Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 9
2.1 . Анатомия звездчатого ганглия млекопитающих 9
2.2.Гистологические особенности симпатических узлов млекопитающих 10
2.3.Нейротрансмиттеры симпатических узлов у млекопитающих.. 15
2.4.Изменение состава нейротрансмиттеров в онтогенезе млекопитающих 18
2.5.Физиологическая роль нейропептидов 19
2.6.Особенности синаптической передачи в симпатических узлах млекопитающих 21
2.7.Структура и физиологическая роль мускариновых ацетилхолиновых рецепторов 22
2.8.Пуринергическая синаптическая передача 23
2.9.Синаптическая передача в симпатических ганглиях на ранних этапах постнатального развития 27
2.10.Фоновая активность симпатических нейронов 29
3. Материал и методика исследования 36
4. Морфологическая характеристика звездчатого ганглия у крысят разных возрастов 45
4.1. Особенности отхождения ветвей у животных разного возраста 45
4.2.Размеры и объем узла у животных разных возрастов 50
4.3.Морфометрические характеристики нейронов звездчатого ганглия в онтогенезе 51
4.4.Число нейронов звездчатого ганглия в процессе возрастного развития 55
4.5.Резюме 55
5. Возрастные особенности расположения нейронов ганглия, содержащих мускариновые и пуриновые рецепторы 57
5.1. Возрастные особенности нейронов, содержащих М1- холинорецепторы 57
5.2.Онтогенез нейронов, содержащих Р2Х2 — рецепторы 59
5.3.Морфометрическая характеристика нейронов, содержащих
Р2ХЗ-рецепторы 66
5.4.Возрастные особенности нейронов, содержащих Р2Х6-рецепторы 66
5.5.Резюме 72
6. Возрастные особенности нейротрансмиттерного состава нейронов звездчатого узла 73
6.1. Возрастные особенности нейронов, содержащих тирозингидроксилазу 73
6.2.Нейропептид Y-содержащие нейроны в постнатальном онтогенезе 76
6.3.Возрастное развитие холинацетилтрансферазо-позитивных нейронов 80
6.4. Нейроны, содержащие вазоинтестинальныи пептид в процессе возрастного развития 85
6.5.Возрастное развитие соматостатин-позитивных нейронов 87
6.6.Галанин-содержащие нейроны в постнатальном онтогенезе... 92
6.7.Солокализация неиропептидов в нейронах звездчатого узла в постнатальном онтогенезе 96
6.8.Средняя площадь сечения нейронов с различными иммуногистохимическими характеристиками в процессе возрастного развития 97
6.9.НАДФНД-позитивные структуры в звездчатом ганглии крысы в онтогенезе 98
6.10. Резюме 101 Фоновая активность симпатических нейронов 102
7.1 .Фоновая активность симпатических нейронов звездчатого узла новорожденных и 10-дневных крысят 102
7.2.Фоновая активность симпатических нейронов звездчатого узла 20-дневных животных 103
7.3.Характер ритмической активности нейронов у крыс старше
3 0 дней жизни 106
7.4.Резюме 108
Заключение 109
Выводы 119
Указатель литературы 121
Список сокращений
- Анатомия звездчатого ганглия млекопитающих
- Особенности отхождения ветвей у животных разного возраста
- Возрастные особенности нейронов, содержащих М1- холинорецепторы
- Возрастные особенности нейронов, содержащих тирозингидроксилазу
Введение к работе
Развитие современных методов исследования, включая иммуногистохимические, молекулярно-биологические и электрофизиологические, позволило существенно дополнить прежние данные о морфологических и функциональных характеристиках нейронов автономной нервной системы, что нашло свое отражение в ряде монографий (В.Н.Швалев с соавт., 1992; Hendry, Hill, 1992; А.Д.Ноздрачев, А.В.Янцев, 1995; McLachlan, 1995; А.Д.Ноздрачев, Е.И.Чумасов, 1999; А.Д.Ноздрачев, М.М.Фатеев, 2002; Л.В.Филиппова, А.Д.Ноздрачев, 2007).
Среди паравертебральных ганглиев особое место занимает звездчатый узел, который известен как центр иннервации органов грудной полости и шеи (Langley, 1891, 1893; Ю.М.Жаботинский, 1953; М.Г.Удельнов, 1961, 1975; В.И.Скок, 1970; Е.М.Крохина, 1973; А.Я.Хабарова, 1975; А.Д.Ноздрачев, 1978, 1983; В.Н.Швалев с соавт., 1992). Анатомии звездчатого узла и вариантам отхождения его ветвей посвящено много работ, выполненных в основном на собаках и кошках (Phillips et al., 1986; А.Д.Ноздрачев, М.М.Фатеев, 2002). В то же время, имеются очень скудные данные относительно морфологии этого узла у взрослых крыс (А.Д.Ноздрачев, Е.Л.Поляков, 2001).
