Введение к работе
Актуальность проблемы. Как известно рептилии занимают ключевое положение в эволюции позвоночных. Их древние предки дали начало двум крупнейшим линиям современных высших позвоночных – птицам и млекопитающим, это находит отражение в тех кардинальных преобразованиях мозга рептилий, которые могут быть отнесены к разряду ароморфозов. Известные специалисты в области сравнительной нейрологии прошлого и настоящего Дж. Эллиот Смит, Дж. Джонстон, Н. Холмгрен, И.Н. Филимонов, У. Рисс, А.И. Карамян, М.Г. Белехова, Т.Н Соллертинская, Х.М. Сафаров и др. считали и считают, что правильная интерпретация мозга рептилий является ключом к пониманию хода эволюции мозга млекопитающих.
Уникальность рептилий как класса состоит в том, что две его дивергентные линии – зауропсидная (ящерообразные, sauropsida), представленная большинством современных рептилий, в том числе чешуйчатым (squamata), и терапсидная (зверообразные, therapsida), к которой относятся черепахи (chelopia), - имеют существенные различия в организации первичного мозга (Белехова, 1977; Ивазов, 1983; Карамян, 1970, 1976; Нуритдинов, 1992; Нуритдинов, Ивазов, 1992; Сафаров, 1983; Устоев, 1986, 2000, 2005, 2009, 2010 и др.).
Эволюционный подход к экологическим закономерностям, физиологические механизмы природных форм адаптации, лабильность функционирования ряда функциональных систем у позвоночных различной филогенетической группы и экологической специализации и участие различных нейропептидов в процессах приспособления их к среде обитания являются одним из важнейших и малоизученных направлений в современной нейробиологии. С этой точки зрения исследования физиологии гипобиоза, зимней и летней спячки - своеобразных и удивительных природных форм адаптации ряда позвоночных для переживания неблагоприятных условий окружающей среды представляется весьма актуальной задачей.
Одним из наиболее сильных регуляторов температуры тела является нейропептид дерморфин. Установлено, что инъекция этим пептидом теплокровным животным приводит к резкой гипотермии изменении парога активации всех терморегуляторных эффектов к более низкой температуре, снижает термоустойчивость организма, особенно зимосящих животных.
В настоящее время в литературе имеются данные, указывающие на то, что ряд пептидов, как: бомбезин, дерморфин и другие опиоиды являются регуляторами многих физиологических процессов зимоспящих животных (Игнатьева, Колаева с соавт., 1990; Крамарова, 1988; Ярыгин, Крамарова, Иваницкий, Колаева, 1986; Нуритдинов, 1992, 2000, 2004; Becman et al., 1981; Becman, Stanton, 1982; Margulies et al., 1979 и др.).
Однако, если механизмы высшей нервной деятельности у зимоспящих в литературе изучены достаточно, но данные относительно изучения этого вопроса в период эстивации летноспящих животных единичны и они не систематизированы. Хотя изучение роли опиоидных пептидов в регуляции высшей нервной функции, эстивации летнеспяших животных известны, но недостаточно изучено регулирующая роль опиоидного нейропептида дерморфина в эволюционном плане и данные по этому вопросу в литературе почти отсутствуют.
Исходя из вышеизложенного для нас было очень важным исследовать механизмы отсроченной реакции у рептилий в разных сезонах года и влиянием нейропептида.
Цель и задачи исследования: Целью настоящей работы явилось изучение поведенческих, нейрофизиологических и нейропептидных механизмов высшей нервной деятельности и эстивации у степной черепахи (Testudo horsfieldi) при различных физиологических состояниях.
В связи с выше изложенными исходя с этими перед нами были поставлены следующие задачи:
На модели пищевого поведения у черепах изучить физиологические особенности процессов высшей нервной деятельности и эстивации в норме.
Изучить роль гиппокампа на механизмах формирования отсроченных условных реакций в разных сезонах года.
Изучить нейрофизиологические и нейропептидные особенности механизмов эстивации и гипобиоза и его изменения после введения нейропептида дерморфина.
