Введение к работе
Актуальность темы
Глубокому исследованию проблемы влияния холодового анабиоза на биологические объекты посвящены десятилетия (Ре Л, 1962, Лозина-Лозинский Л К , 1972, Голдовский А М , 1986, Сведенцов Е П и соавт, 2006) Интерес к этой проблеме обусловлен тем, что в состоянии холодового анабиоза в живых системах обратимо подавляются или частично затормаживаются метаболические и физиологические процессы (Белоус А М, Грищенко В И , 1994), что способствует долгосрочному хранению клеточных суспензий в жизнеспособном состоянии и реализации их запасов на практике в связи с возникающими потребностями (Дунаева А А , 1983, Сведенцов Е П , 1999)
Характерной особенностью современной клинической трансфузиологии является все возрастающая потребность в компоненте крови - тромбоцитном концентрате (ТК) (Компанией А М , 1992, Rebulla Р , 1993, Аграненко В А и соавт, 1995, Мельникова ВН и соавт, 2003) ТК используется для профилактики и лечения угрожающей жизни тромбоцитопенической кровоточивости, обусловленной современными протоколами высокодозной химиотерапии больных с гематологическими и онкологическими заболеваниями, радиационным облучением, воздействием миелотоксических средств, повышенным разрушением тромбоцитов при экстракорпоральном кровообращении или повышенным потреблением кровяных пластинок при синдроме диссеминированного внутрисосудистого свертывания (Ковалева Л Г 1990, Абдулкадыров К М , 1994, 2004, Owens М et al, 1994, Petz L 1996, Wautier J L , 2002, Мельникова В H и соавт, 2003, Brand A et al, 2006)
Возрастающая потребность в ТК, особенно в экстренных случаях, требует создание их полноценных запасов Поэтому большую актуальность в последние годы приобрел вопрос долговременного хранения тромбоцитов, который еще далек от окончательного разрешения
По данным литературы (Kaplan С , 1993), известно, что в кровяном русле
тромбоциты обладают коротким периодом жизни (8-10,5 дней)
Существующие способы консервирования кровяных пластинок при положительных температурах позволяют сохранять клетки в биологически полноценном состоянии крайне непродолжительный срок - 3-5 суток (Компанией А М 1992, Holme S et al, 1994, Vucetic D et al, 2000, Meer P et al, 2005)
Наиболее перспективным для осуществления длительного хранения тромбоцитов является применение криоанабиоза (Захаров В В, 1996, Сведенцов Е П , 2004, Кузнецов К В , 2005)
Использование жидкоазотных технологий с введением тромбоцитов в глубокий криоанабиоз (-136С--196С), при котором останавливается внутриклеточный метаболизм и все фракции воды полностью замерзают, но сохраняются орбитальные переходы электронов в атомах молекул биообъекта (Цуцаева АА, 1983), ввиду высокой дороговизны не нашло широкого применения и востребовано лишь в некоторых крупных медицинских центрах (Кузнецов К В , 2006)
Совершенствование методов длительного хранения выделенных тромбоцитов при отрицательных температурах в функционально сохранном состоянии в значительной степени зависит от успехов в создании криозащитных сред и экономичного электрорефрижераторного оборудования, доступного для широкого круга учреждений физиологического, биологического и медицинского профиля Все это обуславливает необходимость поиска эффективного, вместе с тем простого и надежного метода введения тромбоцитов в криоанабиоз, обеспечивающего щадящие режимы замораживания, морфологическую сохранность, физиологическую полноценность кровяных пластинок под защитой хладоограждающего раствора, исключающего его отмывание после оттаивания Этим требованиям отвечает охлаждение ТК при умеренно-низкой температуре (-40С), при которой внеклеточная, свободная и частично связанная внутриклеточные фракции воды замерзают, а фиксированная фракция воды остается в незамерзшем состоянии, и метаболизм в клетках замедлен (Сведенцов Е П, 2004) Данный метод осуществляют в электрических морозильниках с применением нетоксичного криозащитного раствора, что может быть подтверждено физиологическими экспериментами на животных (определение веса тела, температуры тела, общего поведенческого состояния, явлений, отражающих общее физиологическое состояние животных) при переливании тромбоцитов, вышедших из криоанабиоза
Сведений об устойчивости тромбоцитов к повреждающим условиям криоанабиоза при -40С в научной литературе не обнаружено
Цель исследования - определить устойчивость к холодовому стресс-воздействию и физиологические особенности тромбоцитов, перенесших криоанабиоз при умеренно-низкой температуре (-40С), введение в который проводится по экспоненциальной программе под защитой нового хладоограждающего раствора, не требующего отмывания, исследовать влияние вышедших из криоанабиоза аутологичных тромбоцитов на организм экспериментальных животных
