Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор. закономерности самоорганизации и практическое применение систем на основе пав и полиэлектролитов 9
1.1. Самоорганизация в системах на основе синтетических полиэлектролитов и противоположно заряженных ПАВ 10
1.1.1. Природа взаимодействий ПАВ-полиэлектролит 11
1.1.2. Фазовое поведение систем ПАВ-полиэлектролит 13
1.1.3. Факторы, определяющие процесс комплексообразования ПАВ – полиэлектролит 15
1.1.4. Взаимодействие полиэлектролитов с геминальными ПАВ 20
1.2. Комплексообразование в системах ПАВ – ДНК 26
1.3. Полиэлектролитное микро- и нанокапсулирование 33
1.3.1. Задачи и методы инкапсулирования 33
1.3.2. Инкапсулирование субстратов с использованием стратегии layer-by-layer 38
1.3.3. Доставка лекарственных средств 42
1.3.4. Методы связывания и высвобождения субстратов 44
1.3.5. Методы контроля структуры капсул 51
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 54
2.1. Объекты исследования 54
2.2. Приготовление растворов 57
2.3. Методы исследования 58
2.4. Методика синтеза полиэлектролитных капсул 64
2.5. Процедура трансформации бактериальных клеток 66
2.6. Погрешности определения измеряемых величин 66
ГЛАВА 3. Супрамолекулярные системы на основе катионных пав и полиэлектролитов 69
3.1. Самоорганизация в системах катионное ПАВ-полиакриловая кислота. Влияние структурных факторов 69
3.1.1. Индивидуальный раствор полиакриловой кислоты 71
3.1.2. Бинарные системы геминальное ПАВ-ПАК 74
3.1.3. Бинарные системы монокатионное ПАВ–ПАК 87
3.2. Самоорганизация в системах на основе гемиальных ПАВ и природных полианинов 94
3.2.1. Самоорганизация гидроксиэтильных геминальных ПАВ в водных растворах 95
3.2.2. Взаимодействие гидроксиэтильных геминальных ПАВ с олигонуклеотидом 100
3.2.3. Встраивание в липидный бислой 108
3.2.4. Комплексообразование геминального гидроксиэтилированного ПАВ с плазмидной ДНК 110
3.2.5. Трансформация бактериальных клеток комплексами ПАВ/ДНК 112
3.3. Полиэлектролитные капсулы 115
3.3.1. Метод синтеза полиэлектролитных капсул, включающий предварительную солюбилизацию субстрата амфифильными cоединениями 117
3.3.2. Факторы, определяющие проницаемость капсул 123
3.3.3. Методика прямого нанесения полиэлектролитов на субстрат 128
3.3.4. Темплатная методика 131
3.3.5. Варьирование природы полиэлектролитов 138
3.3.6. Капсулирование лекарственных средств 143
Основные результаты и выводы 148
Список использованной литературы 150
Приложение 175
- Самоорганизация в системах на основе синтетических полиэлектролитов и противоположно заряженных ПАВ
- Процедура трансформации бактериальных клеток
- Самоорганизация в системах на основе гемиальных ПАВ и природных полианинов
- Метод синтеза полиэлектролитных капсул, включающий предварительную солюбилизацию субстрата амфифильными cоединениями
Введение к работе
Актуальность работы. Полимер-коллоидные комплексы (ПКК), которые образуются при взаимодействии противоположно заряженных полиэлектролитов и мицеллобразующих ПАВ, находят широкое применение в биомедицине, катализе, косметической промышленности, нефтедобыче и т.д. В настоящее время ключевой областью применения ПКК является полиэлектролитное капсу-лирование и создание полимер-коллоидных наноконтейнеров для адресной доставки, защиты, хранения и пролонгированного высвобождения терапевтических препаратов. Системы на основе полианионов и ПАВ вызывают повышенный интерес, поскольку позволяют моделировать межмолекулярные взаимодействия ДНК с природными амфифилами, а также широко используются для создания систем доставки генного материала. В связи с интенсивным развитием биоиндустрии возрастают и появляются новые требования к таким бинарным системам: (1) биодоступность, (2) биоразлагаемость, (3) нанометровый диапазон размеров, (4) низкие концентрации веществ и т.