Нейронная организация симпатических узлов сопровождается возрастной перестройкой, происходящей с увеличением размеров нейронов (Шевелева B.C., 1977), а также перестройкой медиаторного состава (В.Н.Швалев с соавт., 1992), межнейронных связей и контактов с органами-мишенями (П.М.Маслюков, 2000). Тем не менее, очень мало сведений о сроках окончания созревания нейроцитов, динамике изменения их морфометрических, иммуногистохимических и электрофизиологических характеристик. Достаточно исследованы иммуноцитохимические свойства нейронов симпатических ганглиев грызунов, в т.ч. белых крыс и мышей (А.Д. Ноздрачев, 1995, 1996, 2002; Klimaschewski et al., 1996). Функциональные характеристики нейронов симпатических узлов также достаточно подробно описаны в литературе (В.И. Скок, А.Я. Иванов, 1989; McLachlan, 2003; Jobling, Gibbins, 1999). В то же время данные о развитии нейротрансмиттерного состава звездчатого узла в литературе отсутствуют, а сведения о характере фоновой активности нейронов в онтогенезе являются противоречивыми (В.С.Шевелева, 1977; Haddad, Armour, 1991; Gootman et al., 1992;Sicaetal., 1994).
При исследовании синаптической передачи в симпатических узлах взрослых млекопитающих было установлено, что ацетилхолин активирует никотиновые и мускариновые рецепторы, тем самым, вызывая быстрый и медленный возбуждающий постсинаптический потенциал (Eccles, Libet, 1961; Kullmann, Horn, 2006). Также была доказана роль пуринорецепторов в синаптической передаче в симпатических узлах (Burnstock, 1985; Dunn et al., 2001). Лишь единичные работы посвящены изучению экспрессии мускариновых и пуринорецепторов в симпатических узлах в ходе постнатального развития (Guo-Hua et al., 2000; Ruan et al., 2004). Эти данные не дают полного представления о развитии мускариновой и пуринергической синаптической передачи в симпатических узлах млекопитающих в онтогенезе.
В связи с этим, целью данной работы явилось выявление анатомических особенностей звездчатого ганглия крысы, особенностей нейротрансмиттерного и рецепторного состава нейронов, характеристик фоновой активности нейронов узла у крыс в постнатальном онтогенезе.
Задачи исследования включали:
1. Установить анатомические особенности, варианты отхождения ветвей и морфометрические характеристики нейроцитов звездчатого ганглия у крыс в постнатальном онтогенезе.
2. Выявить гисто- и иммуногис'тохимические характеристики нейронов звездчатого ганглия крыс, содержащих различные нейротрансмиттеры, в процессе возрастного развития .
3. Определить иммуногистохимические характеристики нейронов звездчатого ганглия, содержащих мускариновые и пуринорецепторы, у крыс разного возраста.
4. Определить характер фоновой электрической активности нейронов звездчатого ганглия у крыс в онтогенезе.
Морфологические исследования звездчатого ганглия позволили установить основные типы отхождения ветвей от медиального края узла. У крысят разных возрастов выявлено три варианта отхождения ветвей. Наиболее часто встречается раздельное отхождение каудальной ветви подключичной петли и каудального сердечного нерва. Различий между правым и левым ганглиями не обнаружено. Эти результаты отличаются от данных, полученных на котятах разного возраста (П.М. Маслюков, 1997).
Морфометрический анализ нейроцитов показал, что в ходе онтогенеза возрастают средняя площадь сечения и максимальный диаметр. Доказано, что нет различий по особенностям распределения и морфометрическим характеристикам клеток с правой и левой стороны, между краниальной и каудальной частями звездчатого ганглия крысы в ходе постнатального развития.
Впервые установлено, что у всех исследованных животных подавляющее большинство нейронов (свыше 98%) являются иммунореактивными к М1-холинорецепторам, Р2Х2- и Р2Х6-пуринорецепторам с момента рождения, и в ходе возрастного развития процент таких нейронов не изменяется. В то же время, процент Р2ХЗ-иммунореактивных нейронов очень мал у животных всех возрастных групп.
