Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1. Роль активных форм кислорода. Система антиоксидантной защиты .13
1.1. Активные формы кислорода, их источники, основные антиоксиданты .13
1.2. Баланс между прооксидантами и антиоксидантами .16
1.3. Роль АФК в организме 18
1.3.1. Образование АФК - естественный физиологический процесс 18
1.3.2. Современные представления о повреждающей роли АФК и методы регистрации мпродуктов перекисного окисления 20
2. Сигнальная роль АФК при острых и адаптационных воздействиях. Основные компоненты редокс-сигнализации 28
3. Адаптация к изменению уровня кислорода и выявление ее эффектов .40
3.1. Оксигенотерапия – многократное применение повышенного уровня кислорода .40
3.2. Адаптация к действию факторов внешней среды. Стадии формирования защитных эффектов 42
3.3. Функциональные нагрузки, как способ выявления адаптационных эффектов 45
3.4. Поведенческие тесты как показатель защитных эффектов адаптации 53
4. Модель токсического действия бензола и хрома 57
ГЛАВА 2. Материалы и методы .62
2.1 Физиологические методы 67
2.2 Биохимические методы 70
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 76
3.1 Тестирование гипероксической компоненты в адаптации к гипоксии в различных режимах 7
3.1.1 Эффект адаптации к непрерывной гипероксии 80
3.1.2 Эффект адаптации к интервальной гипоксии-гипероксии 84
3.2 Эффект адаптации к изменению уровня кислорода в условиях применения токсикантов в малых дозах 87
3.2.1 Эффект адаптации к изменению уровня кислорода в условиях применения токсикантов в малых дозах на коротких сроках 87
3.2.1.1 Оценка действия смеси токсикантов 88
3.2.1.2 Эффект предварительной адаптации к изменению уровня кислорода .93
3.2.2 Эффект предварительной адаптации к изменению уровня кислорода в условиях увеличения длительности применения токсикантов .98
3.2.2.1 Оценка эффектов увеличения длительности введения токсикантов 99
3.2.2.2 Эффект предварительной адаптации к изменению уровня кислорода 103
3.3 Эффект кратковременной адаптации к гипоксии и гипероксии на фоне применения токсикантов в малых дозах 108
3.3.1 Характеристика тестирующей системы 110
3.3.2 Оценка действия смеси токсикантов .117
3.3.3 Эффект адаптации к изменению уровня кислорода на фоне введения токсикантов 122
Выводы 130
Список литературы
- Роль АФК в организме
- Функциональные нагрузки, как способ выявления адаптационных эффектов
- Эффект адаптации к интервальной гипоксии-гипероксии
- Эффект предварительной адаптации к изменению уровня кислорода в условиях увеличения длительности применения токсикантов
Роль АФК в организме
Среди основных ферментов антиоксидантной защиты выделяют супероксиддисмутазу (СОД), которая катализирует дисмутацию супероксидного анион-радикала O2 в кислород и пероксид водорода; каталазу, принимающую участие в разложении Н2О2; пероксидазы и трансферазы глутатионового цикла, осуществляющие удаление органических перекисей.
Супероксиддисмутаза находится «у самых истоков» образования АФК и представляет один из первостепенных уровней клеточной защиты [Liochev S.I. и Fridovich I., 2010]. В организме человека и животных в зависимости от расположения выделяют три изоформы фермента: в цитозоле находится Cu,Zn-СОД, в митохондриях - Mn-СОД, экстрацеллюлярно - Э-СОД.
Си,7п-СОД содержится в ядре, цитоплазматическом матриксе, пероксисомах и межмембранном пространстве митохондрий. Молекулярная масса Си,гп-СОД 31 Юа, молекула состоит из двух идентичных субъединиц, связанных дисульфидным мостиком. Каждая субъединица содержит один атом Си2+ и один атом Zn2+. Атом цинка необходим для стабилизации молекулы фермента, в то время как медь принимает непосредственное участие в дисмутации супероксидного анион-радикала [Зенков Н.К. и др., 2001].