д. Поэтому поиск новых материалов, удовлетворяющих этим требованиям, для создания систем с управляемыми свойствами является актуальной проблемой. Расширение и систематизация исследований систем ПАВ-полиэлектролит позволяют устанавливать закономерности их самоорганизации и проводить направленный подбор компонентов, руководствуясь полученными знаниями. Работа выполнена на кафедре органической химии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский национальный исследовательский технологический университет». Работа проведена при финансовой поддержке программ ОХНМ РАН № 3 «Создание биосовместимых нанокапсул методом послойной адсорбции полиэлектролитов на супрамолекулярный комплекс биологически активного субстрата с ионным каликсареном», грантами РФФИ 12-03-00668 «Супрамолекулярные наноконтейнеры и полиэлектролитные капсулы: контролируемое связывание/выделение органических молекул и биосубстратов», РФФИ офи_м 13-03-12436 «Создание высокорелаксивных коллоидно-устойчивых наночастиц Fe2O3/Fe3O4 для магнитной томографии, модифицированных новыми биосовместимыми амфифилами»; МК – 6711 – 2012 -3 «Комплексообразование олиго- и полинуклеотидов с катионными амфифильными агентами: роль стехиометрических и кооперативных взаимодействий».
Цель работы. Установление закономерностей самоорганизации катионных ПАВ в присутствии синтетических и природных полианионов с целью создания функциональных наносистем с контролируемыми свойствами и разработка подходов к инкапсулированию низкомолекулярных гидрофобных субстратов методом послойного осаждения противоположно заряженных полиэлектролитов.
Научная новизна работы.
1. Получены новые полимер-коллоидные комплексы полиакриловой кислоты с геминальными и
монокатионными ПАВ, определены их агрегационные характеристики при варьировании строе
ния головных групп, гидрофобности ПАВ и концентрации полиэлектролита.
2. Впервые изучены процессы комплексообразования геминальных ПАВ с различной длиной
спейсера с олиго и полинуклеотидами. Эффективность взаимодействия ПАВ-олигонуклеотид мак
симальна для ПАВ с додекаметиленовым спейсером. Впервые показана возможность использова
ния гидроксиэтилированных геминальных ПАВ для доставки ДНК в клетки бактерий.
3. Проведена оптимизация трех различных протоколов послойного осаждения полиэлектролитов
для инкапсулирования низкомолекулярных незаряженных субстратов. Впервые установлены фак
торы, корректировка которых позволяет получать полиэлектролитные капсулы с контролируемой
проницаемостью стенок для постепенного (не триггерного) высвобождения субстратов; размер
капсул можно направленно варьировать от нано- до микрометрового диапазона, а время высвобождения субстратов – от нескольких минут до многих часов.
Методы исследования. В работе использованы методы тензиометрии, кондуктометрии, рН – мет-рии, спектрофотометрии, флуоресцентной спектроскопии, турбидиметрии, динамического и элек-трофоретического рассеяния света, атомно-силовой, конфокальной, электронной микроскопии.
Практическая значимость.
Установление закономерностей самоорганизации полимер-коллоидных систем позволяет создавать на их основе эффективные наноконтейнеры (капсулы, невирусные векторы) для инкапсулирования лекарственных препаратов и биомолекул с целью их адресной доставки к биомишеням и защиты от неблагоприятного воздействия внешней среды. В рамках диссертационной работы созданы протоколы инкапсулирования и разработаны методики, позволяющие контролировать скорость выделения субстрата из капсулы и проводить количественную оценку защитного эффекта капсул. Показана возможность использования геминальных ПАВ для комплексообразования оли-го- и полинуклеотидов.