Получены новые данные о том, что уже у новорожденных животных в звездчатом ганглии большая часть нейроцитов содержит одновременно тирозингидроксилазу и нейропептид Y. В дальнейшем, в ходе возрастного развития, процент таких нейронов увеличивается, в то время как доля соматостатин-иммунопозитивных нейронов резко снижается в первые 10 дней жизни.
Убедительно доказано отсутствие НАДФН-диафоразопозитивных нейронов в звездчатом ганглии крысят всех возрастов. В то же время обнаружены НАДФН-диафоразореактивные волокна с наибольшей интенсивностью окраски с 20 дня жизни животных.
Впервые установлено, что импульсная активность нейронов крысят ранних возрастных групп (новорожденных и 10-дневных) характеризовалась низкой частотой разрядов и наличием большого процента нейронов с апериодической активностью. В процессе возрастного развития происходит увеличение частоты импульсации и разнообразие паттерна активности.
Характер нейронной фоновой активности формируется в онтогенезе у крыс уже к 20 дню жизни. Окончательное формирование амплитудночастотных характеристик нейронной активности в звездчатом ганглии у крыс завершается к концу 1 месяца жизни.
Таким образом, в результате исследования получены новые данные, раскрывающие морфологические особенности как самого звездчатого ганглия, так и его нейронов, содержащих различные нейротрансмиттеры, пуриновые и мускариновые рецепторы в постнатальном онтогенезе. Это представляет интерес для понимания закономерностей иннервации внутренних органов грудной полости и шеи, а также механизмов регуляции эмбрионального и постнатального развития нервной системы, внутренних органов и тканей. Полученные морфологические характеристики ветвей и иммуногистохимические особенности нейронов звездчатого ганглия могут использоваться при проведении морфологического и физиологического эксперимента, в учебном процессе и, с учетом видовых особенностей, экстраполироваться на человека.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Анатомическая структура, рецепторный состав нейронов и набор нейротрансмиттеров в звездчатом ганглии крысы к моменту рождения являются сформированными.
2. Популяции нейронов звездчатого ганглия с различными иммуногистохимическими характеристиками развиваются гетерохронно.
3. В процессе возрастного развития параллельно увеличению размеров нейронов происходит изменение характера их фоновой активности
4. Устойчивое становление функциональных свойств нейронов звездчатого ганглия происходит к концу первого месяца жизни, морфологических характеристик - к концу второго месяца жизни.
2.0БЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Анатомия звездчатого ганглия млекопитающих
Шейно-грудной или звездчатый ганглий (ЗГ) относится к паравер-тебральным узлам и располагается в первом межреберье на длинной мышце шеи (И.Ф. Крупачев, 1934; В.Н. Самохвалова, 1958), позади подключичной артерии. У животных он образуется в результате слияния каудального шейного с первыми узлами грудной части пограничного симпатического ствола. По мнению одних авторов, ЗГ сформирован путем слияния каудального шейного с первым грудным (В.Н Самохвалова, 1958, ЕПеп-berger-Baum, 1943), а других - слиянием каудального шейного с тремя краниальными грудными (Ф.С. Гусев, 1958; А.Д. Ноздрачев, Е.Л. Поляков, 2001). Ветви ЗГ участвуют в образовании сердечного, подключичного, щитовидного, внутреннего грудного, позвоночного сплетений, по которым отростки нейронов достигают органов шеи и грудной полости (Abraham, 1951).
По данным Ленгли и др. авторов, через ЗГ осуществляются пиломо-торные, вазомоторные, секреторные и трофические симпатические эффекты в передней конечности, на шее и груди, а также ускорение ритма сердечных сокращений. Вместе с ускоряющими, от ЗГ идут к сердцу волокна, усиливающие сердечные сокращения (И.П.Павлов, 1883; Langley, 1891, 1899). Возбуждение ЗГ уменьшает асинхронность возбуждения и сокращения волокон миокарда, повышает скорость проведения возбуждения в миокарде (Priola, Randall, 1964) и ведет к расширению коронарных сосудов (Brown, 1968). ЗГ посылает к легким бронходилятаторные волокна (Daly, Mount, 1951), волокна к пищеводу (М.В.Сергиевский, 1964), к желудку (Jourdan, 1957), а также небольшое количество волокон в блуждающий нерв через подключичную петлю (Lanlgey, 1899). ЗГ является самым крупным узлом грудного отдела пограничного симпатического ствола. Его размеры у различных видов животных составляют: у морской свинки длина узла 6-10, ширина — 1.0 — 1.5 мм; у кошки длина - 4 — 6, ширина — 2.5 - 3.0 мм; у собаки длина — 20 — 25, ширина — 5 - 7 мм (Б. М.Эрез, 1957; А.Д. Ноздрачев, М.М. Фатеев, 2002); у человека длина узла составляет от 8 до 42, а ширина — от 10 до 20 мм (Т.В. Золотарева с соавт., 1979).