Однако, избыточный уровень АФК может приводить к ингибированию работы СОД из-за образования гидроксильного радикала, способного нарушать структуру самой молекулы фермента. Поэтому для нормальной работы СОД необходимо присутствие низкомолекулярных антиоксидантов или, чтобы ее работа была согласованна с пероксидазами. Одним из таких ферментов является каталаза - железосодержащий протопорфирин с каталазной и пероксидазной функциями. Данный фермент разлагает Н2О2, если концентрация Н2О2 низкая, то происходит пероксидазный путь расщепления, а если концентрация высокая, то преобладает каталазный путь расщепления. Это объясняется тем, что сродство глутатионпероксидазы к перекиси водорода выше чем у каталазы и, поэтому она лучше работает при низких концентрациях перекиси. К глутатионовой антиоксидантной системе относятся глутатионтрансферазы, глутатионредуктазы и NADPH, для полноценной работы данной системы необходимо постоянное восстановление окисленного глутатиона глутатионредуктазой.
Помимо этого, в систему антиоксидантоной защиты клетки входят и такие низкомолекулярные компоненты, как фенольные антиоксиданты, каротиноиды и витамины А, С, Е, серосодержащие соединения [Владимиров Ю.А., 1998; Зенков Н.К. и др.,2001], липоевая кислота, N-ацетилцистеин, мелатонин и другие. Они в свою очередь также способны нейтрализовать свободные радикалы, способствуя тем самым стабилизации активности СОД и глутатионпероксидазы и защите клеточных компонентов - белков, липидов, ДНК, что подтверждено in vivo на примере гормона мелатонина [Тодоров И.Н., 2007]. Согласованная работа этих механизмов поддерживает на постоянном уровне, как образование, так и превращения свободных радикалов и других потенциально опасных соединений [Владимиров Ю.А., 1998, 2002; Величковский Б.Т., 2001].
Таким образом, система антиоксидантной защиты клетки обладает высокой степенью синхронизации и поддерживает физиологический уровень свободнорадикального окисления в клетке. Интересно, что в результате длительного воздействия того или иного фактора, наиболее эффективным для организма является компенсаторный возврат синтеза защитных систем к контрольному уровню [Sazontova T.G., 2002], что свидетельствует о компенсации поступившего АФК-сигнала синтезом защитных систем. Таким образом, повышенный уровень защитных белков на начальных стадиях воздействия сменяется, как правило, нормализацией их уровня.
Для каждого организма, каждой ткани присущ определенный, равновесный уровень соотношения прооксидантов и антиоксидантов. Любой внешний или внутренний фактор, вызывающий повышение уровня АФК, сопровождается ответом антиоксидантной защиты, выражающимся как в повышении ее активности, так и в увеличении количества того или иного защитного компонента, например белков срочного ответа семейства HSP [Сазонтова Т.Г., 2002]. Таким образом, появляясь в результате различных повреждающих воздействий на организм – стрессе, температурном шоке, гипоксических воздействиях, ишемии и т.д., АФК играют важную сигнальную роль к активации синтеза новых молекул антиоксидантов.
В зависимости от исходного состояния организма и интенсивности АФК-сигнала ответ клетки может быть реализован различными путями. Во всех случаях наблюдается синтез защитных систем, но в конечном итоге может быть либо достигнута компенсация, т.е. возврат в исходное равновесное состояние. Может произойти декомпенсация, когда несмотря на повышенный синтез защитных систем их оказывается недостаточно для компенсации АФК-сигнала. Если же уровень защитных белков будет своевременно достаточно увеличен, то возможно формирование устойчивости клетки к данному повреждающему фактору [Sazontova T.G. et al., 2002]. Этот эффект и лежит в основе различных видов адаптирующих воздействий (Рисунок 1).
Функциональные нагрузки, как способ выявления адаптационных эффектов
На основе санитарно-гигиенического исследования в Оренбургской Медицинской Академии разработана модель подострой интоксикакции смесью: К2Cr2О7 и бензола, изучающая на донозологическом этапе эффекты малых доз этих токсикантов у людей, работающих на промышленных предприятиях, или живущих в зоне высокого уровня антропогенного загрязнения [Боев В.М. и др., 2003; Утенин В.В., 2002]. Выбор токсикантов был обусловлен значительным превышением фонового уровня содержания хрома и бензола в объектах среды в промышленных городах, выявленным при санитарно-гигиенических исследованиях, проведенных в Оренбургской области [Пинигин М.А., 2001; Утенин В.В., 2002]. Подобраны дозы бензола в несколько раз ниже LD50.
