Введение к работе
Актуальность исследования. Широкое развитие промышленности, продиктованное потребностями современного общества, обусловливает высокую степень загрязнения окружающей среды многими поллютантами, в частности тяжелыми металлами. Одним из наиболее известных, и в то же время, опасных загрязнителей является свинец. В индустриальном отношении он является необходимым элементом, однако, избыточное его поступление в организм человека вызывает множество отрицательных эффектов (Loghman-Adham M., 1997, Patrick L., 2006). Многочисленные публикации в отечественной литературе, а также подготовленный большой группой специалистов «Доклад о свинцовом загрязнении окружающей среды Российской Федерации и его влиянии на здоровье населения» дают возможность ориентировочно оценить, насколько реальна угроза повышенного содержания свинца в биосфере для населения России, каковы действительные размеры свинцового загрязнения в стране и его основные источники (Снакин В.В., 1999). Особенно актуальна проблема свинцового загрязнения атмосферы и объектов окружающей среды в нашем регионе, поскольку г.Владикавказ отнесен к списку городов с крупными промышленными источниками эмиссии свинца, наряду с такими городами, как Белово, Гусь-Хрустальный, Екатеринбург и др. Именно поэтому необходимым является поиск эффективных средств профилактики и лечения свинцовых отравлений. Однако разработка профилактических и лечебных мероприятий невозможна без тщательного изучения патогенетических звеньев развития интоксикации металлом.
К настоящему времени выяснены основные механизмы токсического действия свинца: угнетающее влияние на митохондриальное дыхание, усиление перекисного окисления липидов, нарушение кальциевого гомеостазиса клетки (Аксенова М.Е., 2000, H. Choudhury, A. Mudipalli, 2008). Являясь конкурентным биометаллом по отношению к кальцию, свинец способен вытеснять его из специфических мест связывания с лигандами, а также нарушать его пассивный транспорт (Peraza M.A. и соавт., 1998). Показано, что при истощении запасов кальция отмечается активация трансмембранного переноса свинца (Стародумов В.Л., 2003). Повышенное же содержание кальция в потребляемой пище в условиях свинцовой интоксикации оказывает некоторое протекторное действие (Суханов Б.П. и соавт., 1990).
Целью настоящего исследования было изучение влияния экспериментальной гипо- и гиперкальциемии на нефротоксичность ацетата свинца и накопление его в костной ткани.
Задачи исследования. Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
-
В контрольных опытах изучить влияние экспериментальной гипо- и гиперкальциемии на водовыделительную функцию почек, баланс катионов в крови и их почечную обработку, осмолярность мочи и уровень протеинурии в условиях спонтанного диуреза у крыс линии Вистар.
-
Изучить влияние экспериментальной гипокальциемии на основные процессы мочеобразования, почечную обработку электролитов и их баланс в крови, осмолярность мочи и уровень протеинурии в условиях спонтанного диуреза у крыс линии Вистар с хронической свинцовой интоксикацией.
-
Изучить влияние экспериментальной гиперкальциемии на основные процессы мочеобразования, почечную обработку электролитов и их баланс в крови, осмолярность мочи и уровень протеинурии в условиях спонтанного диуреза у крыс линии Вистар с хронической свинцовой интоксикацией.
-
Исследовать влияние экспериментальной гипо- и гиперкальциемии, свинцовой интоксикации, а также их сочетания на содержание кальция и свинца в костях крыс линии Вистар.
-
Провести гистологические исследования почек крыс линии Вистар с хронической свинцовой интоксикацией, в условиях экспериментальной гипо- и гиперкальциемии.
Научная новизна. Выявлено, что экспериментальная гипокальциемия в целом усиливает повреждающее действие ксенобиотика. Это проявляется большим поражающим эффектом на почки и усиленным накоплением свинца в костях. Такие изменения отмечаются в группе с внутрижелудочным введением метала на фоне инъекций кальцитонина и у паратиреоидэктомированных крыс с подкожным введением металла. В случае же интрагастрального поступления ацетата свинца в условиях экспериментального гипопаратиреоза имеет место некоторое уменьшение его нефротоксичности и кумуляции в костной ткани. Это, по-видимому, обусловлено сниженным всасыванием металла в желудочно-кишечном тракте паратиреоидэктомированных крыс, обладающих низкой активностью кальциевых транспортных систем. Впервые показано, что экспериментальная гиперкальциемия при подкожном поступлении ацетата свинца снижает выраженность почечных проявлений интоксикации ксенобиотиком и уменьшает накопление его в костях. Интрагастральное введение металла сопровождается, вероятно, усиленным всасыванием его в желудочно-кишечном тракте в условиях гипервитаминоза D. Как следствие – нарастают функциональные и морфологические изменения в почках, увеличивается кумуляция свинца в костном матриксе. Новизна работы подтверждена получением справки о приоритете по заявке на изобретение № 2010149748 (071909) и положительного решения по заявке № 2010149546 (071624).
