Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 12
1.1. Люминесценция лантанидов 12
1.2. Механизмы переключения люминесценции комплексов лантанидов 14
1.2.1. Определение металлов 17
1.2.2. Флуоресцентное определение анионов .20
1.2.3. Определение органических молекул 23
1.3. Люминесцентные наночастицы 24
1.3.1. Силикатные наночастицы 25
1.3.2. Полиэлектролитные наночастицы 32
Постановка задачи 36
2. Экспериментальная часть 38
2.1. Объекты исследования .38
2.2. Методы исследования 40
2.3. Условия проведения эксперимента 41
2.3.1. Количественное определение аминогрупп на поверхности AEPTS-SiO2/Tb-TCAS 42
2.3.2. Определение концентрации силикатных частиц 43
2.3.3. Эмиссионная спектроскопия 43
2.3.4. Измерение времён жизни возбужденного состояния .44
2.3.5. Метод динамического рассеяния света 44
2.3.6. ИК-спектры 45
3. Обсуждение результатов 46
3.1. Силикатные наночастицы 46
3.1.1. Модификация поверхности SiO2/Tb-TCAS
аминогруппами .46
3.1.2. Тушение люминесценции силикатных наночастиц переходными металлами 49
3.1.3. Эффект EDTA2- на переключение люминесценции в системе SiO2/Tb-TCAS в присутствии ионов переходных металлов .59
3.1.4. Влияние комплексообразующей способности AMP, ADP, ATP на переключение люминесценции SiO2/Tb-TCAS в присутствии Fe3+ 63
3.1.5. Влияние заряда комплекса с Fe3+ на люминесцентный отклик AEPTS-SiO2/Tb-TCAS 66
3.2. Полиэлектролитные наночастицы 70
3.2.1. Лигандный обмен 70
3.2.2. Лигандный обмен и образование смешаннолигандного комплекса в коллоидах 76
3.2.3. Люминесцентное определение фторхинолонов в PSS-[Eu(TTA)3PhO] коллоидах 84
Основные результаты и выводы 86
Список литературы
- Механизмы переключения люминесценции комплексов лантанидов
- Определение органических молекул
- Количественное определение аминогрупп на поверхности AEPTS-SiO2/Tb-TCAS
- Тушение люминесценции силикатных наночастиц переходными металлами
Механизмы переключения люминесценции комплексов лантанидов
Лиганд поглощает подаваемый квант света и переходит из основного в возбуждённое синглетное состояние 1S . Далее происходит переход (k1) в возбуждённое триплетное состояние молекулы лиганда. Этот переход запрещён по спину. Однако в присутствии тяжёлых металлов, которыми являются и лантаниды, переход 1S 3T облегчён. С триплетного возбуждённого уровня антенны происходит перенос энергии на излучающие уровни лантанидов (k2) [5]. Перенос энергии на уровни лантанида может осуществляться и через синглетные состояния лиганда (k3). Однако, время жизни возбужденного синглетного состояния (1S ) мало, этот процесс в большинстве случаев является неэффективным.
По сравнению с малым временем жизни возбужденного состояния органических люминофоров (порядка наносекунд), значительно большие аналогичные величины для ионов лантанидов (милли- и микросекунды) позволяют минимизировать соотношение силнал/шум в присутствии биомолекул с собственной флуоресценцией [6]. Спектры люминесценции Ln3+, как правило, хорошо разрешены и характеристичны для каждого иона лантанида. Например, основные эмиссионные пики Tb3+, обусловленные переходами 7F55D4 и 7F45D5 не перекрываются с пиками Eu3+ . Кроме того, благодаря тому, что внутренние орбитали практически не зависят от внешних факторов, полосы эмиссии имеют узкую ширину (порядка 20 нм). Это придаёт лантанидам дополнительное преимущество для получения многоцветного излучения [7]. Большой стоксов сдвиг и высокий квантовый выход делает лантаниды хорошей платформой для разработки люминесцентных зондов в биологии и медицине [7-14].
Механизмы переключения люминесценции комплексов лантанидов Принцип работы большинства люминесцентных сенсоров основан на переключении люминесцентного сигнала системы. Для лучшего понимания этих процессов рассмотрим механизмы и закономерности переключения люминесценции. Способы переключения люминесценции делятся на два основных типа - это статический механизм и механизм переноса энергии [15].
Механизм переноса энергии, так же известный как Фёрстеровский механизм, не является излучательным процессом. Это процесс, при котором энергия от донора (люминофора) в возбуждённом состоянии переходит к акцептору, находящемуся в основном состоянии, через безызлучательное диполь-дипольное взаимодействие[16].
