЫ 106
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 108
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 109
Введение к работе
Актуальность исследования. Одной из актуальных проблем современной неврологии и патофизиологии является изучение пластических перестроек нейронов и нервных отростков после их травматических повреждений и поиски эффективных воздействий на эти процессы [Гехт, Ильина 1982; Greensmith et al.. 1996; Гехт, 1990; Fugleholm et al., 2000]. Хорошо известно, что нарушение целостности периферических нервов - разрыв или раздавливание аксонов -приводит к развитию денервационно-реиннервацонного синдрома (ДРС) в мышцах конечности [Hoffer et al., 1979; Giannini С. et al., 1989]. ДРС включает дегенерацию дистального отрезка нерва (ниже места перерезки) и последующее прорастание аксонов от места перерезки на периферию - к мышцам-мишеням. Вслед за денервацией мышц конечности просходит их реиннервация, то есть восстановление первоначальных нервно-мышечных связей, благодаря способности периферических аксонов к регенерации [Gutmann, Sanders 1943; 1989; Madison et al., 1999].
В настоящее время список фармакологических средств с выраженным облегчающим воздействием на выживание периферических нейронов и их нервных отростков очень ограничен [Fu, Gordon, 1997; Fawcett, 1998; Челышев, 2000]. Ведется интенсивный скриннинг биологически активных соединений, способных стимулировать регенерацию аксонов и нейронов после аксотомии [Gispen 1993; Lindsey et al., 1994; McMahon, Priestly, 1995; Davies, Silver, 1998; Челышев и др., 2001]. Одним из путей решения проблемы является подбор комплекса взаимодополняющих химических препаратов, отличающихся механизмами и способами реализации своего действия на пластические свойства нервной ткани [Lindsey et al., 1994; Greensmith, Vrbova,1996].
Перспективной группой нейротрофических препаратов в последние годы признаны пептиды семейства проопиомеланокортинов [Bijlsma et al., 1983; 1984; Strand et al.,1993; Gispen, Verhaagen, Bar, 1994]. Показана способность ряда длинных и коротких фрагментов АКТГ стимулировать процессы регенерации аксонов периферических нервов после их механических или химических повреждений [Strand, Kung, 1980; Strand et al, 1993; Van de Meent et al., 1997; Verhaagen et al., 1986; Lankhorst et al., 2000]. Отечественный препарат семакс - синтетический аналог фрагмента АКТГ (АКТГ4_7-Рго-01у-Рго) хорошо известен в клинике как нооропное средство и протектор постишемической дегенерации нейронов [Пономарева-Степная и др., 1989; Ашмарин и др., 1997; Асташкина и др., 2001]. Возможность облегчающих воздействий семакса на регенерацию периферических аксонов до сих пор не была изучена.
Другой группой соединений, способствующих |егенерации нервной ткани, являются металло- и эндопротеиназы. К их числу принадлежит и сериновая протеиназа урокиназа (УК) (54кД). Этот белок известен как активатор плазминогена и поставщик плазмина в примембранном слое клеток. В последние годы показано, что в составе молекулы УК, - наряду с протеолитическим доменом -имеются и другие, предназначенные для связывания УК с мембранными рецепторами и запуска каскада внутриклеточных реакций [Stepanova et al., 1999; Степанова, Ткачук 2002]. Обнаружено повышение уровня эндогенной урокиназы и ее высвобождение из конусов роста растущих аксонов, а также прирост числа рецепторов к урокиназе на конусах роста регенерирующих аксонов in vitro и in vivo [Hantai, Rao, Festoff, 1990; Nakajama et al., 1996; Seeds et al., 1997]. Высказываются предположения, что этот полифункциональный белок может играть важную роль в ремоделировании различных тканей, в том числе, - и нервной, стимулируя прорастание аксонов и выживание нейронов [Muir et al.,1998; Farias-Eisner et al.. 2000]. Вопрос о способности экзогенно вводимой урокиназы облегчать регенерацию периферических аксонов in vivo после их повреждения до сих пор оставался не изученным.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изучение возможных стимулирующих воздействий двух препаратов - синтетического пептида семакса и сериновой протеиназы урокиназы - на процессы регенерации периферических нервов у мыши.