Форма узла различна у разных видов млекопитающих и даже у представителей одного вида она довольно сильно варьирует от типично звездчатой до сильно вытянутой в рострокаудальном направлении. Так, у человека выделено 6 форм звездчатого узла (Т.В Золотарева с соавт., 1979), отличающихся не только по внешнему виду, но и по числу ветвей, выходящих из ганглия. Форма ганглия зависит от полного или неполного слияния нижнего шейного и первого грудного симпатических узлов.
В настоящее время проведено довольно большое число исследований, касающихся клеточного состава паравертебральных ганглиев. Было обнаружено, что количество, размеры, форма и расположение нейронов в вегетативных узлах сильно варьирует.
Наибольшее количество нервных клеток ганглиев у млекопитающих имеют размер тела от 15 до 60 мкм (Ю.М.Жаботинский, 1953; В.П.Бабминдра, 1972). В краниальном шейном (КШГ) и ЗГ кошки наибольшее число нейронов имеет максимальный диаметр 20 - 40 мкм (В.П.Бабминдра с соавт., 1982; А.Д. Ноздрачев, М.М. Фатеев, 2002; П.М. Маслюков, 2003; Masliukov, 2001). В КШГ взрослой мыши средний диаметр тел нейронов составляет 34, в чревном — 32, в грудном симпатическом - 31 мкм (Jobling and Gibbins, 1999). В ЗГ макак размер тел нейронов варьирует от 10 до 50 мкм (Leong et al., 1989). У человека в соответствии с клеточным объемом различают большие клетки (с максимальным диаметром 36 — 60 мкм), средние (25 — 35 мкм) и малые (15 - 25 мкм) (Ю.М.Жаботинский, 1953).
Средняя площадь сечения нейронов КШГ, чревного и грудного симпатического узлов у мыши составляет 712,0+92,5, 602,5±120,7, 637,8+51,1 мкм" , соответственно (Jobling and Gibbins, 1999). Площадь сечения нейро-нов ЗГ у кошки равняется 634,2±3,64 мкм" (А.Д. Ноздрачев, М.М. Фатеев, 2002). Площадь поперечного сечения нейронов ЗГ крысы составляет 489 — 754 мкм2 (Richardson et al., 2006). Результаты исследований морфометри-ческих параметров нейроцитов свидетельствуют, что размеры нейронов в постнатальном онтогенезе увеличиваются. Так, площадь сечения нейронов чревного узла морской свинки на ранней фетальной стадии составляет 170 мкм" и достигает 2000 мкм" у взрослых животных (Anderson et al., 2001). Площадь сечения нейроцитов ЗГ у новорожденного котенка - 132,2+0,87 мкм" , у шестимесячного равняется 626,5+3,67 мкм (Masliukov, 2001). Колебания размеров тела нейрона встречаются среди нервных клеток одного и того же ганглия при сравнении различных ганглиев, а также наблюдается группирование более крупных нейроцитов среди равномерно распределенных мелких (Н.Г.Колосов, 1968; В.И. Скок с соавт., 1989; Gabella, 1976).
Нейроны симпатических узлов млекопитающих имеют округлую, овальную, грушевидную или полигональную форму тел и в основном являются мультиполярными (А.С. Догель, 1896; Н.Г. Колосов с соавт., 1978; Б.И. Швалев с соавт., 1992; Jobling and Gibbins et al., 1999; Anderson et al., 2001). Количество отростков может колебаться от 3 до 20 и, например, для КШГ крысы, их число равно в среднем 13 (McLachlan, 1974), у мыши - от 1 до 5 (Jobling and Gibbins et al., 1999). Уни - и биполярные клетки встречаются сравнительно редко. Мультиполярные клетки обычно одинакового вида, однако в звездчатом узле человека встречаются нейроны с чрезвычайно длинным дендритом (A braham, 1951). Согласно данным, приведенным в обзоре Габеллы (Gabella, 1976), у крысы КШГ содержит в среднем 42 000 нейронов, у кошки - около 100 000 нейронов, у человека — 911 000 нейронов. Таким образом, с увеличением размеров тела количество нейронов в ганглии возрастает. Увеличивается и средний диаметр тела нейронов (с 15,5 мкм у крысы до 35 мкм у быка), а также количество и длина их ден-дритов. Нейроны симпатических ганглиев новорожденных значительно меньше по размеру, чем у взрослых животных, и имеют несколько коротких и маловетвящихся отростков (B.C. Шевелева, 1977; Hirst, McLachlan, 1986). Имеются данные об изменении числа нейронов в паравертебраль-ных узлах в раннем постнатальном онтогенезе. У крыс в КШГ и шейно-грудном узле число нейронов значительно уменьшается в течение первой постнатальной недели с 39500 до 26000 и не изменяется до 2 месяца жизни (Wright et al., 1983). В ЗГ кошки количество нервных клеток также уменьшается в первые 10 дней жизни с 2,11х105 до 1,86х105 (Masliukov, 2001).
