Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о системе гемостаза 11
1.1. Характеристика первичного (сосудисто-тромбоцитарного) гемостаза 11
1.2. Характеристика плазменного гемостаза 15
1.3. Физиологическая противосвертывающая система (ПСС) крови 22
1.3.1. Фибринолитическое звено ПСС: ферментативный фибринолиз в крови и тканях 23
1.3.2. Неферментативный фибринолиз как основное гуморальное звено ПСС 27
1.3.3. Антикоагулянтное звено ПСС 30
1.4. Роль сосудистого эндотелия в гемостатических реакциях 36
Глава 2. Коллаген и его фрагменты 38
2.1. Структура и типы коллагена 38
2.2. Участие коллагена в процессах гемостаза 41
2.3. Вещества, способствующие гидролизу коллагена и продукты гидролиза 46
2.4. Связь коллагена с гликозаминогликанами и протеогликанами экстрацеллюлярного матрикса 49
Глава 3. Влияние глипролинов и их комплексов с гепарином на гемостаз 51
3.1. Противосвертывающие эффекты и стабильность глипролинов 51
3.2. Комплексные соединения глипролинов с гепарином 56
Глава 4. Применение коллагена, глипролинов и гепаринов для коррекции при нарушении гемостаза 57
4.1. Применение препаратов коллагена и пролинсодержащих пептидов 57
4.2. Коммерческие гепарины животного происхождения 58
4.3. Противосвертывающие средства растительного происхождения .60
Глава 5. Материалы и методы 67
Глава 6. Результаты экспериментов 76
6.1. Исследование противосвертывающих эффектов линейных и циклических глипролинов 76
6.1.1. Антикоагулянтные, фибринолитические, антифибринстабилизирующие и антитромбоцитарные эффекты глипролинов в условиях in vitro 76
6.1.2. Влияние глипролинов на показатели системы гемостаза при внутривенном введении животным 81
6Л .3. Дозозависимость и динамика действия глипролинов 83
6.1.4. Влияние глипролинов на состояние системы гемостаза при внутрибрюшинном введении животным 87
6.1.5. Состояние системы гемостаза при хроническом и многократном введении глипролинов животным 89
6.2. Изучение комплексов глипролинов с ВМГ 94
6.2.1. Получение комплексов глипролинов с гепарином и доказательство комплексообразования 94
6.2.2. Противосвертывающие эффекты комплекса ВМГ-PG в условиях in vitro 98
6.2.3. Состояние системы гемостаза при внутривенном, пероральном, внутрибрюшинном и интраназальном введении комплекса ВМГ-PG 103
6.3. Изучение комплексов глипролинов с НМГ 108
6.3.1. Комплекс НМГ-PG 108
6.3.2. Комплекс НМГ-PG в условиях in vitro и in vivo 109
6.4. Изучение комплексов глипролинов с растительным антикоагулянтом 113
6.4.1. Получение, очистка и изучение противосвертывающих свойств растительного антикоагулянта 113
6.4.2. Комплексы глипролинов с гепариноподобным растительным антикоагулянтом в условиях in vitro и in vivo 117
6.5. Коррекция нарушений системы гемостаза применением глипролинов и их комплексных соединений с гепарином 125
6.5.1. Влияние глипролинов на гемостаз при возрастных изменениях организма 125
6.5.2. Исследование антитромботических эффектов глипролинов и их комплексов с ВМГ на модели тромбообразования 128
Обсуждение результатов 132
Заключение 144
Выводы 147
Список литературы 149
- Характеристика первичного (сосудисто-тромбоцитарного) гемостаза
- Участие коллагена в процессах гемостаза
- Противосвертывающие эффекты и стабильность глипролинов
- Противосвертывающие средства растительного происхождения
Введение к работе
Актуальной проблемой современной физиологии является исследование механизмов регуляции нормального функционирования системы гемостаза.
Физиологическая регуляция жидкого состояния крови и ее свертывания,
согласно теоретическим представлениям Б.А.Кудряшова, обеспечивается
рефлекторно-гуморальным взаимодействием свертывающей и
противосвертывающей (ПСС) систем. В этих реакциях естественными гуморальными агентами ПСС служат гепарин и активаторы плазминогена.
Известно, что в нормальном функционировании гемостаза принимают участие и физиологически активные регуляторные пептиды (в том числе глипролины PG, PGP, GP), механизм действия которых окончательно не расшифрован (Абрамова и др., 1996; Ашмарин и др., 1996; Ашмарин и др., 1998).