Д + A Д + A Перенос энергии происходит эффективно, если энергия возбужденного состояния А меньше энергии Д . Кроме того на процесс переноса влияет расстояние между донором и акцептором. Для заметного переноса необходимо, что бы расстояние было не более 10 нм [17].
Особенность комплексов лантанидов в отличие от большинства других люминофоров - это возможность переключения люминесценции за счёт статического механизма. Люминофоры на основе лантанидов представляют собой систему лантанид-лиганд (эмиттер-антенна). При разрушении или изменении состава комплекса лантанид-лиганд происходит переключение люминесценции. Один из подходов к люминесцентному определению субстратов основан на статическом механизме. В качестве субстратов могут быть два типа веществ: -ионы металлов, которые способны вытеснять лантанид из его комплекса. В данном случае будет наблюдаться исключительно тушение люминесценции. -молекулы, которые способны связаться с лантанидом. В данном случае может происходить, как сенсибилизация (определяемая молекула служит дополнительной антенной), так и тушение (определяемая молекула вытесняет уже существующую антенну).
Для анализа характеристик и механизмов переключения люминесценции часто применяется уравнение Штерна-Фольмера и его графическое изображение [15]. Для динамического тушения оно имеет вид: I0/I = 1 + kq0[Q] = 1 + Kдин[Q], (1) а для статического: I0/I = 1 + Kст[Q], (2) где I0 и I – интенсивности люминесценции соответственно в отсутствии и присутствии тушителя; kq – бимолекулярная константа скорости тушения; 0 – время затухания люминесценции в отсутствии тушителя; [Q] – концентрация тушителя; Kдин= kq0 и Kст = ([F0] – [F])/([F][Q]) – Штерн-Фольмеровские константы тушения; [F] – концентрация люминофора [15].
Зависимости I0/I от [Q] линейны в рамках обоих расмотренных механизмов (рис. 3а). График даёт отсекаемый отрезок по оси y, равный единице, и наклон, равный Kдин или Kст. Выявить преобладание динамического или статического механизмов можно сопоставлением зависимостей 0/ и 10/1 от [Q]. В случае преобладания механизма динамического тушения 0/ = Io/I, а в случае статического о/ = 1. Т.е. если линейная зависимость 10/1 от [Q] совпадает с 0/ от [Q] (рис. 3б), можно с уверенностью сказать, что тушение происходит только по динамическому механизму. Если не изменяется, то тушение - статическое. В случае, когда реализуются оба механизма тушения, то зависимости 10/1 и 0/ от [Q] выглядят следующим образом, как показано на рисунке 3б [15].
Определение органических молекул
Способ получения таких наночастиц получил название «layer by layer» (LbL). LbL – способ изготовления тонкой плёнки полиэлетролитов. Плёнка образуются путём нанесения чередующихся слоёв противоположно заряженных полиэлектролитов на темплат. Впервые данный подход был реализован Айлером в 1966 году [89], но не приобрел сразу популярность. В последствии Дичером данный метод был доработан [90-92]. Простота метода и возможность использование разнообразных полиэлектролитов вызвали интерес к данным объектам. На рисунке 17 представлена схема получения наночастиц с полиэлектролитными оболочками. Рисунок 17. Образование полиэлектррлитной оболочки вокруг темплата посредством послойной адсорбции полиэлектролитов.
Главная из движущих сил – электростатическое взаимодействие. Первый этап – это адсорбция полиэлектролита на темплате, второй – последующая адсорбция на полиэлектролитном слое. Важно отметить, что утверждение о том, что электростатическое притяжение полиэлектролитов является единственной движущей силой неверно. Как было показано Котовым [93], в процессе образования слоев присутствуют и другие процессы помимо электростатических притяжений - это Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия и водородные связи. В обзоре Сухишвили [94] описано влияние различных факторов (pH, ионная сила, температура, свет, магнитное поле) на самосборку слоёв полиэлектролитов. В целом, в процессе образовании слоев полиэлектролитов участвуют различные взаимодействия, общий эффект которых приводит к созданию полислоев на поверхности темплатов.
В качестве темплатов для полиэлектролитных оболочек используются коллоидные частицы с диаметром от десятков нанометров [95] до десятков микрон [96]. Круг использованных коллоидных частиц разнообразен. Среди них латексные полистирольные частицы [97], неорганические карбонатные матрицы [98], кристаллы органических красителей [99, 100], микроагрегаты ДНК [101].