Учитывая, что одним из значимых путей поступления в организм данных токсикантов является питьевая вода [Изтлеутов М.К., 2004], в модели был использован пероральный способ введения низких доз бензола и бихромата калия, растворенных в питьевой воде.
Таким образом, основываясь на показанной роли индукции АФК-зависимых процессов соединениями хрома и бензола, было предположено, что в этих случаях эффективными могут оказаться немедикаментозные способы повышения неспецифической резистентности организма. В качестве коррегирующих воздействий в данной работе применяли адаптацию к интервальной нормобарической гипоксии-нормоксии и новый вид адаптации к гипоксии-гипероксии. Общий план исследования. Работа проведена на 168 крысах самцах Вистар массой 280-320г. Содержание животных и постановка экспериментов проводили в соответствии с международными правилами «Guide for the Careand Use of Laboratory Animals». Животных содержали в стандартных условиях вивария, каждая группа n=7 содержалась в отдельной клетке. Животных лишали корма за сутки до острого воздействия или забора тканей, который проводили через два часа после воздействия. В начале эксперимента и перед забором биоматериала фиксировали вес животных, в качестве наркоза использовался уретан.
Использовались следующие физиологические и патофизиологические модели: 1. Модели острых воздействий: - острая однократная (ОФН) и трехкратная истощающая физическая нагрузка (3 ОФН), включающая стрессорную компоненту, осуществлялась с помощью принудительного плавания до отказа с 5% грузом от массы тела и при температуре воды 21оС; - введение малых доз токсикантов в 6 раз ниже LD50 (животные постоянно в течение одной или двух недель получали с питьевой водой смесь бензола (0,12 мл/кг) и бихромата калия (5,0 мг/кг). 2. Модели адаптации к изменению уровня кислорода - в нормобарических условиях с помощью оригинальной установки, работающей по принципу мембранного деления газов - совместная разработка лаборатории адаптационной медицины ФФМ МГУ им. М.В. Ломоносова и фирмы «Метакс»: а) 13 О2 - адаптация к непрерывной гипероксии - 40% О2, 13 дней, 1 час в день; б) Г/Н - классическая адаптация к гипоксии и нормоксии - чередование 5 мин смеси с 10% О2 и 3 мин нормоксии, по 64 мин ежедневно, 14 сеансов; в) Г/Г - адаптация к гипоксии - гипероксии - чередования периодов гипоксии - 5 мин 10% О2 и умеренной гипероксии - 3 мин 30% О2, по 64 мин курсом 8 или 14 дней. 3. Тестирование функционального состояния: - поведенческие тесты в двух системах - «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) и «открытое поле» (ОП) для определения ориентировочно исследовательской активности и показателей тревожности животных по показателям: общего пробега; средней и максимальной скорости движения; времени проведенном в открытых, закрытых лучах и в центе лабиринта; количеству выходов и выглядов на открытые лучи; общего количества стоек и времени груминга; общего времени движения и неподвижности; эпизодов движения и неподвижности; количества стоек на открытых лучах и свешиваний с открытых лучей. - регистрация изменения веса животных, общего времени удержания животных на воде при истощающем плавании, объема потребляемой жидкости с токсикантами в динамике эксперимента. Для выявления повреждающих и защитных воздействий оценивали уровни свободнорадикального окисления и ферментов антиоксидантной защиты в печени, уровень фактора транскрипции HIF-1 и индуцируемых им белков семейства HSP в ткани печени, сердца и скелетной мышце.
Уровень белков оценивался методом Western-blot с использованием первых специфических антител и вторых антител с пероксидазной меткой. Исследование разделено на 3 основных этапа.
На первом этапе проводили выбор режима адаптирующих воздействий, включающих гипероксическую компоненту. Для этого сравнили действие гипероксических режимов – непрерывной нормобарической гипероксии и нового режима адаптации – интервальной нормобарической гипоксии-гипероксии. Эксперимент проводили 13 дней, животные были разделены на три группы: контроль, группу с адаптацией к непрерывной гипероксии (13 О2) и адаптацией к гипоксии-гипероксии (Г/Г) (схема 1). Схема 1. Дизайн эксперимента. Группы: Контроль - контрольная группа; 13 О2 – сеансы непрерывной гипероксии; Г/Г – адаптация к интервальной гипоксии-гипероксии.