В настоящее время особое внимание уделяется изучению механизма действия на гемостаз природных глипролинов и веществ, созданных на их основе. Одним из вероятных предшественников природных глипролинов является основной структурный белок - коллаген, который при физиологических условиях подвергается протеолизу под влиянием ферментов, таких как трипсин, химотрипсин, пепсин, эластаза, металлопртеиназы. Это может привести к образованию полипептидов и простейших пептидов, содержащих пролин, глицин и оксипролин (Hashimoto et al., 1995; Bon et al., 1997; Lazareva et al., 1997; Rothman et al., 1997).
Известно, что естественный антикоагулянт - гепарин - способен в силу своих структурных особенностей взаимодействовать с различными пептидами и белками (Ляпина и др., 2000; Hirsh et al., 2001; Kudrjashov et al., 1986) с образованием комплексов, обладающих фибринолитическим и антикоагулянтным действием (Ашмарин И,П. и др., 1996). С другой стороны, глипролины входят в гепаринсвязывающую область коллагена и вполне вероятно, что они способны взаимодействовать с гепарином с образованием комплексных соединений.
В настоящее время в медицине в качестве антикоагулянтов
используются коммерческие формы гепарина животного происхождения,
который имеет тенденцию к ограничению в связи с возможностью развития
различных побочных эффектов при его применении (геморрагии,
тромбоцитопения, остеопороз и др.) (Бокарев, 2003; Makarov et al., 2004;
Pettila et al., 2002). Поэтому весьма актуален поиск агентов, обладающих
регуляторными функциями, способными нормализовать свертывание крови
при ее нарушениях. В то же время известно, что многие биологически
активные вещества из высших растений активно участвуют в процессах
гемокоагуляции и фибринолиза. Имеются сообщения о наличии в некоторых
растениях гепариноподобных полисахаридов, обладающих
антикоагулянтным действием и нашедших применение в клинической практике (Ляпина и др. 2001; Щербак и др. 2001; Кузнецова и др., 2003). Таким образом, растения могут быть перспективным источником для создания эффективных средств для коррекции нарушений гемостаза.
Принимая во внимание, что известные комплексные соединения как высоко- так и низкомолекулярного гепарина с олигопептидами (с тафцином, тимозином) (Ляпина и др., 1990; Ашмарин и др., 1991) ингибируют как первичный, так и плазменный гемостаз, и учитывая то обстоятельство, что в литературе нет систематизированных данных о взаимодействии гепарина с пролинсодержащими пептидными фрагментами коллагена, мы поставили цель - изучить основные закономерности регуляторного действия глипролинов и их комплексных соединений с гепарином на функциональное состояние свертывающей и противосвертывающей систем.
Для достижения цели решались следующие задачи:
1. Изучить влияние на антикоагулянтную и фибринолитическую активность крови глипролинов (PG, PGP, c-PG) в разных дозах и при разных способах введения животным (внутривенно, внутрибрюшинно, перорально, интраназально).
Доказать взаимодействие глипролинов с разными видами гепаринов, получить их комплексные соединения и установить антикоагулянтные, фибринолитические, антифибринстабилизирующие, антитромбоцитарные эффекты этих препаратов в условиях in vitro и in vivo.
Исследовать коррегирующую роль различных пептидных соединений при нарушениях свертывания крови на моделях животных с депрессией функции противосвертывающей системы (возрастные изменения организма) и тромбообразования.
Научная новизна исследования. Впервые изучен ряд линейных и
циклических глипролинов и их комплексов с разными формами гепаринов
(ВМГ, НМГ животного и растительного происхождения), среди которых
выявлены соединения, обладающие in vitro сочетанными
антикоагулянтными, фибриндеполимеризационными, антифибрин-
стабилизирующими и антитромбоцитарными свойствами. Обнаружено наличие у данных соединений собственной неферментативной фибринолитической активности.
В экспериментах на животных изучено регуляторное влияние этих соединений на систему гемостаза и впервые показана важная роль гепарина как составной части комплексов с глипролинами для реализации высокой фибриндеполимеризационной, антикоагулянтной и антитромбоцитарной активности крови.
Впервые установлено, что глипролины и их комплексы с гепарином стимулируют секрецию тканевого активатора плазминогена (тАП), способствуют снижению уровня антиплазминов и увеличению уровня гепарина в кровотоке.
Методами ИК-спектрофотометрии, перекрестного электрофореза и электрофореза в полиакриламидном геле получены доказательства взаимодействия гепарина с глипролинами с образованием новых комплексных соединений, обладающих высокой антитромботической активностью.
Теоретическая и практическая значимость работы.