На защиту выносятся:
-
Результаты оценки влияния структуры головной группы и гидрофобности моно- и дикатионных ПАВ на взаимодействие с синтетическим полиэлектролитом – полиакриловой кислотой (определение ККА, чисел агрегации, размеров).
-
Закономерности изменения эффективности взаимодействия геминальных ПАВ с природными полианионами (олигонуклеотид и плазмида ДНК) при варьировании длины спейсера.
-
Протоколы формирования полиэлектролитных капсул различными методами; количественные характеристики полученных образцов (размер, форма, реакционная способность субстратов) и результаты их сравнения; новые методы контроля проницаемости капсул.
Апробация работы. Результаты диссертационного исследования были представлены на ХIX Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик, 2011); школе-конференции для молодых ученых «Макромолекулярные нанообъекты и полимерные нанокомпо-зиты» (Москва, 2012); первой всероссийской конференции по жидким кристаллам (Иваново, 2012); Всероссийской молодежной конференции «Химия поверхности и нанотехнология» (Казань, 2012); Всероссийской молодежной конференции «Химия под знаком Сигма: исследования, инновации, технологии» (Казань, 2012); итоговых конференциях КНИТУ и ИОФХ КазНЦ РАН (Казань, 2011, 2012, 2013, 2014), Юбилейной научной школе-конференции «Кирпичниковские чтения по химии и технологии высокомолекулярных соединений» (Казань, 2013), Девятой Санкт-Петербургской конференции молодых ученых с международным участием «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 2013), а также представлены на Республиканском конкурсе научных работ студентов и аспирантов им. Н. И. Лобачевского (Казань, 2013).
Публикации. Материалы диссертационной работы опубликованы в 7 статьях в журналах, рецензируемых ВАК РФ, и 13 тезисах докладов в конференциях различного уровня.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы (220 ссылок) и приложения. Общий объем диссертации 177 страниц, включая 8 таблиц, 112 рисунков, 3 схемы.
Самоорганизация в системах на основе синтетических полиэлектролитов и противоположно заряженных ПАВ
Комплексы природных и синтетических ПЭ с противоположно заряженными мицеллообразующими ПАВ представляют собой сложные самоорганизующиеся системы, состав и строение которых определяются природой и взаимным влиянием ПЭ и ПАВ [18]. Механизм и природа взаимодействий между функциональными группами ПЭ и противоположно заряженным амфифилом могут быть различными: гидрофобный эффект, электростатические, ван-дер-ваальсовые взаимодействия, водородные связи [19]. Но основной вклад во взаимодействие между ПЭ и противоположно заряженными ПАВ вносят электростатические силы.
Впервые наиболее существенная информация о взаимодействиях полиэлектролит - ПАВ была получена из изотерм связывания с помощью ПАВ селективных электродов [20]. Обычно заметное снижение ККМ ПАВ наблюдалось в связи с компенсацией заряда мицелл ПАВ, что обеспечивает плотную упаковку молекул ПАВ и стабилизирует агрегаты. В соответствии с теоретическими моделями, в случае гидрофильных полиэлектролитов, значения ККА уменьшаются с увеличением плотности заряда, гибкости полимерной цепи и гидрофобности ПАВ. Отношение ККА / ККМ для гибких полиионов составляет около 1/60 и 1/4 - для жестких. Для пары полиакриловая кислота и алкилтриметиламмониевые ПАВ это значение составляет 0.01. Между тем, гидрофобные полиэлектролиты, как правило, повышают предел мицеллообразования.
Часто используемым методом определения ККА является измерение поверхностного натяжения, хотя тензиометрическая точка перегиба отражает не только объемное фазовое поведение, но и адсорбцию на границе раздела воздух / раствор. В отличие от незаряженных систем ПАВ-полимер, для систем ПАВ-полиэлектролит наблюдаются более сложные концентрационные зависимости поверхностного натяжения. В то время как первые характеризуются двумя критическими точками, т.е. ККА и ККМ (обозначаются как T1 и T3), последние характеризуются тремя, четырьмя или даже более критическими точками.