Во второй части эксперимента проводилось изучение эффекта предварительной двухнедельной адаптации к изменению уровня кислорода (гипоксии-нормоксии или гипоксии-гипероксии) в условиях перорального применения в течение 7 дней смеси токсикантов (К2Cr2О7 и бензола) в малых дозах, значительно ниже LD50 (схема 2).
Эксперимент проводили 14 дней, часть животных оставалась интактной (контроль), часть получала тестирующую однократную острую физическую нагрузку как на фоне (Б1+ОФН), так и без введения токсикантов (ОФН). Животным 4-ой (Г/Н+Б1+ОФН) и 5-ой групп (Г/Г+Б1+ОФН) в течение 14 дней от начала эксперимента проводилась предварительная периодическая адаптация в режиме гипоксии-нормоксии (4 группа) и гипоксии-гипероксии (5 группа), и начиная с 7 дня эксперимента они получали перорально с питьевой водой смесь токсикантов, с последующей тестирующей ОФН на 14 день. Через 2 недели все группы, кроме группы контроля получили острую истощающую физическую нагрузку.
На следующем этапе проводилась оценка сохранения защитного эффекта предварительной адаптации к изменению уровня кислорода при повышении интенсивности действия токсикантов за счет увеличения длительности их действия – с одной до двух недель (схема 2).
Эффект адаптации к интервальной гипоксии-гипероксии
Поскольку при действии токсикантов в малых дозах показана свободнорадикальная природа изменений, происходящих в организме, на следующем этапе была изучена возможность предупреждения эффектов, индуцируемых смесью бихромата калия и бензола, с помощью предварительной адаптации к изменению уровня кислорода, которая обладает защитным действием, повышая резистентность к свободнорадикальным процессам.
Оценивали эффективность кратковременного курса адаптации (14 дней) к изменению уровня кислорода. Применяли нормобарическую гипоксическую тренировку в двух режимах: к гипоксии – нормоксии (10% О2 5 мин – 21% О2 - 3 мин, 1 ч, 14 дней – Г/Н) и гипоксии – гипероксии (10% О2 5 мин – 30% О2 3 мин, 1 ч, 14 дней – Г/Г).
Прежде всего оценили изменение физиологических параметров организма в целом при действии предварительной адаптации к изменению уровня кислорода в условиях применения токсикантов в малых дозах.
Как уже было отмечено в разделе 3.2.1.1, действие токсикантов проявилось в задержке роста животных, вес которых был ниже, чем в контрольной группе. Предварительная адаптация как к гипоксии-нормоксии, так и гипоксии-гипероксии позволяла предупредить задержку роста, вызванную введением токсикантов. Прибавка веса в этих группах не отличалось от контрольных животных.
При оценке физической выностивости по индивидуальному времени удержания животных на воде, она была снижена при ОФН, проведенной на фоне токсикантов – раздел 3.2.1.1. Предварительная адаптация к изменению уровня кислорода в обоих режимах – гипоксии-нормоксии и гипоксии-гипероксии, предупреждала этот эффект (Рисунок 20).
Эффект адаптации к изменению уровня кислорода на физическую выносливость в условиях применения токсикантов. Представлена диаграмма типа Boxplot, нижняя и верхняя границы столбиков - 25 и 75 квартили соответственно, горизонтальная красная линия – медиана, нижняя и верхняя планки погрешностей -минимум и максимум соответственно. ОФН – острая физическая нагрузка; Б1+ОФН – смесь токсикантов в течение недели с последующей ОФН; Г/Н+Б1+ОФН – предварительная адаптация к гипоксии-нормоксии в течение 2-х недель, токсиканты с 7-ого дня в течение одной недели с последующей ОФН; Г/Г+Б1+ОФН – предварительная адаптация к гипоксии-гипероксии в течение 2-х недель, токсиканты с 7-ого дня в течение одной недели с последующей ОФН. - достоверность отличий (р0,05) от группы ОФН, # - достоверность отличий (р0,05) от группы Б1+ОФН (Mann-Whitney U Test). При этом важно отметить, что если адаптация к гипоксии-нормоксии приводила к воосстановлению физической выносливости до контрольного уровня, то гипоксия-гипероксия даже увеличивала длительность удержания животных на воде, где все животные в группе проплавали дольше 20 мин (Рисунок 20).