В эксперименте определена физиологическая роль глипролинов и их комплексных соединений с гепарином, участвующих в регуляции жидкого состояния крови. Показано, что такие соединения создают в организме антикоагулянтный, фибринолитический фон, защищая его от возникновения внутрисосудистых сгустков крови при их провокации.
Результаты работы существенно дополняют современные представления о механизмах антикоагулянтного и фибринолитического действия глипролинов. Усиление противосвертывающих свойств глипролинов в комплексах с гепарином свидетельствует о важности обоих компонентов для этого процесса.
Установлено, что антикоагулянтное действие глипролинов и растительного гепарина сопоставимо с действием гепарина животного происхождения, что создает реальную перспективу получения новых антикоагулянтов.
Предложен способ получения препарата из корней пиона Paeonia suffruticosa с антикоагулянтный действием (патент № 2068702 от 22.03.95).
Существенное значение может иметь выявленная нами функциональная противосвертывающая активность глипролинов и их комплексных соединений с гепарином для проявления антитромботического действия в организме и для восстановления регуляторных взаимоотношений свертывающей и ПСС при депрессии функции ПСС (при возрастных изменениях организма).
Данные, полученные при пероральном и интраназальном применении глипролинов и их комплексов, свидетельствующие о сохранении противосвертывающих эффектов, позволяют рекомендовать их для профилактики и борьбы с тромбообразованием на его начальных стадиях.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова (28 июня 2004 г.). Отдельные фрагменты работы доложены на II Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1995); на XIII meeting of Inernational Society of Haematology (Istanbul, 1995); на XIII International Congress on fibrinolysis and thrombolysis (Barselona, 1996); на III Всероссийской конференции «Тромбозы и геморрагии» (Москва, 1997); на International Congress on Atherothrombosis and Hemostasis (Italy, 2002); на Международной конференции, посвященной 10-летию со дня основания Всероссийской ассоциации по изучению тромбозов, геморрагии и патологии сосудистой стенки им. Шмидта-Кудряшова (Москва, 2003); на 8-th Annual Congress of European Hematology Association (France, 2003).
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 173 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов работы и их обсуждения, заключения, выводов, списка сокращений, списка литературы (115 отечественных и 153 иностранных источников), иллюстрирована 23 таблицами и 16 рисунками.
Характеристика первичного (сосудисто-тромбоцитарного) гемостаза
Первичный гемостаз (ПГ) почти целиком обусловлен сужением сосудов и механической закупоркой места повреждения агрегатами тромбоцитов (цит. по Циммерману и др., 1996). Этот механизм способен самостоятельно прекратить кровотечение из наиболее часто травмируемых мелких сосудов с низким давлением. Он же начинает гемостаз и в крупных сосудах. Стабилизация тромбов зависит от появления тромбина, который вызывает образование нитей фибрина, скрепляющих тромбоцитарные агрегаты. ПГ осуществляется тромбоцитами и их активными соединениями — тромбоцитарными факторами свертывания крови,
В деятельности системы гемостаза тромбоциты выполняют ряд функций, к которым относятся: ангиотрофическая (сохранение нормальной структуры, резистентности сосудистого эндотелия и непроницаемости стенок капилляров для эритроцитов); адгезивно-агрегационная (адгезия к поврежденной поверхности стенки сосуда и формирование тромбоцитарных агрегатов — тромбоцитарной «пробки»); коагуляционно-литическая (участие вследствие наличия собственных и адсорбированных факторов в гемокоагуляции и фибринолизе); ретрактальная (обеспечение сокращения тромба); ангиотоническая (поддержание тонуса сосудов и их спазма при повреждении). Помимо этого тромбоциты играют важную роль в атерогенезе, инициировании репарации тканей, регулировании местной воспалительной реакции и иммунитета (цит. по Струковой, Ткачук, 2002).
На клеточной поверхности тромбоцитов человека выявлено около 30 типов участков рецепторного связывания биологически активных соединений разнообразной химической природы, начиная от медиаторов и кончая лигандами белковой природы. Большинство рецепторов относится к классу интегринов, гетеродимерных гликопротеинов (GP), которые представляют собой комплексы, состоящие из нескольких субъедениц, различные комбинации которых являются участками для связывания различных лиганд, то есть определенных последовательностей аминокислот белковой молекулы. К основным интегринам относятся следующие рецепторы: GP Ia/IIb - рецептор коллагена; GP ІсЯІа - рецептор фибронектина; GP ІЬЯХ (GP Ib/V-IX) - рецептор фактора фон Виллебранда (vWF), опосредующий адгезию тромбоцита к субэндотелию сосудов и обладающий высокой аффинностью к тромбину (Andrews et al., 1999); GP Ilb/IIIa - рецептор фибриногена, фибронектина и vWF, опосредующий агрегацию тромбоцитов (Shattil, 1999). Кроме того, в функциональных преобразованиях тромбоцитов человека задействованы также специфические мембранные рецепторы GP IV (CD36) - один из рецепторов коллагена, GP VI - один из возможных рецепторов коллагена, GP Ia-IIa, обеспечивающие дополнительный механизм адгезии тромбоцитов к коллагену, и аг-адренергические рецепторы адреналина (Патрушев, 2002).