Дальше мы приводим некоторые примеры исследования конкретных систем, преимущественно на основе катионных ПАВ и полианионов, которые являются целью диссертационной работы. Однако, системы на основе анионных ПАВ и поликатионов также широко представлены в литературе. Например, в работе [21] изучено взаимодействие полиаллиамина (ПАА) и додецилсульфата натрия (ДСН), выявлены электростатические и гидрофобные аспекты комплексообразования, а также оценен вклад кооперативных взаимодействий в присутствии соли. Показано, что взаимодействия ПАВ-ПЭ могут быть вызваны не только электростатическими силами, но и гидрофобным эффектом. Установлено, что при образовании комплекса цетилтриметиламмоний бромида (ЦТАБ) и додецилтриметиламмоний бромида (ДТАБ) со слабым полиэлектролитом полиакриловой кислотой (ПАК), помимо электростатических взаимодействий, важную роль играют гидрофобный эффект и водородная связь [22].
Взаимодействие ПАВ-ПЭ вызывает ассоциацию при очень низкой концентрации ПАВ, известной как критическая концентрация агрегации (ККА), которая, как правило, ниже критической концентрации мицелообразования (ККМ) индивидуального ПАВ [23]. Однако встречаются случаи, когда значение ККА выше ККМ индивидуального раствора ПАВ [24]. Участие полиэлектролита в процессе агрегации снижает отталкивающее взаимодействие между ионными головными группами ПАВ, и, следовательно, индуцированные мицеллы, сформированные в присутствии полиэлектролитов, являются более стабильными и плотно упакованными, чем свободные мицеллы ПАВ [25].
В работе [26] изучено взаимодействие ДТАБ и сильного полиэлектролита полистиролсульфоната (ПСС) при варьировании его концентрации от 20 до 140 ппм. Резюмируя результаты работы, можно сделать следующие выводы: во-первых, первая критическая концентрация четко зависит от концентрации полиэлектролита, во-вторых, вторая критическая концентрация значительно больше, чем ККМ индивидуального ПАВ и не чувствительна к концентрации ПЭ. Такое поведение отличается от типичных слабо взаимодействующих систем. Это классическое поведение систем ПАВ-ПЭ, которое характерно для многих комплексов.
Процедура трансформации бактериальных клеток
Так как в процессе формирования полиэлектролитных капсул использованы различные полиэлектролиты, для описания всех методик ограничились двумя полиэлектролитами – полиакриловой кислотой и полиэтиленимином, для остальных полиэлектролитов применяли аналогичные процедуры.
В первой «карбонатной» методике можно выделить несколько стадий:
1. Получение микросферолитов карбоната кальция: при интенсивном перемешивании (магнитная мешалка, 1400 об/мин) к 15 мл водного раствора хлорида кальция (СаСI2, 0.33 М) добавляли 0.01 М спиртовый раствор ПНФЛ, а затем – эквивалентное количество раствора карбоната натрия (Na2CO3). Смесь выдерживали, выделившийся осадок отфильтровывали, многократно промывали дистиллированной водой и сушили при комнатной температуре.
2. Формирование многослойной оболочки: готовили раствор, содержащий ПАК (1 г/л) и NaCl (0.5М). Далее при интенсивном перемешивании добавляли 20 мг микрочастиц СаСО3 и инкубировали при комнатной температуре в течение 3 минут. Несвязавшийся полимер удаляли центрифугированием (3000 об/мин) в течение 6 минут. Полученный осадок промывали раствором 0.2 M NaCl и далее центрифугировали в тех же условиях. Промывание осадка повторяли дважды, затем осадок ресуспендировали в 1 мл раствора ПЭИ25 с концентрацией 1 мг/мл в 0.5 M NaCl. Выдерживали при комнатной температуре, центрифугировали и отделяли несвязавшийся полимер. После нанесения нужного количества слоев полиэлектролитов проводили промывку бидистиллированной водой, далее центрифугировали (3000 об/мин) в течение 6 минут.