Научная новизна. Получены новые данные, свидетельствующие о том, что на низших этапах эволюции позвоночных (рептилий) впадение в состояние эстивации и изменение процессов ВНД наступает «с ходу»: в процесс нарушения ВНД включаются оба нервных процесса – возбудительный и тормозной. В период эстивации и гипобиоза сохраняется ранее накопленный объем биологически полезная информация. Реализация заторможенных на фоне эстивации и гипобиоза, условных отсроченных рефлексов после естественного пробуждения предварительно обученных черепах происходит значительно быстрее по сравнению с необученными. Получены также новые нейрофизиологические и нейрохимические данные о роли нейропептида дерморфина, выделенного из кожи пойкилотермного животного – южноафриканской лягушки Phylomedusa, в регуляции процессов ВНД и эстивации у представителя другого пойкилотермного животного – степной черепахи. Показано, что инъекция дерморфина приводит к уменьшению вегетативных показателей и кратковременному погружению в сноподобное состояние. Обнаружено, что зрительное представительство в гиппокампальной коре не связано со специфической функцией сенсорного анализа, но, очевидно, играет роль в сенсорном обеспечении лимбических функций. Исследование комплексных методических приемов позволило выяснить корреляцию между структурно-функциональной организацией гиппокампа черепах и его значение для условно-рефлекторной деятельности.
Научно-практическая значимость работы
Работа относится к разряду фундаментальных исследований. На основе эколого-физиологического анализа процессов ВНД у черепах сформулированы новые теоретические положения, имеющие значение для понимания эволюционных и экологических механизмов ВНД, эстивации и гипобиоза у этих животных. Полученные результаты раскрывают новые стороны механизмов природной адаптации организма и могут быть использованы для оценки функциональных возможностей организма в условиях высоких и низких температур окружающей среды. Результаты исследований по нейропептидному анализу высших нервных функций у черепах углубляют наши знания о механизмах, лежащих в основе нейрохимических механизмов памяти и обучения, а также сноподобных состояний. Они свидетельствуют о механизмах этих состояний в которых участвует опиоидная система: дерморфин возможно, является одним из важнейших индукторов летней и зимней спячки.
Анальгетическая способность может быть использована в кардиохирургии и нарколепсии. Существуют предпосылки применения искусственного гипобиоза для развития животноводства, медицины и космической биологии. За рубежом нейропептиды применяются с лечебной целью (Bristow, 1986) не только при функциональной, но и органической (язвенные заболевания). В России применение ряда пептидов в качестве лечебных средств внедряется в ряде клиник Санкт-Петербурга (ВМА) и Москвы (ВКНЦ).
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Эстивация – это сезонное оцепенение или состояние «глубокого сна», характерное для терапсидной линии рептилий – степной черепахи в ответ на черезмерное повышение температуры окружающей среды и бескормицы в летний сезон года. Границу между эстивацией и зимним гипобиозом провести трудно, ибо остается неясным, существуют ли между этими состояниями нейрофизиологическая и нейрохимическая непрерывность.
-
У черепах впадение в эстивацию наступает «с ходу» (в течение 2-3 суток). Нарушения возникают параллельно во всех исследуемых функциональных системах. Этот период по своим условно-рефлекторным критериям: наличию парадоксальных и ультрапарадоксальных отношений, растормаживанию дифференцировок напоминает картину невротических нарушений, имеющих место у этих животных при предъявлении им трудных условно-рефлекторных задач.
-
У черепах после естественного пробуждения из гипобиотического состояния отсроченные условные реакции вырабатываются и стабилизируются значительно быстрее по сравнению с таковыми у необученных черепах в этот период года. По-видимому это свидетельство, того, что в процессе эстивации и гипобиоза имеет место сохранение ранее полученной биологически полезной информации, извлечение которой после пробуждения животных из спячки происходит быстрее, чем выработка новых условных связей у интактных животных.
-
У предварительно гиппокампэктомированных степных черепах в период вхождения в эстивацию условно-рефлекторная деятельность нарушается полностью, о чем свидетельствуют наличие последовательного превентивного торможения процессов высшей нервной деятельности, функциональной дезинтеграции мозга, снижение температуры тела и угнетение функций вегетативных систем организма.
-
Подкожное введение нейропептида дерморфина (0.1 мг/кг) приводит к значительным поведенческим нарушениям, сопровождающимся изменением вегетативных и электрографических показателей, анальгезией, впадением в сноподобное состояние. На фоне введения дерморфина у черепах выявляется значительное ухудшение процессов высшей нервной деятельности. Дерморфин возможно является специфическим индуктором эстивации и гипобиоза и может быть рассмотрен как примитивный механизм протеинового синтеза, ранее использованного в эволюции.