Действие тромбина, одного из наиболее мощных активаторов тромбоцитов, реализуется через два типа рецепторов, действующих, по всей вероятности, синергично (Coughlin, 1999). Один из них - гликопротеиновый комплекс Ib-V-IX, другой — через активируемые протеазами рецепторы (PAR), идентифицированнные на клетках эндотелия, тромбоцитах, фибробластах, гладкомышечных, моноцитах, остеобластах, нейронах, на глиальных и тучных клетках (Coughlin, 2000). Все представители PAR относятся к суперсемейству интегральных мембранных рецепторов, сопряженных с G-белками. Обнаружено несколько типов таких рецепторов: PAR-1, 3, 4 - рецепторы тромбина (Andersen et al., 1999; Kahn et al., 1998) и PAR-2 - рецептор фактора Xa свертывания крови, фактора Vila с тканевым фактором, трипсина, триптазы тучных клеток и сериновой протеиназы 1 мембранного типа (МТ-СП-1) (Аасрум, Придз, 2002).
Действие АДФ, агониста агрегации тромбоцитов, реализуется через специфические пуринорецепторы Р2, конкурентным антагонистом которых является АТФ (Ralevic, Burnstock, 1998). Обнаружены три рецептора АДФ, экспрессирующиеся на поверхности тромбоцитов (Gachet, 2001). Рецептор P2Yi, ассоциированный с Gq-белком, индуцирует перестройку цитоскелета, приводящие к изменению формы тромбоцитов. Второй рецептор P2Y2 (P2YAC) ассоциирован с Q -белком. Его стимуляция необходима для полноценного завершения процесса агрегации и стабилизации агрегатов. Функции третьего рецептора Р2ХЬ представляющего собой кальциевый канал, индуцируемый АДФ, еще окончательно не выяснены (Rolf et al., 2001).
Первым этапом свертывания является активация тромбоцитов, которая инициируется при повреждении сосудистого эндотелия и обнажении субэндотелиального внеклеточного матрикса (цит. по Шиффману, 2001). При этом создаются условия для адгезии и агрегации тромбоцитов к коллагену и другим адгезивным белкам поврежденной поверхности и активации фактора XII свертывающей системы крови.
Адгезия (прилипание) тромбоцитов к волокнам соединительной ткани индуцируется GP Ib-V-IX (CD 42), который связывается с vWF сосудистой стенки или плазмы крови (Manns et al., 2002).
Некоторые другие рецепторы на поверхности тромбоцитов тоже принимают участие в адгезии: GP Ia-IIa, GP IV или VI работают в условиях замедленного тока крови (в венах). В артериальном кровотоке они действуют только после адгезии, вначале опосредованной vWF (Shen et al., 2000). VWF выполняет роль мостиков, соединяющих тромбоциты с субэндотелием, взаимодействуя с GPIb тромбоцитов. Кроме того, vWF также необходим для экспрессии прокоагулянтных тромбоцитарных фосфолипидов, ведущих к генерации тромбина (Бегуин, 2003). Передача сигнала vWF внутрь клетки через GP Ib/TX повышает концентрацию внутриклеточного Са , ведет к освобождению АДФ и экспонированного на поверхности клетки второго рецептора — GP IIb/ІІІа, который служит рецептором vWF, фибриногена и фибронектина.
Высвобождающийся из поврежденного эндотелия и адгезирующих тромбоцитов АДФ является важнейшим индуктором агрегации. Тромбоциты прилипают к присоединившимся к эндотелию кровяным пластинкам, а также склеиваются между собой, образуя агрегаты, которые являются основой тромбоцитарной «пробки». Под действием АДФ, адреналина, серотонина, витронектина, фибронектина и других соединений на мембране тромбоцитов наступает экспрессия рецепторов к фибриногену (GP IIb/ІІІа), которые в присутствии ионов Са связывают между собой близлежащие тромбоциты, формируя агрегаты (обратимая агрегация). Вторичная (необратимая) агрегация осуществляется посредством нескольких механизмов (цит. по Голышенкову, 2004): одним из путей действия агонистов является увеличение содержания цито плазматического С а и активация фосфолипазы А2, вызывающей освобождение из мембраны тромбоцитов арахидоновой кислоты - источника образования тромбоксана К% - наиболее мощного эндогенного индуктора агрегации тромбоцитов.