В работе были поставлены следующие конкретные задачи.
1. Разработать модель ДРС мышц задней конечности у мышей, используя метод локального раздавливания малоберцового нерва; определить оптимальные сроки и функциональные параметры процесса регенерации аксонов для тестирования нейротрофических воздействий.
2. Изучить влияние хронического (7-9 суток) внутрибрюшинного или интраназального введения мышам препарата семакс (50, 100, 200мкг/кг/сутки) на микроструктуру и функциональные показатели регенерирующих аксонов (возбудимость, скорость проведения, ритмическую активность и другие). Сопоставить эффекты семакса с действием других известных нейротрофических препаратов (а-МСГ и рибоксина).
Исследовать влияние препарата семакс на процессы прорастания нервных отростков in vitro - на культуре эмбриональных спинальных нейронов лягушки.
Изучить нейротрофические эффекты урокиназы, наносимой на нерв сразу после его раздавливания путем локальной одноразовой аппликации в составе плюронического геля, обеспечивающего градуальное высвобождение препарата. Сопоставить эффекты урокиназы с действием другого сходного с ней по протеиназной активности агента - тканевого активатора плазминогена - на процессы регенерации аксонов и реиннервации мышц.
Сопоставить нейротрофические эффекты введения in vivo полноразмерной формы (урокиназы) и отдельных ее доменов, отличающихся характером активности.
6. Изучить последствия совместного введения препаратов "семакс" и "урокиназа" на процессы регенерации периферических аксонов и восстановления двигательной иннервации мышц голени.
Научная новизна.
В результате проведенных исследований на мышах детально разработана модель ДРС, позволяющая проводить скрининг нейротрофических препаратов. Обнаружена ранее не известная способность препарата семакс избирательно, дозо-зависимо облегчать процессы регенерации крупных сенсорных аксонов(из группы первичных афферентов) в составе смешанного периферического нерва.
В работе впервые установлено, что экзогенная урокиназа при ее локальной аппликации на раздавленный нерв обладает нейротрофической активностью: способна дозо-зависимо и равноэффективно облегчать регенерацию как моторных, так и сенсорных аксонов смешанного нерва.
Установлен ранее не известный факт, что для проявления нейротрофической активности урокиназы необходимо действие полноразмерной формы белка, включающей как протеолитический, так и рецептор-связывающие домены.
Впервые показано, что при совместном введении мышам препаратов семакс и урокиназа удается достигнуть выраженного облегчения процессов регенерации аксонов. При этом результативность совместного введения препаратов превышает эффекты их действия поодиночке.
Научно-практическая значимость.
В работе удалось обнаружить новый аспект физиологической активности уже известного пептидного ноотропного препарата семакса. Установленный факт избирательного облегчения семаксом регенерации группы сенсорных аксонов и нейронов (кожной тактильной чувствительности) представляет ценность с общенаучной точки зрения - для понимания специфики действия коротких нестероидогенных фрагментов АКТГ на нервную и другие системы организма. Кроме того, этот факт имеет и прикладное значение - для возможного клинического использования семакса в терапии сенсорных невропатий.
Несомненный научный интерес представляет и обнаруженная в данной работе нейротрофическая активность экзогенной урокиназы. Выявленная способность урокиназы - при локальной аппликации препарата на нерв - облегчать регенерацию как моторных, так и сенсорных аксонов, по-новому высвечивает диапазон действия этого полифункционального белка. Проведенный в работе анализ вклада отдельных доменов урокиназы в реализацию ее эффектов может оказаться полезным для понимания механизмов нейротрофического действия урокиназы на уровне периферических аксонов. В целом, представленные в работе данные позволяют дополнить имеющийся список нейротрофических агентов двумя новыми - препаратами семакс и урокиназа, приближают к пониманию механизмов нейротрофического действия этих агентов, открывают перспективы для их индивидуального либо совместного применения в клинике периферических сенсомоторных невропатий.