Таким образом, в случае предварительной адаптации к гипоксии-гипероксии эффект повышения выносливости животных несмотря на потребление токсикантов выражен наиболее ярко, отмечено достоверное повышение длительности плавания на 30% (р0,05), по сравнению с группой Б1+ОФН (Рисунок 20).
Предварительная адаптация к гипоксии-гипероксии предупреждала повышение интенсивности окислительных процессов, вызванных введением токсикантов – группа Г/Г+Б1+ОФН по сравнению с Б1+ОФН, что сопровождалось высоким уровнем защитных систем (Таблица 3).
Примечание: А532- оптическая плотность при 532 нм, CAT– каталаза, мкмоль 10-2 Н2О2 в мин на мг белка, GR – глутатионредуктаза, нмоль NADPH в мин на мг белка, SOD – супероксиддисмутаза, у.е. - достоверность отличий (р0,05) по сравнению с контролем (Mann-Whitney U Test). Адаптация к гипоксии-нормоксии данным эффектом не обладала, напротив, на фоне действия токсикантов – Г/Н+Б1+ОФН, росла чувствительность клеточных мембран к индукции свободнорадикальных процессов на фоне отсутствия активации антиоксидантных ферментативных систем.
При изучении уровня фактора транскрипции HIF-1 и индуцируемых им защитных белков в сердце оказалось, что оба вида адаптации позволяют в равной степени предупредить их повышение, вызванное введением токсикантов (Рисунок 21А). Кроме того, наблюдалась компенсация повышенного уровня HIF-активируемого белка - индуцибельной формы HОх1. Действительно, из рисунка 21Б видно, что применение адаптации к изменению уровня кислорода привело к снижению уровня HOх-1 в сердце крыс на 32% в группе Г/Г+Б1+ОФН и на 37% в группе Г/Н+Б1+ОФН от Б1+ОФН. Интересно, что как и в случае HIF-1, для индуцибельной НОх-1 действие токсикантов нивелирует различия между видами адаптации, при этом оба вида адаптации эффекцивно снижают повышенную экспрессию транскрипционного фактора HIF-1 и индуцируемой им НОх-1 (Рисунок 21Б).
В отличие от вызванного адаптацией компенсаторного изменения уровня белков гипоксической природы – фактора транскрипции HIF-1 и индуцибельной формы гемоксигеназы, этого не происходит с белком стрессорной природы – индуцибельной формой HSP72. Индуцибельный белок, HSP72 отвечает экспрессией в ответ на стрессирующие воздействия самой разной природы и имеет повышенное сродство к гидрофобным участкам, появляющимся на поверхности белков при денатурации или иных изменениях в структуре клеточных белков, вызванной действием стресс-факторов. Взаимодействие HSP72 с денатурированными белками приводит к восстановлению их нативной конформации. В случае необратимой денатурации, белки, связанные с HSP72, подвергаются протеолизу. В условиях потребления токсикантов оба вида адаптации не изменяют уровень стресс-белка
Таким образом, оба вида предварительной адаптации к изменению уровня кислорода – классический метод гипоксии-нормоксии и новый вид адаптации к гипоксии-гипероксии, в условиях действия токсикантов в малых дозах в течение недели приводят к следующим изменениям
Эффект предварительной адаптации к изменению уровня кислорода в условиях увеличения длительности применения токсикантов
Как и в случае с ПКЛ, в тесте «открытое поле» получены данные об увеличении тревожности животных, где аналогично зафиксировано значительное возрастание общего времени груминга в группе 9Б +3 ОФН, по сравнению с группой трехкратной ОФН без введения токсикантов.
Таким образом, на основе данных поведенческих тестов ПКЛ и «открытое поле» можно заключить, что применение в течение девяти дней токсикантов в малых дозах с питьевой водой практически не влияло на ориентировочно-исследовательскую активность животных, однако при этом повышалась стрессорная компонента поведения.
Другим проявлением потребления смеси токсикантов явилась выявленная достоверная задержка роста животных.