Участие коллагена в процессах гемостаза
Существуют убедительные доказательства, что коллаген принимает участие в регуляции процесса свертывания крови. Еще несколько десятилетий назад исследование гемостатических «пробок» животных и человека выявило присутствие волокон фибрина на внешней стороне сгустка в непосредственной близости от коллагеновых фибрилл (Sixma, Wester, 1977). Хотя этот факт можно было бы объяснить локальным действием тканевого фактора, который ассоциируется с матриксом соединительной ткани, это не исключает возможности, что коллаген также может играть определенную роль сам по себе.
Прямое влияние коллагена на процесс свертывания крови было установлено для трех факторов свертывания (факторІХ, vWF и фактор XII). Не так давно получено доказательство специфичного связывания коллагена IV типа с фактором IX. Stafford с коллегами продемонстрировал (Cheung et al., 1996), что связывание фактора IX с коллагеном IV типа в присутствии гепарина имело такие же характеристики, как и связывание с эндотелиальныыи клетками, Методом атомной микроскопии в коллагене IV типа было обнаружено два сайта связывания с фактором IX: на расстоянии 98 и -50 nm от С-терминального расщепляемого пепсином конца (Woldberg et al., 1997). Эксперименты с мышами, дефицитными по фактору IX подтвердили возможность связывания фактора ТХ с эндотелиальными клетками. Полагают, что такое связывание играет роль в поддержании уровня фактора ТХ в крови (Gui et al„ 2002).
Прямое связывание vWF с тромбоцитами необходимо для их адгезии к коллагену. Известно, что высоко-молекулярные мультимеры vWF имеют более высокую способность к связыванию с коллагеном. Bendetowicz с коллегами (1999) предложили вероятное объяснение этого явления, которое заключается в том, что связывание высокомолекулярных мультимеров vWF с коллагеном, по-видимому, сопровождается освобождением фактора VTTI, позволяя ему объединяться со свободными низкомолекулярными мультимерами. Это подтверждается экспериментальными наблюдениями, что vWF, связанный с коллагеном, имеет в 4 раза меньшую аффинность к фактору VIII .
Активация фактора XII (внутреннего пути каскада коагуляции), обнаруженная в 60-е годы XX века, была осуществлена недостаточно чистыми препаратами коллагена, так что эти данные нуждаются в пересмотре и коррекции (Zacharski, Rbsenstem, 1975).
Кроме того, коллаген оказывает непрямое действие на регулирование образования тромбина, поскольку отрицательно заряженные фосфолипиды, такие как фосфатидилсерин, экспонируются на поверхности тромбоцитов после взаимодействия с коллагеном и формируют каталитическую поверхность для сборки активных свертывающих комплексов и генерации тромбина. Фосфатидилсерин, присутствующий на фосфолипидной поверхности, способствует взаимодействию фактора ТХа с фактором X (теназа) и/или фактора Ха с фактором II (протромбиназа) в комплексах с кофакторами - фактором Villa или фактором Va, соответственно. Такая экспозиция фосфатидилсерина обуславливается транслокацией (переходом) этого фосфолипида на внешнюю поверхность плазматической мембраны. Стимуляция тромбоцитов под действием тромбина также может индуцировать эту транслокацию, при этом коллаген и тромбин взаимно активируют друг друга. Адгезия тромбоцитов к коллагену также может приводить к появлению (присутствию) на тромбоцитах, ассоциированных с лейкоцитами, тканевого фактора (Zillmann et al., 2001). Точный путь, который приводит к такой экспозиции тканевого фактора, еще не установлен, но в условиях ex vivo исследования по перфузии показали, что образование фибрина на коллагене может быть полностью предотвращено ингибирующими антителами к тканевому фактору (Giesen, Nemerson, 2000).