Основное использование полиэлектролитных оболочек – контейнеры для доставки лекарств [102]. Для получения контейнера используют растворимый темплат, вместо которого можно загружать лекарства. Ещё одной областью применения является сенсорика. Введение различных люминофоров делает их привлекательными в биоанализе [103-106]. Крефтом [107] были разработаны pH-сенсоры представляющие собой pH чувствительные люминофоры введённые в полимерные капсулы. Эти наночастицы использовали для мониторинга локального pH внутри клетки. Первая попытка объединить полиэлектролитные капсулы и комплексы лантанидов в качестве люминофоров была предпринята в 2006 году [108]. В качестве люминофора авторы использовали комплекс Eu(DBM)3 (DBM-дибензоилметан). Люминофор вводился между слоями полиэлектролитов.
Годом позже был представлен ещё один пример полиэлектролитных наночастиц содержащих комплекс [Eu(DBM)3Phen] [109, 110]. Эти наночастицы были получены с использованием меламинформальдегидного ядра, в то время как люминесцентный комплекс включался между слоями полиэлектролитов.
В нашей лаборатории были получены полиэлектролитные наночастицы, где впервые в качестве ядра использовался комплекс Eu3+. Наночастицы с морфологией ядро/оболочка, в отличии от двух предыдущих примеров, где люминесцентные комплексы вводились в полиэлектролитные слои, позволяют свести к минимум высвобождение люминофора. В качестве люминофра был выбран Eu(TTA)3Ph, где TTA – теноилтрифторацетилацетонат, Ph - фосфиноксид. Выбор такого комплекса был обусловлен лёгкостью синтеза [111] и уникальными фотофизическими свойствами данных комплексов, которые нашли широкое применение в разработке сенсоров и маркеров [112]. Дополнительным преимуществом данного комплекса заключается в возможности повышения эффективности люминесценции за счет варьирования структуры дополнительного лиганда. В качестве дополнительной антенны были выбраны производные фосфиноксидов. Введение производных фосфиноксидов, в качестве дополнительного лиганда позволяет получать более эффективную люминесценцию [113, 114]. В нашей лаборатории был выявлен фосфиноксид, способствующий наиболее эффективной люминесценции Eu3+. Было доказано, что на твёрдые темплаты, образованные переосаждением из Рисунок 18. ТЭМ микрофотография PSS-PEI-PSS [Eu(TTA)3PhO] органического раствора в водный данных комплексов эффективно поочерёдно наматываются 5 слоёв полиэлектролитов (PSS, PEI). Люминесценция наночастиц возрастала от первого слоя (PSS) ко второму, при последующем увеличении количестве слоёв люминесценция не возрастала. Размер трёх-слойных наночастиц по данным ТЭМ составлял 80 нм (рис. 18).
Количественное определение аминогрупп на поверхности AEPTS-SiO2/Tb-TCAS
Однако, тушение комплексов TbCAS в составе силикатных наночастиц происходит не только по динамическому, но и по статическому механизмам. Вклад последнего механизма обусловлен проницаемостью силикатной матрицы для ионов и молекул. В результате происходит ионный обмен люминесцентных ионов тербия (в наночастицах) на нелюминесцентные ионы металлов (в растворе). Сопоставление данных по убыванию интенсивности люминесценции, а именно по изменению величины 1Яо (рис. 33), где I и 10 интенсивности люминесценции наночастиц в растворе соли металла и в воде, с данными по убыванию времени жизни возбужденного состояния (рис. 32) позволяет оценить соотношение вкладов статического и динамического механизмов тушения люминесценции. 1,1
Нековалентный подход, суть которого сводится к адсорбции и последующей само-организации положительно заряженных ПАВ и полиэлектролитов на поверхности наночастиц, является удобным и результативным методом их поверхностной модификации. Действительно, силикатные наночастицы, нековалентно модифицированные PEI, по данным электрокинетического потенциала имеют незначительное отличие от амино-модифицированных с помощью 3-[2-(2-аминоэтиламино)этиламино]-пропилтриметоксисилана наночастиц (рис. 22). Однако эксперименты по тушению люминесценции ковалентно и нековалентно модифицированных силикатных наночастиц, характеризующихся одинаковым распределением люминофоров в объеме и одинаковым размером, существенно различаются.
