Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Литературный обзор 11
1.1. Крахмал - строение, состав, свойства 11
1.2. Дефекты в структурной организации нативных гранул крахмала 17
1.3. Отжиг крахмалов 20
1.4. Резистентные крахмалы 22
Заключение по литературному обзору 26
ГЛАВА II. Методическая часть 28
2.1. Материалы. 28
2.2. Методы исследования. 30
2.2.1.Высокочувствительная дифференциальная сканирующая калориметрия. 30
2.2.2. Диффереіщиальная сканирующая калориметрия 33
2.2.3. Световая микроскопия 33
2.2.4. Сканирующая электронная микроскопия 33
2.2.5. Рентгеновское рассеяние под большими углами 34
2.2.6. Малоугловое рентгеновское рассеяние 35
2.2.7. Ферментативный гидролиз резистентных крахмалов 39
ГЛАВА III. Экспериментальная часть. 41
3.1. Структура и термодинамические свойства пшеничных крахмалов с различным содержанием амилозы. 41
3.1.1. Морфологические и термодинамические исследования пшеничных крахмалов с различным содержанием амилозы 41
3.1.2. Исследование пшеничных крахмалов с различным содержанием амилозы методом рассеяния под малыми углами. Взаимосвязь структурных и термодинамических параметров . 50
3.2. Дефекты структурной организации ячменых крахмалов с различным содержанием амилозы. 58
3.2.1. Влияние температуры окружающей среды на структуру и термодинамические свойства ячменных крахмалов. 58
3.3. Влияние отжига на дефектность гранул крахмала на различных уровнях структурной организации. 71
3.3.1. Отжиг нормальных, амилопектиновых и высокоамилозных крахмалов, экстрагированных из ячменя, выращенного при различных условиях окрулсающей среды. 71
3.3.2. Отжиг нормальных и мутантных пшеничных крахмалов. Исследование методами световой и сканирующей электронной микроскопии, ДСК и рассеяния под малыми углами. 90
3.4. Структура и свойства энзимрезистентных пшеничных крахмалов 105
Общие выводы по работе 114
Литература
- Дефекты в структурной организации нативных гранул крахмала
- Резистентные крахмалы
- Диффереіщиальная сканирующая калориметрия
- Исследование пшеничных крахмалов с различным содержанием амилозы методом рассеяния под малыми углами. Взаимосвязь структурных и термодинамических параметров
Введение к работе
В настоящее время кукуруза, в том числе восковидная, пшеница, картофель и тапиока рассматриваются как основные источники для экстракции нативного крахмала в крахмалопаточной промышленности [1]. В Европе основными источниками для производства крахмала являются кукуруза, пшеница и картофель. Согласно данным на 1998 год [2], ежегодно перерабатывается 8.8х106 т картофеля, 5.9х106 т кукурузы и 4.4 хЮ6 пшеницы. При этом общее производство крахмала достигает 7.7x10 т, из которых 4.3х хЮ6 т потребляется различными отраслями пищевой промышленности, 3.4x106 т используется для непищевых целей, а именно при производстве бумаги и в картонажном производстве, а также при производстве адгезивных материалов. В 1998 году доля кукурузного, пшеничного и картофельного крахмала на Европейском рынке составляла 49%:29%:22%, соответственно [2]. К 2000 году производство основных видов крахмала практически осталось неизменным (46%:32%:22%), хотя необходимо отметить некоторое увеличение производства пшеничного крахмала и уменьшение производства кукурузного крахмала [3].
Широкое использование кукурузного крахмала на Европейском рынке обусловлено рядом причин:
генетическим разнообразием кукурузы, в сортах которой содержится крахмал с различным соотношением амилозы и амилопектина [4];
коммерческой значимостью не только основного продукта глубокой переработки кукурузы (крахмала), но и сопутствующих продуктов - масла и белка [2];
3. гарантированными поставками в Европу из США (около 50%) [1].