Все коллагены, когда они находятся в полимерной форме, проявляют способность индуцировать агрегацию тромбоцитов in vitro, показывая, возможно, способность коллагенов взаимодействовать с тромбоцитами и активировать их при подходящих условиях (цит. по Barnes, Farndale, 1999). Это можно объяснить присутствием в тройной спирали коллагеновых молекул триплетов Gly-Pro-Hyp (GPO), которые взаимодействуют с тромбоцитарным гликопротеином VI (GP VT) (Knight et al., 1999). Адгезия тромбоцитов к коллагенам типа I-IV, особенно к коллагену IV типа, зависит от присутствия ионов Mg2+(Sixma et al., 1997). Медиатором Mg -зависимой адгезии тромбоцитов к коллагену служит GP la-Па (агРО Для осуществления адгезии тромбоцитов к коллагену необходимо наличие vWF. Антитела, направленные против vWF или рецептора тромбоцитов GP lb, ингибируют адгезию тромбоцитов к коллагенам всех типов при высоких скоростях сдвига. VWF связывается непосредственно с коллагенами I и III типов. Высокомолекулярные мультимеры vWF связываются более легко, но адгезия также поддерживается и низкомолекулярными мультимерами (Wu et al., 1996). Сайт связывания vWF с коллагенами I и III типов локализуется в A3 домене (Lankhof et al., 1996). Взаимодействие vWF с коллагеном IV типа отличается от такового, установленного для коллагенов типа I и III (van Zanten et al,, 1996). Прямого связывания vWF с коллагеном этого типа не обнаружено, хотя антитела и против vWF, и GP lb ингибируют адгезию тромбоцитов к коллагену. Морфологические исследования показали, что vWF присутствует на коллагене при адгезии тромбоцитов. Это указывает на непосредственное участие тромбоцитов во взаимодействиях между vWF и коллагеном IV типа. Вероятно, vWF должен сначала связаться с тромбоцитами, чтобы затем взаимодействовать с коллагеном. Связывание vWF с коллагеном VI также отличается от связывания с коллагенами I и III типов, так как в этом процессе не участвует домен A3. Предполагают, что сайт связывания находится в домене А1 (Denis et al., 1993). Это имеет важное значение, поскольку считают, что коллаген VI является связывающим сайтом vWF в субэндотелии.
Противосвертывающие эффекты и стабильность глипролинов
Коллаген применяют в медицине для лечения ран, ожогов, трофических язв, пульпитов, закрытия дефектов кожи, кости, твердой мозговой оболочки, роговицы, барабанной перепонки, печени, селезенки и в качестве шовного рассасывающего материала, так как он не имеет канцерогенных и токсических свойств (Chernousov et al., 2001; Delacoux et al., 2000; Vaughanhomas et al., 2001). На основе желатина и фибрина животного или человеческого происхождения созданы биологические клеи, широко используемые при хирургических вмешательствах и позволяющие быстро и надежно склеивать расслаивающиеся ткани и предотвращать кровотечения при наложении хирургических швов (Бокерия и др., 2002; Bingley et al., 2000). Капсулы желатины используются в качестве «контейнеров» для поставки лекарственных средств организм, поскольку такой способ поступления терапевтических белков и пептидов защищает их разрушения в кислотной среде желудка и способствует достижению лекарственными средствами кишечника, где они оказывают свое лекарственное действие или всасываются (Narayani, Rao, 1995).
В 80-е годы прошлого века были предприняты попытки использовать линейные синтетические пептиды, являющиеся фрагментами коллагена в качестве ингибиторов агрегации тромбоцитов (Karniguian et al., 1983).
Гусев с соавт. (1997) сообщают об эффективности препарата Семакс у больных острым ишемическим инсультом. В работе Черкасовой (2002) установлено, что применение Семакса при остром нарушении мозгового кровообращения на фоне базисной терапии без антикоагулянтов через 4,5 часа после введения существенно не влияет на показатели плазменного и тромбоцитарного гемостаза, хотя наблюдается тенденция к росту уровня антитромбина III и протеина С. Исследование действия Семакса на показатели гемостаза у больных дисциркуляционной энцефалопатией (ДЭ) I, II, III степени показало, что хроническое (10 дней) интраназальное введение препарата на фоне базисной терапии вызывает нормализацию антикоагулянтной активности, концентрации антитромбина III, уровня протеина С, фибринолитическои активности плазмы крови и снижает коллаген-индуцируемую агрегацию тромбоцитов (Черкасова и др., 2001).
Гепарин - один из самых сильных антикоагулянтов, применение которого в клинической медицине чрезвычайно широко (Бокарев, 2003; Duplada et al., 2001; Makarov et al., 2004; Sanderink et al., 2001). Гепарины применяют во всех случаях, когда требуется быстро снизить коагуляционныи потенциал крови. Они применяются для лечения венозных тромбозов и тромбоэмболизма (Dolovich et al., 2000). Гепарины назначают также для профилактики образования пристеночных тромбов во время оперативных вмешательств, при инфарктах миокарда, при остром коронарном синдроме и в других случаях (Eikelboom et al., 2000). В настоящее время гепарин вводят внутривенно (постоянно капельно или прерывисто) и подкожно.