В частности наблюдается увеличение доли статического механизма по сравнению с динамическим при тушении люминесценции наночастиц, функционализированных полиэтиленимином, ионами металлов (рис. 34, 35). 5,6,7 4
Причиной уменьшения вклада динамического механизма в тушение люминесценции при переходе от ковалентно к нековалентно модифицированным наночастицам является увеличение расстояния от ионов тушителей до люминофоров вследствие образования объемного слоя ПЭИ. В то же время слой РЕІ более проницаем, чем ковалентно сформированный за счет полимеризации 3-[2-(2-аминоэтиламино)этиламино] пропилтриметоксисилана, что является причиной увеличения вклада статического механизма. 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6
Благодаря наличию аминогрупп на поверхности наночастиц ионом, оказывающим наибольший эффект тушения, оказался ион меди. Это объясняется наибольшим сродством данного катиона среди изученных к аминогруппам. Эффект EDTA2- на переключение люминесценции в системе Si02/TbCAS в присутствии ионов переходных металлов
Как уже отмечалось выше, предпосылкой тушения люминесценции комплексов TbCAS внутри силикатных наночастиц является связывание ионов переходных металлов силикатной поверхностью. Важно отметить, что часть катионов металлов связаных поверхностью наночастиц проникает внутрь наночастицы и тушат люминесценцию статически посредством ионного обмена. Катионы, связанные донорными группами на поверхности тушат люминесценцию динамически за счет переноса энергии. Эффективность переноса энергии зависит от расстояния и может происходить на расстоянии до 10 нм (сопоставимо с размерами наночастиц – 35-40 нм). Снятие металлов с поверхности хелатирующим анионом EDTA2 должно происходить, если динамический механизм является доминирующим. Однако, восстановление люминесценции наночастиц происходит не полностью в узком интервале концентраций хелатирующего аниона с дальнейшим выходом на предел (рис. 36, 37). Хелатирующие анионы EDTA2- могут связать только ионы металлов локализованых на поверхности наночастиц. Естественно, что при этом полностью восстанавливается величина времени жизни возбужденного состояния, что лишний раз доказывает, что именно ионы переходных металлов на поверхности наночастиц обуславливают динамический механизм тушения.
Так, например, при добавлении 5 M Fe3+ к немодифицированным наночастицам время жизни возбужденного состояния падает с 0,91 до 0,70 мс. При последующем добавлении Na2EDTA значение времени жизни снова становится 0,91 мс (за счет снятия Fe3+ с поверхности), что говорит об исчезновении вклада динамического тушения. При измерении электрокинетического потенциала, так же наблюдалось восстановление отрицательного заряда поверхности. Однако при удалении ионов железа с поверхности наночастиц интенсивность люминесценции восстанавливается до 75 % (рис. 36). Неполное восстановление интенсивности люминесценции вполне понятно, если учесть значительный вклад тушения по статическому механизму. В то же время по данным представленным на рисунке 29 статический механизм является доминирующим. Если считать ионный обмен, обусловлевающий реализацию статического механизма тушения, необратимым, то люминесценция Tb(III) комплексов после снятия ионов Fe(III) с поверхности должна восстанавливаться до 65 %. Однако, экспериментально наблюдаемое восстановление интенсивности люминесценции гораздо значительнее, а именно 75%.
Тушение люминесценции силикатных наночастиц переходными металлами
Изменение /0 при добавлении левофлоксацина (рис. 54) указывает на влияние полиэлектролитной оболочки на эффект антенны левофлоксацина. В случае PSS-[Eu(TTA)3PhO] коллоидов эффект дополнительной антенны левофлоксацина максимален (более значительный подъем /0). Для PSS-PEI-PSS-[Eu(TTA)3PhO] он становится меньше, а для PEI-PSS-[Eu(TTA)3PhO] совсем пропадает (рис. 52). Данная тенденция эффектов полиэлектролитов наблюдается для всех фторхинолонов, кроме моксифлоксацина и ломефлоксацина.
Таким образом, вид зависимости I/I0 определяется тем, как взаимодействует фторхинолон с люминесцентным комплексом. В случае образовании смешанолигандного комплекса, когда фторхинолон присоединяется к европию без вытеснения TTA, мы наблюдали увеличение I/I0. Например, для левофлоксацина, офлоксацина, дифлоксацина и перфлоксацина (0-50 М) в PSS-[Eu(TTA)3PhO] коллоидах (рис. 51). В то время как падение I/I0 происходит за счет связывание фторхинолона с вытеснением TTA (TTA более эффективная антенна, чем фторхинолоны). В частности, при добавлении ломефлоксацина и моксифлоксацина к любым коллоидам (рис. 49-51).