Научно-практическая значимость работы. Исследование носит экспериментальный характер и полученные результаты, наглядно демонстрирующие почечные проявления хронической свинцовой интоксикации, а также ее влияние на содержание кальция и свинца в костной ткани, относятся к области фундаментальных знаний, так как расширяют представления о механизмах действия избытка свинца в организме. Выявленные эффекты гипо- и гиперкальциемии демонстрируют особенности регуляторных влияний на обмен кальция, электролито-водовыделительную функцию почек и токсические эффекты избытка свинца. Материалы исследования могут быть использованы при разработке способа профилактики и терапии хронической интоксикации металлом.
Полученные данные могут использоваться при преподавании физиологических основ детоксикации, при исследовании механизмов действия свинца на другие органы и системы организма, при разработке способов профилактики и лечения токсических эффектов избыточного поступления в организм других металлов.
Материалы диссертации внедрены в учебный процесс и научные исследования на кафедрах нормальной физиологии, патологической физиологии и курсе профпатологии ГБОУ ВПО СОГМА Министерства здравоохранения и социального развития РФ.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Экспериментальная гипокальциемия усиливает нефротоксичность ацетата свинца при внутрижелудочном введении металла на фоне инъекций кальцитонина и при подкожном введении металла паратиреоидэктомированным животным.
2. Экспериментальный гипопаратиреоз уменьшает степень выраженности свинцовой нефропатии, видимо, за счет снижения всасывания ацетата свинца из желудочно-кишечного тракта при интрагастральном поступлении металла и.
3. Экспериментальная гиперкальциемия и гипервитаминоз D оказывают протекторное действие при развитии почечных проявлений свинцовой интоксикации, вызванной подкожными инъекциями металла.
4. Экспериментальный гипервитаминоз D увеличивает степень выраженности свинцовой нефропатии, видимо, усиливая всасывание ацетата свинца из желудочно-кишечного тракта при интрагастральном поступлении металла.
Личный вклад автора: Автором самостоятельно выполнена экспериментальная часть работы, математическая и статистическая обработка данных, проведен анализ и обобщение полученных результатов.
Публикации и апробация диссертационной работы. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 4 – в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования России.
Основные положения работы доложены и обсуждались на I региональной междисциплинарной конференции молодых ученых «Наука– Обществу» (Владикавказ, 2010г.); VII международной научной конференции «Устойчивое развитие горных территорий в условиях глобальных изменений» (Владикавказ, 2004г.); II международной научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» (Владикавказ, 2011г.), на IX и X научных конференциях молодых ученых СОГМА и ИБМИ ВНЦ РАН (Владикавказ 2010,2011 гг.).
Структура диссертации. Диссертация изложена на 190 страницах, иллюстрирована – 70 рисунками и 66 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав, содержащих результаты собственных исследований, заключения, общих выводов, списка использованной литературы и приложения. Библиографический указатель включает 232 источника из них 156 зарубежных авторов.
Материал и методы. Работа проведена на 245 крысах-самцах линии Wistar, массой 200-300 грамм. Животные в период исследований находились на стандартном пищевом рационе со свободным доступом к воде и пище. Световой режим – естественный. Для изучения функции почек в условиях спонтанного диуреза крыс помещали в обменные клетки, где в течение 6 часов у них собиралась моча. По истечении времени проводилось рефлекторное опорожнение мочевого пузыря путем сжатия основания хвоста. В моче определяли концентрацию натрия, калия, кальция, креатинина, общего белка, осмолярность. Содержание натрия и калия в моче и сыворотке определяли методом пламенной фотометрии с помощью автоматического пламенного фотометра ФПА-2. Концентрацию кальция в моче и сыворотке определяли спектрофотометрически с помощью набора «Кальций-Арсеназо-Агат» ООО «Агат-Мед» (г. Москва, Россия). Содержание креатинина в моче и сыворотке определяли спектрофотометрически с помощью набора «Креатинин» «Агат-Мед» (г. Москва, Россия). Концентрацию общего белка определяли спектрофотометрически методом Лоури. Полученные значения использовались для расчета скорости клубочковой фильтрации воды по клиренсу эндогенного креатинина, величины канальцевой реабсорбции воды, фильтрационного заряда и относительной канальцевой реабсорбции катионов, уровня экскреции белка по общепринятым формулам.