В структуре ЗГ основными элементами являются его волокна и нервные клетки. Снаружи ганглий покрыт соединительнотканной капсулой, от которой внутрь отходят перегородки, разделяющие клетки на отдельные группы. Между скоплениями нейронов проходят нервные волокна (Н.Г. Колосов, А.Я. Хабарова, 1978).
Все нейроны ЗГ окружены клетками-сателлитами или швановскими клетками. По ультраструктурной организации и набору цитоплазматиче-ских органелл нейроциты симпатических ганглиев существенно не отличаются от нейронов центральной нервной системы (В.П.Бабминдра, 1972; В.Н. Швалев с соавт., 1992).
Особенности отхождения ветвей у животных разного возраста
Шейно-грудной узел всех исследованных животных имел звездчатую форму (Рис. 1, 2). У новорожденных и более взрослых крысят от латерального края отходят две соединительные ветви к двум первым грудным спинномозговым нервам. От краниального полюса начинается позвоночный нерв, связанный с шейными спинномозговыми нервами. От каудального полюса отходит межганглионарная ветвь симпатического ствола. У крысят разного возраста нами обнаружено три варианта отхождения ветвей от медиального края ганглия (рис. 3):
1. От медиального края звездчатого ганглия раздельно отходят краниальная ветвь подключичной петли, каудальная ветвь подключичной петли и каудальный сердечный нерв.
2. Помимо краниальной подключичной петли раздельно отходят общий ствол, впоследствии разделяющийся на каудальную ветвь подключичной петли и каудальный сердечный нерв, а также добавочный каудальный сердечный нерв.
3. Медиальный край отдает две краниальные, каудальную ветви подключичной петли, каудальный сердечный нерв и добавочный каудальный сердечный нерв.
Во всех возрастных группах, кроме новорожденных животных, наблюдалось несколько случаев отхождения анастомозирующих ветвей от краниальной или каудальной ветвей подключичной петли к среднему шейному ганглию.
Каудальные сердечные нервы представлены в виде более тонких ветвей, спускающихся к корню легкого и сердцу.
Между правым и левым узлами различий в характере отхождения ветвей не наблюдалось. У новорожденных крысят в 50 % случаев от медиального края звездчатого узла раздельно отходят краниальная ветвь подключичной петли, каудальная ветвь подключичной петли, каудальныи сердечный нерв. В оставшихся 50% отходят краниальная ветвь подключичной петли, общий ствол и добавочный каудальныи сердечный нерв.
У 10-дневных животных в половине случаев (50%) от ганглия раздельно начинаются краниальная и каудальная ветви подключичной петли, каудальныи сердечный нерв. Для 40% крысят характерно наличие краниальной ветви подключичной петли, общего ствола и добавочного каудального сердечного нерва. В 10% наблюдались две краниальные, каудальная ветвь подключичной петли, каудальныи сердечный нерв и добавочный каудальныи сердечный нерв (вариант № 3).
У 20-дневного крысенка встречались те же варианты отхождения ветвей с теми же процентами, что и у новорожденного животного: В 50 % случаев от медиального края звездчатого узла раздельно отходят краниальная ветвь подключичной петли, каудальная ветвь подключичной петли, каудальныи сердечный нерв. В оставшихся 50% отходят краниальная ветвь подключичной петли, общий ствол и добавочный каудальныи сердечный нерв.