Результаты полученные в спиртово-ацетонитрильном растворе показывают, что эффект антенны фторхинолонов может быть усилен при использовании Eu(TTA)3 вместо [Eu(TTA)3PhO] (рис. 45). Мы провели исследования эффекта антенны фторхинолонов в PSS-Eu(TTA)3 коллоидах для сопоставления с PSS-[Eu(TTA)3PhO]. Eu(TTA)3 обладает меньшей интенсивностью люминесценции по сравнению с [Eu(TTA)3PhO]. Причиной является наличие PhO, который служит дополнительной антенной для люминесценции европия [144]. Данные представленные на рисунках 56-57 указывают, что сенсибилизация левофлоксацином как I/I0, так и /0 значительно более эффективная в случае PSS-Eu(TTA)3 (рис. 56), чем в случае PSS-[Eu(TTA)3PhO] (рис. 51). Эти данные дополнительно подтверждают образование смешенолигандного комплекса на поверхности наночастиц, в результате чего наблюдается сенсибилизация люминесценции за счет эффекта дополнительной антенны. Сенсибилизация люминесценции европия менее эффективная для ломефлоксацина (рис. 56) в концентрационном диапазоне (50-250 М). Таким образом, различные эффекты левофлоксацина и ломефлоксацина на сенсибилизацию люминесценции европия подтверждают, что образование смешанолигандного комплекса зависит от структуры фторхинолонов. Зависимость /0 PSS-Eu(TTA)3 (0,04 г/л) от концентрации левофлоксацина (1) и ломефлоксацина (2). На предыдущем этапе работы мы показали, что причиной дискриминации зависимостей I/I0 для одних и тех же коллоидов является структура фторхинолона. Присутствие карбоксильных и пиперазиновых групп в офлоксацине, левофлоксацине, перфлоксацине, дифлоксацине и ломефлоксацине, а так же пирролидино-пиперидиновых групп в моксифлоксацине определяют кислотно основное поведение фторхинолонов [155-158]. Кислотность карбоксильных групп и основность азотосодержащих колец приводит к образованию цвитер-ионных форм посредством внитримолекулярного переноса протона. Исследуемые фторхинолоны в водном растворе могут существовать в трёх формах: - катионная, цвитер-ионная и анионная (рис. 58)
Анализ литературы показал, что значение pKa2 пиперазиновых частей для офлоксацина, дифлоксацина, левофлоксацина и перфлоксацина лежит в пределах 7,9-8,2 [155, 156]. Для ломефлоксацина значение pKa2 несколько выше и составляет 9,0, а для моксифлоксацина значение pKa2 лежит в пределах 9,0-9,6 [157, 158]. Основность азотосодержащих колец значительно влияет на образования цвитерионных форм [159]. Возможно, именно это различие в кислотно-основных свойствах обуславливает сдвиг равновесия комплексообразования в сторону замещения TTA- на фторхинолоновые анионы, что определяет селективность флуоресцентного отклика наночастиц на данные фторхинолоны для коллоидов покрытых слоем PSS. Так же мы выяснили, что полиэлектролитная оболочка влияет на зависимости I/I0 от концентрации фторхинолонов. Для выяснения данной тенденции следует принять во внимание, что PEI имеет сродство к анионам вследствие основности аминогрупп [160, 161]. Связывание слоем PEI фторхинолонов приводит к увеличению концентрации последних вблизи люминесцентного ядра по сравнению с концентрацией в растворе. Связывание фторхинолонов слоем PEI сдвигает кислотно-основное равновесие фторхинолонов, что в свою очередь должно сказаться на процессе комплексообразования.
Зависимости I/I0 от концентрации левофлоксацина, офлоксацина, дифлоксацина и перфлоксацина в случае PSS-PEI-PSS-[Eu(TTA)3PhO] коллоидов лежат между аналогичными зависимостями для PEI-PSS- и PSS-покрытых коллоидах (рис. 51-53). Иными словами, внешний слой влияет на данные зависимости. Внешний слой PEI нивелирует разницу между фторхинолонами, благодаря основности PEI. В случае PSS-PEI-PSS-[Eu(TTA)3PhO] коллоидов PEI, будучи средним слоем, так же уменьшает разницу, но в меньшей степени. Причиной влияния PEI в PSS-PEI-PSS-коллоидах является, прежде всего, его разветвлённая структура. Данная тенденция так же отражает факт взаимопроникновения слоёв друг в друга.
На основании вышесказанного становится понятным причины нивелирования влияния структуры фторхинолонов на люминесцентный отклик люминесценции Eu(III) в коллоидах с PEI в качестве внешнего слоя.