3. Разрушение и удаление карбонатной компоненты - “ядра”: для вымывания карбоната кальция из микрочастиц полученный осадок обрабатывали 0.1 H HCl. Эту процедуру проводили несколько раз до полного вымывания CaCO3 из микрочастиц.
В качестве разновидности минеральной матрицы использовали мезопористый SiO2, полученный темплатным способом. В качестве темплата использованы мицеллярные и жидкокристаллические растворы катионного ПАВ ЦТАБ, в качестве кремниевой компоненты – тетраэтоксисилан (ТЭОС). Образцы охарактеризованы комплексом методов, включая электронную микроскопию высокого разрешения (сканирующую и просвечивающую), ИК-спектроскопию, определены объем пор по бензолу (1.63 см3/г), удельная поверхность по толуолу (730 м2/г), предельный адсорбционный объем по парам воды (пористость 0.093 кг/м3).
Вторая методика:
К 8 мл водного раствора ЦТАБ с концентрацией 0.01 М при интенсивном перемешивании (1000 об/мин) прикапывали 0.78 мл спиртового раствора ПНФЛ с концентрацией 0.01 М. Полученную суспензию центрифугировали в течение 15 минут (8000 об/мин), таким образом, отделяя образовавшийся осадок. Далее к этому осадку добавляли 8 мл ПАК с концентрацией 1мг/мл, и ресуспендировали путем интенсивного перемешивания в течение 5 мин. Затем повторяли процедуру центрифугирования и отделяли осадок. Такую же операцию проводили с ПЭИ: к осадку добавляли 8 мл раствора ПЭИ с концентрацией 1мг/мл, интенсивно перемешивали и центрифугировали. В ходе синтеза поддерживали определенное значение рН раствора добавлением кислоты или щелочи. В зависимости от поставленной задачи наносили 3, 5 или 7 слоев полиэлектролитов. После осаждения последнего нанесенного слоя (ПАК) отделяли осадок и добавляли 4 мл бидистиллированной воды для проведения дальнейших экспериментов и хранения.
Третья методика:
К 8 мл водного раствора ПАК с концентрацией 1мг/мл при интенсивном перемешивании (1200 об/мин) добавляли 0.08 мл спиртового раствора ПНФЛ (0.01М). Полученную суспензию центрифугировали в течение 15 мин (13000 об/мин), растворитель отделяли. К осадку добавляли водный раствор ПАК (1мг/мл) и смесь выдерживали 3-5 мин. Для получения монодисперсных систем реакционную смесь погружали на 30-40 минут в ультразвуковую ванну (Elmasonic S 15 Н; рабочая частота 35 кГц). Затем полученную суспензию вновь центрифугировали (15 мин, 13000 об/мин), осадок отделяли, и повторяли эту процедуру для нанесения слоя ПЭИ. После адсорбции заданного числа полиэлектролитных слоев микрочастицы промывали дистиллированной водой и отделяли их центрифугированием (6 мин, 3000 об/мин).
Клетки кишечной палочки Nova Blue выращивали в бульоне Луриа -Бертани до оптической плотности 0.4-0.5. Получение компетентных клеток и электропорация были выполнены стандартными методами [173]. Компетентные клетки до использования хранили при температуре -70С. Замороженные клетки оттаивали и тотчас же использовали в процедуре трансформации. Для определения эффективности трансформации, 10 нг плазмидной ДНК (рК18, 2661 пар оснований) инкубировали с добавлением различных концентраций ПАВ (соотношение азот/фосфор, N/P, составила 1; 5; 10 соответственно). Полученные данные сравнивали с эталонным образцом. В качестве контроля использовали колониеобразующие единицы (КОЕ) на мкг вектора ДНК без ПАВ, которая принимается за единицу.