У одномесячных животных присутствуют те же два варианта отхождения ветвей: 1. В виде отдельных ветвей от медиального полюса ганглия отходят краниальная ветвь подключичной петли, каудальная ветвь подключичной петли, каудальныи сердечный нерв, что встречается у 75% крысят. 2. У 25% от узла отходят краниальная ветвь подключичной петли, общий ствол и добавочный каудальныи сердечный нерв. Для двухмесячных крысят характерно три варианта: 1. В 62,5% случаев от ганглия начинаются краниальная ветвь подключичной петли, каудальная ветвь подключичной петли, каудальныи сердечный нерв. 2. У 25% животных от узла отходят краниальная ветвь подключичной петли, общий ствол и добавочный каудальныи сердечный нерв. 3. От медиального края в виде отдельных ветвей начинаются две краниальные ветви подключичной петли, каудальная ветвь подключичной петли, каудальныи сердечный нерв и добавочный каудальныи сердечный нерв. Такое расположение нервов отмечалось у 12,5% крысят.
У шестимесячных животных в 50% от узла раздельно отходят следующие ветви: краниальная ветвь подключичной петли, каудальная ветвь подключичной петли, каудальныи сердечный нерв. У 40% крысят встречались краниальная ветвь подключичной петли, общий ствол и добавочный каудальныи сердечный нерв. В 10% наблюдений встречаются две краниальные ветви подключичной петли, каудальная ветвь подключичной петли, каудальныи сердечный нерв и добавочный каудальныи сердечный нерв.
В постнатальном онтогенезе размеры ганглия возрастают на протяжении первых двух месяцев (рис. 2, табл. 4). Длина узла в ходе возрастного развития увеличивается менее, чем в два раза, ширина — в полтора раза, толщина — в три раза.
Возрастные особенности нейронов, содержащих М1- холинорецепторы
Процент Ml-иммунореактивных нейронов в звездчатом узле крыс с возрастом практически не менялся и составлял почти 100% (табл. 4). Средние значения площади сечения нейроцитов постепенно увеличивались от момента рождения к шести месяцам (рис. 7). Причем, значения данного параметра у шестимесячных крыс примерно в три раза больше по сравнению с новорожденными животными.
Более 70% Ml-позитивных нейронов звездчатого ганглия новорожденных крысят имели очень мелкие размеры (0-200 мкм2), оставшуюся часть представляли мелкие (201-400 мкм") и около 1% - средние клетки (401-600 мкм"). К 10 дню жизни процент очень мелких клеток уменьшался в 3,5 раза по сравнению с новорожденными и у более взрослых крыс составлял от 1-10% (рис. 8, 9). У 10-, 20-дневных и одномесячных животных преобладали нейроциты с площадью сечения 201-400 мкм2, одновременно происходило увеличение процентного содержания популяций средних и крупных клеток (601-800 мкм"). У двухмесячных крысят площадь сечения большинства нейронов находилась в пределах от 401 до 600 мкм2 (41%), а у шестимесячных - от 401 до 600 (35%) и от 601 до 800 (38%) мкм2. Клетки очень крупных размеров (более 1201 мкм2) наблюдались только у шестимесячных животных.
Подавляющее большинство нейронов, иммунореактивных к Р2Х2-рецептору, у новорожденных крысят составляли клетки с площадью сечения от 0 до 200 мкм", 25% - мелкие и менее 1 % - средние по размеру нейроциты (рис. 10). Процент очень мелких клеток быстро снижался в первые 10 дней жизни до 22%, к 20 дню - до 10%, а у более взрослых животных составлял не более 1% (рис. 11, 12). У 10- , 20 - дневных, одномесячных крыс преобладала популяция мелких нейронов. Начиная с 10-дневного возраста, процент средних и крупных нейроцитов увеличивается. Максимальных значений процентное содержание средних по размеру клеток достигало к двухмесячному (40%), а крупных - к шестимесячному возрасту (39%). У шестимесячных крыс обнаруживались единичные клетки с площадью сечения более 1201 мкм".
При иммуногистохимическом исследовании нейронов ЗГ крыс разных возрастов нами выявлены единичные нервные клетки, содержащие Р2ХЗ-рецепторы, количество которых очень мало у новорожденных и 10 - дневных животных (3±1) (рис. 13). Затем количество Р2ХЗ-иммунореактивных нейронов увеличивалось и достигало максимума к 20-дневному возрасту (12±5), после чего снижалось до 4+Л у 30-дневных животных крысят и далее не менялось. Число Р2ХЗ-иммунореактивных клеток в ЗГ двухмесячных крысят равнялось 4±2, у шестимесячных - 3±1. Различия между 20-дневными животными и остальными возрастными группами являются статистически достоверными (р 0,05). С возрастом значительно увеличивается площадь сечения нейронов. У новорожденного крысенка этот показатель равнялся 90+25,3 мкм2, у 10-суточного - 149+33,4, у 20-суточного - 196+36,8, у одномесячного - 245±26,3, у двухмесячного - 298±44,5, у шестимесячного -367+37,9 мкм". Площадь сечения Р2ХЗ-иммунореактивных клеток была достоверно меньше по сравнению с нейронами, содержащими М1-, Р2Х2- и Р2Х6 - рецепторы (р 0,01). Значения данного параметра нервных клеток у новорожденных крыс примерно в 3,5 раза меньше по сравнению с шестимесячными животными.