При оценке интенсивности свободнорадикального окисления оказалось, что применение 1 ОФН и 3 ОФН на фоне приема смеси бензола и бихромата калия вызывает значительно больший окислительный стресс. Причем в данном случае увеличение количества нагрузок от 1 ОФН к 3 ОФН уже не сопровождалось нормализацией окислительных процессов.
Так интенсивность свободнорадикального окисления в ткани печени животных, получавших токсиканты с питьевой водой в течение 9 дней, значительно возрастала как при однократной - 9Б+1 ОФН, так и при трехкратной физической нагрузке - 9Б+3 ОФН. Однако если в группе 9Б+1ОФН скорость накопления ТБК-активных продуктов практически совпадает с таковой у животных с 1 ОФН без потребления токсикантов, то в случае трехкратной физической нагрузки на фоне употребления токсической смеси она значительно выше, чем в группе 3 ОФН и даже несколько превышает 9Б+1 ОФН (Рисунок 40).
Эффект однократной (А) и трехкратной (Б) острой физической нагрузки на уровень свободнорадикального окисления в печени в условиях применения токсикантов. Представлена динамика накопления ТБК-активных продуктов свободнорадикального окисления при его индукции in vitro. А532- оптическая плотность при 532 нм.
Контроль - контрольная группа; 1 ОФН – однократная острая истощающая физическая нагрузка в последний день эксперимента; 3 ОФН – трехкратная острая истощающая физическая нагрузка в последний день эксперимента; 9Б+1 ОФН - группа с введением токсикантов в течение 9 дней, с последующей однократной ОФН; 9Б+3 ОФН - группа с введением токсикантов в течение 9 дней, с последующей трехкратной ОФН. - достоверность отличий (р0,05) по сравнению с контролем (Mann-Whitney U Test).
Одновременно с этим в условиях потребления токсикантов в течение девяти дней отмечалось значительное увеличение показателей антиоксидантной активности, хотя вклад разных видов ферментов отличался в зависимости от кратности тестирующих нагрузок. Однократная физическая нагрузка – 1 ОФН у животных, получавших токсиканты, приводила к повышению активности Cat - на 34%, GR и SOD – на 23% относительно контроля. Трехкратное истощающее плавание – 3 ОФН в этих же условиях повышало активность Cat – на 20%, GR – на 50%, SOD – на 21% относительно контрольной группы (Рисунок 41). Причем в результате АФК-сигнала в случае 9Б+1 ОФН наибольшая активность отмечалась у каталазы, тогда как на увеличение кратности действующего фактора и на фоне, и без введения токсикантов более активно реагировала глутатионредуктаза (Рисунок 42).
Таким образом, в условиях потребления токсикантов в малых дозах в течение девяти дней высокая активация защитных систем компенсировала окислительный стресс только в режиме 9Б+1ОФН, где не происходило повышения интенсивности окисления по сравнению с группой 1 ОФН. Тогда как при трехкратной острой истощающей физической нагрузке - 9Б+3ОФН, наблюдалась декомпенсация и значительное увеличение интенсивности свободнорадикальных реакций по сравнению с группой 3 ОФН без введения токсикантов, несмотря на значительное повышение уровня антиоксидантных ферментов, что в целом свидетельствует о снижении защитных способностей организма.
Заключительным этапом работы стало изучение принципиальной возможности на донозологическом этапе коррекции изменений организма, вызванных введением токсикантов, с помощью применения минимального по длительности курса адаптации в новом режиме оксигенации – «гипоксия-гипероксия». В качестве тестирующей модели использовали трехкратную физическую нагрузку – 3 ОФН в связи с тем, что она оказалась менее острой, а также более лабильной для выявления эффектов малых доз токсикантов по изменению параметров окислительных процессов.
Было установлено, что в условиях одновременного введения токсикантов и проведения адаптирующих воздействий, данный вид адаптации позволяет нормализовать такой тестовый показатель, как время плавания. Зафиксировано гораздо меньшее время третьего тестирующего плавания при введении токсикантов без адаптации - 9Б+3ОФН, на 24% относительно группы 3 ОФН, адаптация же к гипоксии-гипероксии повышает длительность плавания относительно группы 9Б+3ОФН на 31%, что оказалось даже на 7% выше, чем в контрольной группе (для этого анализа контролем является 3ОФН) (Рисунок 42).