В диссертационной работе проводили расчет погрешности экспериментов. Абсолютную погрешность і-того измерения 5хд рассчитывали по формуле: 5хд= ХІ-Х (2.9), где Х - среднеарифметическое значение измеряемой величины: Х = (]Гх;)/п (2.10), І=І где п - число измерений. Относительную погрешность і-того измерения 5гд оценивали по формуле: 5ГД=5ХД/Х (2.11). На рис. 2.3-2.6 приведены в качестве примера концентрационные зависимости поверхностного натяжения, удельной электропроводности, оптической плотности, размеров растворов бинарных системы 16-6-16 - ПАК, 16-6-16 (ОН) - ПАК и 16-12-16(ОН)/рК18, на которых показаны доверительные интервалы экспериментально определенных величин. Число измерений варьировалось от 5 до 10.
Самоорганизация в системах на основе гемиальных ПАВ и природных полианинов
Как отмечалось в литературном обзоре (Глава 1) самоорганизующиеся системы на основе амфифильных соединений привлекают внимание исследователей благодаря их применению в современных биотехнологиях в качестве наноконтейнеров для лекарственных средств и генного материала. Особый интерес вызывают катионные ПАВ, что обусловлено их высоким сродством к отрицательно заряженным фрагментам нуклеотидных оснований ДНК. Эффективность трансфекции ДНК значительно возрастает при переходе от монокатионных ПАВ к их геминальным аналогам, которые вызывают все больший интерес в качестве синтетических переносчиков ДНК – так называемых невирусных векторов. При комплексообразовании ПАВ-нуклеиновые кислоты происходит нейтрализация заряда фосфатных групп, что сопровождается уменьшением эффективного размера ДНК за счет сворачивания макромолекул. Среди дикатионных ПАВ наиболее исследована серия типичных геминальных ПАВ m-s-m типа, где m и s – число атомов углерода в алкильных радикалах, связанных с головными группами ПАВ, и в спейсере, соответственно. Мало изученным аспектом является влияние структуры ПАВ на эффективность взаимодействия. Поэтому в качестве объектов исследования нами были выбраны гидроксиалкилированные геминальные ПАВ 16-6-16(ОН), 16-4-16(ОН) и 16-12-16(ОН), а в качестве соединения сравнения использован их монокатионный аналог - цетилгидроксиэтилдиметиламмоний бромид (ЦГАБ) (рис. 3.29) [189,190]. Поскольку молекула ДНК имеет сложную структуру, предварительные исследования проводили на более простой модельной системе с использованием декамера ДНК (олигонуклеотида). В дальнейшем полученные знания о взаимодействии олигонуклеотида с ПАВ могут быть применены для объяснения процессов взаимодействия ПАВ с ДНК. Нами был выбран двухцепочечный олигонуклеотид, состоящий из десяти пар оснований в каждой цепи -GCGTTAACGC (ONu).
Согласно анализу публикаций в литературном обзоре (Глава 1), взаимодействие катионных ПАВ с нуклеиновыми кислотами во многом определяется агрегационными свойствами ПАВ. Нам удалось найти лишь две статьи, посвященные исследованию самоорганизации гидроксиалкильных геминальных ПАВ с тетраметиленовым и гексаметиленовым спейсерными фрагментами [191, 192]. Поэтому в рамках диссертационной работы было проведено исследование агрегации гидроксиэтилированных геминальных ПАВ типа 16-s-16(OH).