Реализация результатов исследования. Существуют предпосылки применения искусственного гипобиоза в медицине, в клинической практике, животноводстве и космической биологии. Материалы диссертации будут использованы при чтении лекционных курсов по общей экологии, физиологии, биохимии человека и животных, а также спецкурсов: физиология и патология высшей нервной деятельности, нейробиология, экологическая физиология и нейрохимия в ВУЗах медико-биологического и экологического профиля.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на международной научно-теоретической конференции по экологии и охране окружающей среды (Ташкент, 2002г.), на съезде физиологов России (Екатеринбург, 2004г.),на ежегодном научном семинаре ТГМУ (2005-2012), на научном семинаре кафедры физиологии человека и животных Таджикского Национального Университета (Душанбе, 2005г.), на республиканской конференции посвященное 70 летию академика Х.М.Сафарова (2007г.), на кафедре физиологии человека и животных (2010г.) и на совместном расширенном заседании кафедры физиологии человека и животных Таджикского Национального Университета и кафедры биологии с основами генетики Таджикского государственного медицинского университета (2012г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК Минобрнауки Российской Федерации.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 108 страницах компьютерного набора и состоит из введения, литературного обзора, 5 глав, обсуждение результатов исследования, выводов и списка цитированной литературы, включающего 195 источника, из которых 82 на иностранном языке. Диссертация иллюстрирована 14 рисунками и 1 таблицей.
Опыты были проведены на 30 черепах обоего пола в хронических условиях в лаборатории кафедры физиологии человека и животных ТНУ по общепринятой методике разработанной А.Н.Карамяном, И.В. Малюковой (1986) и методике разработанной в нашей лаборатории Х.М. Сафаровым (1976) для рептилии, в фанерной камере размером 180х80см, сущность которой заключалось в том, что у черепах в условиях свободного поведения вырабатывались отсроченные условные реакции и пищедобывательная реакция к одной из трех кормушек, в которых находилась приманка. Для этой цели применялась таблица случайных чисел при разных соотношениях вероятности: 0.1–0.9; 0.2–0.8; 0.3–0.7; 0.4–0.6 и 0.5-0.5. Пища в кормушках давалась по разному в течение каждого опыта. При соотношении вероятностей 0.1–0.9 в одной кормушке давалось подкрепление в 10% случаев, а в других – 90%. Соответственно при других соотношениях вероятностей в одной кормушке давалось пищевое подкрепление в 20% случаев, а в других - 80% и т.д. У черепах отсроченные условные реакции изучались в период активной жизнедеятельности; в период вхождения в эстивацию; на фоне эстивации и гипобиоза, после естественного пробуждения животных из гипобиоза и у контрольной группы.
Гиппокампэктомию у черепах проводили под нембуталовым наркозом (40 мг/кг, в конечности). В стереотаксическом приборе Мещерского гиппокампальная кора разрушалась с двух сторон электролитически через стальные биполярные электроды с толщиной кончиков 100–200 мкм и расстоянием между ними до 0.5 мм. Электроды вводилось в две точки гиппокампа в каждом полушарии по собственным координатам (глубина около 1500 мкм). Электрокоагуляция производилось током 0.4 мА в течение 45 с. Двигательно-оборонительные условные реакции у черепах изучены в условиях частичной обездвиженности животных. Регистрация биоэлектрической активности осуществлялось на электроэнцефалографе «Орион» фирмы «Медикор» (Венгрия). Цифровые значения мощности обрабатывалось математически по методике используемой в лаборатории эволюции сна и бодрствования института эволюционной биохимии и физиологии им. И.М. Сеченова РАН. Температуру мозга у черепах измеряли согласно методике Т.В. Пискаревой (1987). Полученные результаты обрабатывались статистически, определялись средние арифметические. Достоверность результатов определялось по таблице Стьдента-Фишера.
Нейропептид дерморфин (ДМ) фирмы «Serva» с физиологическим раствором вводили черепахам из расчета 0.1 мг/кг непосредственно за 10 мин перед опытом. Животные были тестированы по следующим поведенческим показателям: двигательная активность, пищевое, зоосоциальное поведение, анальгезия. Болевая чувствительность и анальгетический эффект на ДМ изучался по методике «тейл-флек» в течение 120 минут.