У всех исследованных животных процент Р2Х6 — иммунореактивных нейронов с момента рождения приближался к 100% и с возрастом практически не менялся (рис. 14). Наименьший процент выявлен у 10 — дневных животных (табл. 6). Средние значения площади поперечного сечения нейроцитов постепенно возрастали с момента рождения к шестимесячному возрасту животных. Процентное содержание различных по размеру групп нейронов, содержащих Р2Х6 - рецепторы, в ходе онтогенеза претерпевало изменения, сходные с колебаниями площадей сечения нейроцитов, иммунореактивных к Ml - холинорецептору (рис. 15, 16).
А -одномесячного, Б - двухмесячного, В - шестимесячного крысенка. Принимая во внимание проценты нейронов, содержащих М1-холинорецепторы, Р2Х2- и Р2Х6-пуринорецепторы и значения средней площади сечения этих нейронов, можно предположить, что эти рецепторы солокализованы в нейронах ЗГ на всех этапах постнатального развития.
Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что большинство нейронов ЗГ к моменту рождения содержит одновременно М1-холинорецепторы, Р2Х2- и Р2Х6-пуринорецепторы. Процент Р2ХЗ-иммунореактивных нейронов очень мал у животных всех возрастных групп. Наибольшее число нейронов, содержащих Р2ХЗ рецепторы, наблюдается в 20-дневном возрасте.
Размеры клеток увеличиваются в ходе возрастного развития. Среднее значение площади сечения увеличивалось в процессе возрастного развития. Так как не обнаружено статистически достоверных различий между средними значениями вышеуказанного параметра у нейронов, содержащих Ml-холинорецепторы, Р2Х2- и Р2Х6-пуринорецепторы, значит, они солокализованы. Площадь сечения Р2ХЗ-иммунореактивных клеток была достоверно меньше по сравнению с нейронами, содержащими М1-, Р2Х2- и Р2Х6- рецепторы.
Возрастные особенности нейронов, содержащих тирозингидроксилазу
Процентное содержание тирозингидроксилазо-позитивных нейронов в раннем постнатальном онтогенезе практически не менялось и составляло 88±5,1% у новорожденных, 83±4,7% у 10-дневных, 90±3,8% у 20-дневных, 86±4,4% у 30-дневных и 91±5,6% у двухмесячных животных.
Около 80% тирозингидроксилазо-положительных нейроцитов у новорожденных крысят имели очень мелкие размеры (0-200 мкм"). У 10-дневных животных процент данной популяции клеток уменьшался в 4 раза и начинали преобладать мелкие нейроциты (201-400 мкм") вплоть до одномесячного возраста (рис. 17, 18). У двухмесячных крысят площадь сечения большинства нейронов находилась в пределах от 401 до 600 мкм2, а у шестимесячных — от 601 до 800 мкм".
У новорожденного крысенка значительная часть нейронов вместе с тирозингидроксилазой содержала нейропептид Y (HITY). В ходе возрастного развития доля НПУ-содержащих нейроцитов постепенно увеличивалась и достигала 55% к двухмесячному возрасту животных (рис. 19,20).
Около 90% нейропептид Y-позитивных нейронов новорожденных крысят имели площадь сечения до 200 мкм . У 10-, 20-дневных и одномесячных животных преобладала популяция нейроцитов с площадью сечения 201-400 мкм , а также наблюдалось увеличение процента средних по размеру клеток (рис. 21, 22). У двухмесячных крысят площади сечения большинства нейронов находились в пределах 401-600 мкм2, а у шестимесячных - 601-800 мкм . Начиная с двухмесячного возраста обнаруживались клетки размером свыше 1001 мкм ; с шестимесячного -свыше 1201 мкм2. Процент очень мелких НПУ-содержащих нейроцитов отсутствовал или составлял менее 1% у одномесячных о более взрослых животных.