Агрегация геминальных ПАВ типа m-s-m в водных растворах широко исследована [193]. Показано, что природа спейсера влияет как на значение ККМ, так и на морфологию агрегатов [194]. Известно, что значения ККМ для геминальных ПАВ типа m-s-m, имеют максимум при s = 4-6, в то время как числа агрегации снижаются с увеличением длины спейсера [195]. Для этандиилового спейсера, был выявлен переход от сферы к стержню [195], что, вероятно, связано с увеличением степени связывания противоиона и дегидратации головных групп. В отличие от них, очень мало информации для их гидроксиэтилированных аналогов [196, 197].
Для изучения агрегационного поведения серии геминальных ПАВ 16 -16 (ОН) были привлечены различные методы. Первичная информация, полученная методом тензиометрии, приведена на рис. 3.30. Литературное значение ККМ 1.8 JLI М [196] для 16-4-16 (ОН) согласуется с тензиометрическим значением ККМ (таблица 3.7). В то же время наблюдается некоторое снижение ККМ [196] по сравнению с данными, полученными методом тензиометрии.
Одним из наиболее чувствительных методов исследования агрегации ПАВ является метод флуоресцентной спектроскопии. На рис. П1-ПЗ (Приложение) представлены спектры флуоресценции пирена в присутствии катионных ПАВ. На рис. 3.31 показано соотношение интенсивностей первого и третьего пиков (I1/I3) пирена от концентрации ПАВ. Резкое снижение соотношения I1/I3 отражает снижение полярности микроокружения зонда. Значения ККМ, полученные по флуориметрии ниже, чем по тензиометрии, причем длина спейсера оказывает незначительное влияние на мицеллообразующую способность.
Числа агрегации рассчитываются с помощью уравнения 2.9 (рис. 3.32) и равны 7, 2 и 1,8 для s = 4, 6 и 12 соответственно при концентрациях не превышающих ККМ. Хотя существуют и значения N намного выше [196], эти результаты не противоречат литературным данным, так как были использованы концентрации значительно выше ККМ, например, N = 420 и 170 были получены для 16-4-16 (OH) и 16 -6-16 (ОН) при концентрации 50 мМ. Кроме того, методом флуоресцентной спектроскопии, который очень чувствителен к микроокружению зонда, могут быть обнаружены не только мицеллы, но и предмицеллярные агрегаты, о которых говорится в работе [198].
Метод синтеза полиэлектролитных капсул, включающий предварительную солюбилизацию субстрата амфифильными cоединениями
Для формирования полиэлектролитной оболочки нами использована технология «layer-by-layer» (LbL). В основе этого метода лежит принцип ступенчатого нанесения противоположно заряженных полиэлектролитов на дисперсные частицы.
При разработке и оптимизации протокола в качестве материала для оболочки были выбраны полиакриловая кислота (ПАК) и полиэтиленимин (ПЭИ). Выбор именно этих полиэлектролитов обусловлен тем, что они содержат группы, способные к кислотно-основным взаимодействиям в водных растворах. В роли капсулируемых веществ использованы п-нитрофениловые эфиры карбоновых кислот: капринат (ПНФК), лаурат (ПНФЛ), миристат (ПНФМ). Структура этих соединений, в частности, присутствие хорошей уходящей группы, позволяет использовать их в качестве спектральных зондов и количественно следить за изменением концентрации эфиров на различных этапах получения и использования капсул, а также контролировать изменение реакционной способности в свободном и капсулированном виде. С целью придания нейтральной молекуле заряда и увеличения сродства к полиэлектролитам была проведена стадия предварительной солюбилизации субстрата мицеллами катионного ПАВ - цетилтриметиламмоний бромида (ЦТАБ).
Протокол синтеза полиэлектролитных капсул.