Задачи исследования:
1 Оценить в сравнительных исследованиях хладоограждающие свойства
4-х вариантов разработанного раствора, ингредиентами которого являются
гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина (ГМБТОЭМ), натрия фумарат и
кислота лимонная, и предназначенных для создания функциональной и
морфологической устойчивости тромбоцитов к холодовому стресс-
воздействию, для определения оптимального его варианта, сохраняющего
наибольшее количество функционально активных кровяных пластинок в
условиях криоанабиоза (-40С) в течение I суток Изучить сроки сохранности
хладоограждающих свойств оптимального варианта данного раствора
2 Определить устойчивость к холодовому стресс-воздействию и
физиологические свойства тромбоцитов, введенных в криоанабиоз по
экспоненциальной программе замораживания с применением оптимального
варианта хладоограждающего раствора и хранившихся при -40С в течение 1-
210 суток, особенно исследовать реакцию на гипотонический шок тромбоцитов
после выхода из криоанабиоза, которая определяет приживляемость тромбоцитов после их введения в сосудистое русло
3 Исследовать в экспериментах на животных «острую», «хроническую» токсичность и пирогенность оптимального варианта хладоограждающего раствора и определить влияние размороженных аутологичных тромбоцитов, хранившихся в состоянии криоанабиоза (-40С) с данным раствором в течение 24 часов, на организм экспериментальных животных (собак)
Научная новизна
В экспериментальном исследовании впервые изучена физиологическая активность (адгезия, агрегация, реакция на гипотонический шок) тромбоцитов, перенесших криоанабиоз при -40С, введение в который проводилось по экспоненциальной программе охлаждения и с использованием нового хладоограждающего раствора (патент №2230454 от 20 06 2004), включающего в конечной концентрации 5% ГМБТОЭМ, 0,95% натрия фумарата, 0,5% кислоты лимонной и бидистиллированную воду Впервые показано, что применение экспоненциальной программы и данного оригинального раствора позволяет предупредить криоповреждение их мембран и денатурацию внутриклеточных белков, приспособить кровяные пластинки к условиям криоанабиоза и сохранить на высоком уровне физиологические и морфологические свойства тромбоцитов, хранившихся 120 суток в условиях холодового стресс-воздействия при -40С -Полученные результаты расширяют представление о механизмах криозащиты на клеточном уровне
Установлено, что переливание аутологичных тромбоцитов, вышедших из криоанабиоза (-40С) с разработанным оптимальным вариантом хладоограждающего раствора, экспериментальные животные (собаки) переносят без возникновения каких-либо нарушений их исходного физиологического состояния не изменяется температура тела, поведение животных, отсутствуют явления, определяющие посттрансфузионные реакции и осложнения
Теоретическая и практическая значимость работы
Получены доказательства и дано научное обоснование криозащитных свойств разработанного хладоограждающего раствора для тромбоцитов Данный раствор, ингредиентами в который включены вещества только отечественного производства ГМБТОЭМ - криопротектор с экзо- и эндоцеллюлярным действием, натрия фумарат - антигипоксант биоэнергетической направленности, кислота лимонная - антикоагулянт, является нетоксичным, апирогенным, при внутривенном введении с тромбоцитами его хорошо переносят экспериментальные животные, что свидетельствует о сохранности функциональных свойств тромбоцитов, вышедших из криоанабиоза при -40С
Установлено, что по сравнению с линейной (принудительной) более предпочтительной и доступной является экспоненциальная (щадящая) программа замораживания тромбоцитов, при которой в отличие от линейной программы не наблюдается выброса кристаллизационного тепла и как
следствие не возникает рекристаллизации во вне- и внутриклеточной воде, отрицательно влияющей на биообъект при введении его в криоанабиоз
Полученные данные о сохранении физиологических свойств тромбоцитов крови человека, благоприятно перенесших холодовое стресс-воздействие при замораживании до -40С, свидетельствуют о том, что создан экономичный, доступный и эффективный метод (оптимальный вариант хладоограждающего раствора и экспоненциальная программа охлаждения) введения кровяных пластинок в криоанабиоз с целью их 120 суточного хранения в функционально полноценном состоянии
Это дало возможность прогнозировать теоретически и осуществлять практически хранение тромбоцитов в физиологически полноценном состоянии при охлаждении до -40С в течении 4-х месяцев с разработанным хладоограждающим раствором (вариант №3)
На основании положительных данных, полученных в экспериментальных
исследованиях по изучению «острой» и «хронической» токсичности,
пирогенности разработанного хладоограждающего раствора (вариант №3),