Модель экспериментального гипопаратиреоза создавали на крысах оперативным путем, удаляя у них паращитовидные железы. Через 1,5 месяца после паратиреоидэктомии определяли уровень кальция в крови и отбирали животных с наиболее выраженной гипокальциемией для дальнейших экспериментов. У них выявлялись и общие внешние признаки гипопаратиреоза – снижение мышечной массы, вялость, судорожная готовность, поредение шерсти. В качестве контрольной группы использовали ложнооперированных крыс, которым производился аналогичный объем оперативного вмешательства за исключением выжигания паращитовидных желез. Еще одна модель гипокальциемии создавалась путем ежедневного подкожного введения препарата «Миакальцик» - синтетического кальцитонина лосося в дозировке 0,6 МЕ/100 г веса животного в течение 20 дней.
Экспериментальная гиперкальциемия также моделировалась 2 путями: созданием экспериментального гипервитаминоза D и внутрижелудочным введением хлорида кальция. Экспериментальный гипервитаминоз D получали ежедневным введением препарата «Аквадетрим» через атравматичный зонд в желудок в дозировке 3000 МЕ (0,2 мл)/100 г массы тела животного в течение 30 дней. Вторая модель гиперкальциемии была получена внутрижелудочным введением 10% раствора хлорида кальция в количестве 0,15 мл/100 г массы крысы в течение 20 дней.
Для получения токсического вещества ацетат свинца растворяли в стерильной дистиллированной воде таким образом, что на единицу раствора, равную 1 мл, приходилось 40 мг свинца (в пересчете на металл). На каждые 100 г веса крысы инъецировали 0,1 мл токсического раствора. Раствор ацетата свинца вводили интрагастрально или подкожно в дозировке 40 мг/кг, ежедневно 1 раз в сутки в течение 16 дней. В сочетанных моделях введение токсического вещества начинали с 5 дня опыта при общей длительности эксперимента 20 дней, и с 15 дня при общей длительности эксперимента 30 дней. Ложнооперированным крысам и крысам с экспериментальным гипопаратиреозом ацетат свинца вводили через 1,5 месяца после операции.
При проведении экспериментов руководствовались статьей 11 Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (1964), «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и Правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г.).
По истечении срока эксперимента животные забивались под тиопенталовым наркозом для исследования плазмы и тканей. Для гистологических исследований образцы тканей (почки) фиксировали в 10 % нейтральном формалине, после чего подвергали заливке в парафин с последующим приготовлением срезов толщиной 7-8 микрон. Срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Изучение срезов проводилось в проходящем свете при помощи микроскопа Микмед-1 под увеличением 80*200*400.
Перед определением элементов в костной ткани проводилась минерализация проб по ГОСТ 26929 и приготовление испытуемого раствора по ГОСТ 30178-96. В полученном растворе содержание кальция определяли после предварительного разведения с помощью спектрофотометра (PV 1251C), свинец – на атомно-абсорбционном спектрофотометре («Квант – АФА»).
Полученные результаты обрабатывались статистически, параметрическим методом сравнения средних величин с помощью t - критерия Стьюдента и методом корреляционного анализа с расчетом коэффициента корреляции. Сила связи между признаками оценивалась по шкале Чеддока. Для расчетов и построения графиков использовались программы MICROSOFT EXCEL и «Prizma 4.0».
![Физиологические особенности женщин с измененной массой тела в условиях Европейского Севера [Электронный ресурс]](/i/i/4479/213890.png "Физиологические особенности женщин с измененной массой тела в условиях Европейского Севера [Электронный ресурс] Ишекова, Надежда Ивановна")