Нами предложен оригинальный метод инкапсулирования низкомолекулярных незаряженных субстратов, а также разработана методика контроля процесса его высвобождения [209]. В основе разработки лежит большая информационная база, сформированная в работах нашей группы, по исследованию реакций нуклеофильного замещения в п-нитрофениловых эфирах карбоновых кислот в водных и мицеллярных средах. Использование их в качестве инкапсулируемых субстратов делает возможным контролировать их выход из капсул путем быстрого разложения в объемной фазе и спектрофотометрического контроля окрашенного продукта разложения – п-нитрофенолят-аниона. Знание факторов, контролирующих реакционную способность эфиров (рН, добавки ПАВ в нужной концентрации) позволяет создать условия для быстрого протекания гидролиза, при которых лимитирующей стадией становится диффузия субстрата через стенки капсул. Процесс инкапсулирования субстрата схематически изображен на рис. 3.52.
Количество инкапсулированного эфира контролировали с помощью метода спектрофотометрии по разнице между начальным количеством субстрата и тем, что остается в растворе после каждой процедуры осаждения. Было установлено, что в растворе после завершения первого этапа остается около 19% несолюбилизированного субстрата (ЭКК@ЦТАБ), а около 1-2% субстрата теряется в процессе полиэлектролитного осаждения. Всего около 23% субстрата остается в собранной надосадочной жидкости после 3-х циклов осаждения.
Одной из проблем в области инкапсулирования является определение факторов, контролирующих процесс высвобождения субстратов, и умение управлять ими. Поэтому в рамках работы нами исследовано влияние рН раствора, количества полиэлектролитных слоев, обработки ультразвуком.
Оптимизациия рН раствора полиэлектролитов при создании капсул
Эффективность взаимодействия полиэлектролитов в процессе формирования оболочки в основном зависит от их электростатического притяжения и увеличивается с возрастанием плотности заряда поликатиона и полианиона. Поскольку оба полиэлектролита проявляют рН-зависимые свойства, значение рН раствора может контролировать плотность заряда макромолекул. Выбор оптимального значения рН раствора для обеспечения высокой доли протонированных аминогрупп полиэтиленимина (ПЭИ) и диссоциированных карбоксильных групп полиакриловой кислоты (ПАК) осуществляли путем потенциометрического титрования полиэлектролитных растворов.
На рис. 3.53 видно, что при изменении рН от 6 до 8 содержание анионной формы ПАК меняется от 50 до 90%, тогда как содержание катионной формы ПЭИ варьируется от 40 до 80%. Между полиэлектролитными слоями в таких случаях наблюдается более сильное электростатическое взаимодействие, поэтому осаждение полиэлектролитов проводили в указанном диапазоне рН.
Следует отметить, что ЦТАБ практически не оказывает влияния на кислотно-основные свойства ПЭИ, а ПАК при рН 6 диссоциирует, образуя анионную форму, что может привести к образованию нерастворимого комплекса с катионным ПАВ. Поэтому на каждом этапе осаждения проводили тщательное удаление осадка путем центрифугирования.
Размер и дзета – потенциал полученных капсул.
Значения дзета - потенциала, фиксируемые в процессе формирования трехслойных капсул путем последовательного наслаивания полиэлектролитов.
С точки зрения мониторинга процесса создания капсул можно выделить два основных параметра - дзета-потенциал и размер. Дисперсные частицы субстрата, обработанные катионным ПАВ (ПНФЛ @ ЦТАБ) несут положительный заряд, поэтому процесс осаждения слоев начинается с противоположно заряженного полиэлектролита, ПАК. Рис. 3.54 иллюстрирует данные по изменению дзета-потенциала при инкапсулировании ПНФЛ в зависимости от количества слоев. Четко прослеживается перезарядка системы при нанесении противоположно заряженных слоев ПАК и ПЭИ, что является доказательством успешного процесса послойной адсорбции.
![Электрохимический электронный перенос и индуцированные им процессы в системах на основе n-сульфонатных (тиа)каликс[4]аренов и ионов (комплексов) металлов](/i/i/4393/484554.png "Электрохимический электронный перенос и индуцированные им процессы в системах на основе n-сульфонатных (тиа)каликс[4]аренов и ионов (комплексов) металлов Степанов, Алексей Степанович")