Неудобства лечения гепарина заключаются в следующем. ВМГ активно связывается с плазменными, тромбоцитарными и матриксными белками, включая гистидин-богатый гликопротеин, тромбоцитарный фактор 4 (ТФ 4), витронектин, фибронектин, липопротеины и vWF (Hirsh, 1993). Эти белки конкурируют с АТШ за связывание с молекулами гепарина, уменьшая антикоагулянтный эффект, создавая плохую биодоступность небольших доз гепарина и обуславливая такое явление в медицинской практике, как гепариновая резистентность (Shriver et al., 2000; Young et al., 1992), которая может быть устранена увеличением дозы препарата.
Связывание гепарина с vWF объясняет его ингибирующее воздействие на адгезию и агрегацию тромбоцитов, что может быть причиной геморрагических осложнений при применении ВМГ (Merli et al., 2001; Ruggeri, 1999). Встречаются также и тромбоцитопении с развитием тромбоза примерно в 0,4% случаев (Пархоменко, Лутай, 2000; Greinacher, 1999; Visentin, 1999). Артериальные тромбозы после гепарин отерапии наблюдаются вследствие активации тромбоцитов, венозные же - как результат нейтрализации гепарина 4-м фактором тромбоцитов, выделяющимся в кровоток вследствие "реакции высвобождения" тромбоцитов (Samama et al., 1999). Длительное применение гепарина (более 4 месяцев) осложняется развитием остеопороза (Duplada et al., 2001; Hainer et al., 2002; Schulman, Hellgren-Wangdahl, 2002).
Известно, что НМГ слабее связываются с эндотелием, имеют намного меньшую аффинность к белкам и, соответственно, к коллагену сосудов, что обеспечивает лучшую биодоступность их небольших доз по сравнению с ВМГ (Makarov et al., 2004). В многоцентровых рандомизированных клинических исследованиях и на моделях животных было установлено, что НМГ являются эффективными и достаточно безопасными средствами для профилактики и лечения тромбозов (Бокарев, 2003; Sanderink et al., 2001; Hiebert et al., 2001). Такие преимущества НМГ, как большая биодоступность, больший период полужизни, более предсказуемый антикоагулянтный эффект при введении фиксированных доз позволяют вводить НМГ только один раз в день без проведения дальнейшего лабораторного мониторинга. Хотя НМГ тоже могут оказывать побочные эффекты, в экспериментах на моделях животных установлено, что НМГ вызывают меньшие кровотечения, чем гепарин при эквивалентном антитромботическом эффекте (Hiebert et al., 2001).
Поскольку известно, что ответственным за антикоагулянтное действие гепаринов является небольшая последовательность олигосахаридов (а наибольшей активностью подавления фактора Ха является специфический пентасахарид, который взаимодействует с молекулой антитромбина и специфически активирует его в отношении фактора Ха), в настоящее время предпринимаются попытки синтезировать и изучить такие пентасахариды. Клинические исследования (PENTATHLON, 2000; PENTAMAX, 2001; PENTHIFRA, 2001), которые заключались в сопоставлении эффектов петасахарида Fondaparinux (Arixtra) с эноксипарином показали, что пентасахарид не влияет на АЧТВ и протромбиновое время (Бокарев, 2003). Его эффект предсказуем дозой препарата, тромбоцитопений пока не отмечалось. При этом тромбозы глубоких вен возникали в меньшем числе случаев, а геморрагии в 1, 5-2 раза чаще, чем при применении нефракциониро ванно го гепарина (Turpie, 2001).
Противосвертывающие средства растительного происхождения
Исследование влияния биологически активных пептидов и их аналогов на систему гемостаза осуществляются уже в течение последних десятилетий. В литературе имеются сообщения о действии регуляторних пептидов на отдельные компоненты системы свертывания крови. Однако эти данные еще недостаточно систематизированы. В последнее время внимание исследователей было обращено на роль пролинсодержащих пептидов в различных физиологических процессах, в том числе и в процессах свертывания крови (Ашмарин и др., 1996; Ашмарин и др., 1998; Пасторова и др., 1999). В организме одним из источников глипролинов является коллаген, который под влиянием ряда ферментов (трипсина, химотрипсина, металлопротеиназ и др.) подвергается протеолизу с образованием полипептидов и простейших пептидов, содержащих пролин, глицин и оксипролин (Ашмарин и др., 1998; Ашмарин и др., 1999).