физиологической и морфологической полноценности кровяных пластинок,
замороженных с ним, их благоприятной переносимости опытными животными
дано заключение о возможности применения созданного метода
криоконсервирования тромбоцитов в научных лабораториях
криофизиологического, медицинского и биологического профиля
Основные положения, выносимые на зашиту:
Разработан хладоограждающий раствор (вариант №3) для введения в криоанабиоз тромбоцитов, содержащий ГМБТОЭМ, натрия фумарат, кислоту лимонную и бидистиллированную воду, который нетоксичен, апирогенен и не требует отмывания перед внутривенным введением размороженного тромбоцитного концентрата
Тромбоциты, введенные в криоанабиоз при -40С по экспоненциальной программе с предложенным хладоограждающим раствором (вариант №3), сохраняют на высоком уровне свои физиологические свойства после перенесенного холодового стресс-воздействия в течение 4 месяцев
3 Переливание ТК, замороженных с разработанным криозащитным
раствором, благоприятно переносят в эксперименте крупные животные
(собаки), что позволяет рекомендовать данный ограждающий раствор и
экспоненциальную программу охлаждения кровяных пластинок для
применения в научных лабораториях криофизиологического, медицинского и
биологического профиля
Апробация работы и публикации
Основные результаты и положения диссертационной работы доложены и обсуждены на научно-практической конференции, посвященной современным проблемам гематологии и трансфузиологии (Киров, 2002), областном научном обществе гематологов и трансфузиологов (Киров, 2002), научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной медицины Епифановские чтения» (Киров, 2003) Диссертация апробирована на заседаниях Проблемной комиссии и Ученого Совета Федерального государственного учреждения
«Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (Киров, 2003) и объединенном заседании Кировского отделения Физиологического общества им И П Павлова и областного научного общества гематологов и трансфузиологов (Киров, 2007)
Публикации материалов исследования
По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 1 в рецензируемом журнале Получен патент на изобретение № 2230454 (РФ) от 20 06 2004 г
Личное участие автора в получении результатов
Автором разработан новый хладоограждающий раствор, определена морфологическая и функциональная сохранность клеток до замораживания и после оттаивания, исследована «острая» токсичность на лабораторных мышах, «хроническая» токсичность на лабораторных мышах и кроликах, на собаках изучена переносимость трансфузий размороженных аутологичных тромбоцитных концентратов, перенесших криоанабиоз при -40С под защитой разработанного криозащитного раствора, проведен анализ и статистическая обработка полученных результатов
Диссертация выполнена в Федеральном государственном учреждении «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (директор д м н проф С Л Шарыгин), в лаборатории консервирования крови и тканей (рук д м н доцент А А Костяев)
Выражаю искреннюю благодарность научному руководителю, д м н профессору Е П Сведенцову за предоставление темы и помощь в подготовке диссертации, а также д м н доценту А А Костяеву, ученому секретарю института к м н доценту М Е Ковтуновой и заместителю директора по научной работе д м н профессору Г А Зайцевой, за содействие в выполнении диссертации
При выполнении работы в совместных исследованиях принимали участие
сотрудники лаборатории патоморфологии крови (рук к м н ст н с
Н С Федоровская, ст н с к м н [В М Новосадові), лаборатории
экспериментально-клинических исследований (рук к м н доцент Ю В Зиновьев, ветеринарные врачи - Л Е Рослякова, Р В Климова) ФГУ «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Росздрава» (директор д м н проф С Л Шарыгин), отделения контроля качества (заведующая Г А Гребенева), бактериологической лаборатории (заведующий А В Ветошкин) станции переливания крови ФГУ «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Росздрава» (главный врач В К Куноф), лаборатории криофизиологии (к б н , мне О О Зайцева), сотрудники отделения патогистологии Кировской областной клинической больницы (главный врач к м н В А Агалаков), сотрудник ГОУВПО КГМА заведующий кафедрой гистологии д м н, профессор В Б Зайцев, за что автор им признателен и глубоко благодарен
Объем и структура работы
Диссертация изложена на 128 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, главы с изложением результатов собственных исследований, главы, где обсуждаются результаты экспериментальных исследований, выводов, практических рекомендаций для научной работы и списка литературы, который включает 304 источника (128 отечественных и 176 зарубежных) В диссертации 24 таблицы, 7 рисунков