Более 80% ХАТ-позитивных нейроцитов у новорожденных крысят также являлись тирозингидроксилазо-положительными. Однако, доля нейронов, иммунореактивных к ХАТ и ТГ быстро снижалась до 38% в первые 10 дней жизни и далее достигала минимальных значений у двухмесячных крысят (рис. 25). 70% ХАТ-позитивных нейронов новорожденных крысят имели площадь сечения от 201 до 400 мкм" и небольшой процент составляли очень мелкие и средние клетки. У 10-дневных животных наблюдалась схожая картина распределения нейроцитов по размерам, но появляются нейроны с площадью сечения от 601 до 800 мкм" (рис. 26, 27). У 20-дневных и двухмесячных крысят преобладали средние по размеру клетки (401-600 мкм ), а у одномесячных и шестимесячных - крупные (601-800 мкм ). Очень мелкие ХАТ-позитивные нейроциты отсутствовали у крысят, начиная с одномесячного возраста.
Подавляющее большинство холинергических нейронов у животных всех возрастных групп содержало вазоинтестинальный пептид (ВИЛ). Наибольший процент ВИП-позитивных нейроцитов наблюдался у 10-дневных крысят и затем постепенно снижался к двухмесячному возрасту (рис. 28).
Процентное содержание различных по размеру групп нейронов, содержащих ВИЛ, претерпевало в ходе онтогенеза изменения, сходные с колебаниями площадей сечения нейроцитов, иммунореактивных к холинацетилтрансферазе (рис. 31, 32).
Почти 100% нейронов, иммунопозитивных к соматостатину, у новорожденных крысят составляли очень мелкие клетки, оставшуюся часть представляли мелкие клетки. Процент последних возрастал до 40% к 10 дню жизни и в ходе онтогенеза существенно не менялся (рис. 36, 37). У 10-дневных крысят обнаруживались единичные нейроны с площадью сечения 401-600 и 601-800 мкм", процент которых с возрастом увеличивался и у шестимесячных животных популяция средних по размеру клеток начинала преобладать. Процентное содержание очень мелких нейроцитов оставалось достаточно высоким во всех возрастных группах, существенно понижаясь лишь к шестимесячному возрасту. Клетки с площадью сечения свыше 1001 мкм" обнаруживались у двух- и шестимесячных крысят.
В ходе постнатального развития средний размер нейроцитов (площадь сечения), содержащих ТГ, ХАТ и различные нейропептиды, последовательно возрастает (рис. 41). При анализе морфометрических характеристик нейронов также было выявлено, что данные нейроны имеют разные размеры. СОМ- и ГАЛ-положительные нейроны у всех крысят были представлены мелкими клетками, НПУ- и ТГ-позитивные -средними, а содержащие ВИП и ХАТ - крупными. У одномесячных животных средние размеры НПУ-иммунопозитивных нейроцитов начинают преобладать над средними размерами ТГ-положительных клеток. По своим размерам нейроны, содержащие тирозингидроксилазу и нейропептид Y, более мелкие по сравнению с клетками, имеющими только тирозингидроксилазу с момента рождения и до 30 дня жизни.
У новорожденных основная масса нервных клеток содержит ферменты синтеза норадреналина и имеется небольшая популяция клеток, не содержащая катехоламинов. Часть же норадренергических нейронов содержит и другие нейротрансмиттеры. Фермент синтеза ацетилхолина присутствует в нейронах звездчатого узла новорожденных животных.
Развитие нейротрансмиттерных характеристик нейронов звездчатого узла происходит гетерохронно. Процент ВИП-положительных клеток и нейронов, содержащих холинацетилтрансферазу, возрастает до 10 дня жизни, а затем снижается. С момента рождения и на протяжении всех исследуемых возрастных периодов увеличивается процент клеток, содержащих тирозингидроксилазу и нейропептид Y. Вместе с этим, уменьшается доля соматостатин-позитивных нейронов. Окончательно нейротрансмиттерный состав стабилизируется к концу второго месяца жизни. НАДФНД-позитивные нейроны отсутствовали во всех исследованных возрастах.
С возрастом животных увеличивается доля средних, крупных и очень крупных нейронов, содержащих ТГ, ХАТ и различные нейропептиды, и уменьшается процент мелких и очень мелких. Также установлено, что данные нейроциты имеют разные размеры. Соматостатин- и галанин-положительные нейроны представлены мелкими клетками, а содержащие холинацетилтрансферазу - крупными.