Как известно, молекулы коллагена участвуют в активации тромбоцитов и каскада свертывания крови. По данным ряда авторов, в молекуле коллагена присутствует Gly-Pro-Hyp последовательность, которая способна ингибировать агрегацию тромбоцитов (Farndale et al., 2004). Структурной особенностью коллагена является наличие в составе его молекулы гепаринсвязывающсй области, в которую включены PGP и PG последовательности (Delacoux et al., 2000; Vaughanhomas et al., 2001). Основной антикоагулянт крови — гепарин — может взаимодействовать с коллагеном через гепаринсвязывающую область и оказывать влияние на его структурно-функциональные свойства.
В настоящей работе было установлено, что исследуемые пептиды семейства глипролинов влияют на состояние свертывающей и противосвертывающей системы крови.
Как показали наши результаты, в условиях in vitro линейные и циклические глипролины замедляют свертывание крови, то есть обладают антикоагулянтной активностью, снижают активность фактора ХШа и АДФ-зависимую агрегацию тромбоцитов. Кроме того, в исследованных пептидах установлено наличие неферментативной фибринолитической активности.
Следует отметить, что отдельные аминокислоты Pro и Gly, входящие в состав глипролинов, не проявляли в данных условиях антикоагулянтно-фибринолитических эффектов и не вызывали изменения агрегации тромбоцитов.
По данным литературы (Левицкая и др., 1987), антикоагулянтная активность пептидов зависит от присутствия в них последовательности Gly-Pro-Arg, которая представляет собой аналог N-концевой области сс-цепи фибрина. Помимо этого, авторы установили, что пептиды, содержащие данную последовательность, влияют как на ферментативную стадию свертывания (переход фибриногена в фибрин под действием тромбина), так и на стадию полимеризации фибрина. Обращают на себя внимание факты, что цельные молекулы фибриногена и коллагена участвуют в свертывании крови, в то время как продукты их расщепления обладают противосвертывающими свойствами (Луговской, 2003; Farndale et al., 2004).
Таким образом, можно предположить, что для пептидов, содержащих последовательность Gly-Pro-Arg, и глипролинов, исследованных в нашей работе, имеет место сходный механизм действия, а именно: и те, и другие препятствуют действию тромбина за счет связывания с центральной областью молекулы фибриногена, а ингибирование процесса полимеризации можно объяснить взаимодействием пептидов с периферическими Д-доменами белка.
Как установлено в ранних работах, пептиды, содержащие пролин, ингибируют активность тромбина и проявляют антикоагулянтные свойства (Deadman et al., 1995; Neises et al, 1995/ В соответствии с этими данными, наблюдаемая нами антикоагулянтная активность глипролинов может быть обусловлена их антитромб и новым действием, хотя это не исключает их ингибирующего эффекта и на другие факторы свертывания.
В этом отношении весьма интересным является способность глипролинов снижать активность фактора ХШа (фибриназы) при добавлении к плазме крови. Уменьшение активности ХШа фактора может быть обусловлено как прямым ингибированием фибриназы, так и действием глипролинов на тромбин. Непосредственное взаимодействие пептидов с фактором ХШа может приводить к конформационным изменениям, которые вызывают блокирование активного центра фермента. Также известно, что тромбин активирует фибринстабилизирующий фактор (Noll et al., 1999), поэтому в случае инактивации тромбина, которое обусловлено действием пептида, наблюдается снижение активности фактора ХШа.
Как установлено в настоящей работе, глипролинам присуще неферментативное действие на нестабилизированный фактором ХШа фибрин. Механизм неферментативного фибринолиза идентичен механизму растворения нестабилизированного фибрина под действием мочевины. Известно, что мочевина ослабляет водородные связи и гидрофобные взаимодействия, которые наряду с ионными связями обеспечивают полимеризацию мономеров фибрина (Литвинов и др., 1981; Луговской и др., 1979). Ослабление этих связей приводит к деполимеризации фибрина и его переходу в мономерные формы. Можно предположить, что действие глипролинов в отношении нестабилизированного фибрина реализуется аналогичным образом.
При разных способах введения глипролинов в организм здоровых животных (внутривенное, интраназальное, пероральное, внутрибрю шинное) все исследованные пептиды оказывали влияние на антикоагулянтный и фибринолитический потенциал плазмы крови и на фазу первичного гемостаза. Они не только блокируют агрегацию тромбоцитов, но и подавляют стадии тромбино- и фибринообразования. Кроме этого, они влияли на заключительную стадию превращения фибриногена в фибрин, ингибируя активность фактора ХШа плазмы. Это согласуется с данными, полученными другими авторами (Ашмарин и др., 1998; Пасторова и др., 1999).