Принимая во внимание, что функциональные свойства крахмалов и,
соответственно, качество продуктов, получаемых на их основе, зависят от соотношения основных полисахаридов крахмала (амилозы и амилопектина), первый пункт является чрезвычайно важным при определении потенциала сорта того или иного сельскохозяйственного сырья как источника для
6 крахмалопаточной промышленности. Именно соотношение амилозы и амилопектина, конечно, наряду с другими характеристиками крахмала, определяет пути его использования и применения в различных отраслях народного хозяйства [5,6]. Так, например, если химически модифицированные крахмалы, получаемые из восковиднои кукурузы и содержащие 0-5% амилозы, применяются как загустители или стабилизаторы при производстве различных десертов, соусов, а также в целлюлозно-бумажной промышленности [2,5,6]; нормальные крахмалы, содержащие 24%-28% амилозы, широко используются при производстве сиропов, изоглюкозы или декстрозы, или применяются в качестве гелеобразователей [2], то высокоамилозные крахмалы используются как источник для производства энзимрезистентных крахмалов и получения биодеградирумых материалов [2,7]. В этом отношении потенциальным конкурентом кукурузы на Европейском рынке может рассматриваться крахмал гороха, который в зависимости от сорта может содержать от 4-10 % до 65-75% амилозы [8], а также крахмал ячменя, в мутантных линиях которого содержится от 0% до 40% амилозы [9, 10]. Ячмень является в мире четвертым, наиболее важным злаком после пшеницы, риса и кукурузы [11]
На сегодняшний день по разным причинам только крахмалы пшеницы и картофеля, а также ячменя могут в какой-то степени реально конкурировать с объемом производства кукурузного крахмала [8]. Увеличение производства картофельного и пшеничного, ячменного крахмалов сдерживалось именно из-за отсутствия сортов с генетически измененным соотношением амилозы и амилопектина. Но в середине 90-х годов прошлого века были выведены сорта картофеля и пшеницы, в крахмалах которых содержится от 0.2% до 1.3% амилозы [12-18], т.е. проблема получения генетически измененных амилопектиновых сортов этих культур была решена лишь частично, т.к. высокоамилозные сорта этих культур не получены до сих пор. Несмотря на это, полученные результаты дают возможность рассматривать картофель и пшеницу, а также ячмень, как
экспортозамещающее для многих стран Европы и, в частности для России, сырьё для использования в крахмалопаточной промышленности, в противовес перерабатываемой кукурузе. В пользу этого положения свидетельствует ряд факторов: во-первых, традиции, существующие в перерабатывающей промышленности Европы, для которой пшеница и картофель являются традиционным селькохозяйственным сырьём; во-вторых, увеличение производства пшеницы в Европе [19], в-третьих, коммерческая значимость клейковины, получаемой в результате глубокой переработки пшеницы [8, 16, 20]. Кроме того, исследования показали [12, 14-18, 21], что функциональные свойства крахмалов пшеницы и картофеля с низким содержанием амилозы не уступают соответствующим крахмалам кукурузы.
Анализ опубликованных данных, касающийся сортовых особенностей пшеницы, обычно выращиваемой в различных странах мира, показал, что содержание амилозы в крахмалах пшеницы составляет 24-28% [1, 22]. Это положение было подтверждено исследованиями крахмалов озимых и яровых сортов пшеницы отечественной селекции [23].
Согласно [19], чтобы оценить свойства крахмалсодержащего сырья как потенциального источника для выделения крахмала и сопутствующих продуктов переработки, необходимо определить не только их химический состав, но и технологические параметры, обусловливающие качество готовой продукции.
В настоящее время Российская крахмалопаточная промышленность ориентирована на два вида сырья: картофель и кукурузу, хотя оба вида обладают существенными недостатками, а именно: переработка картофеля носит сезонный характер (2-3 месяца в году), что обуславливает низкий коэффициент использования основных фондов; посевные площади товарной кукурузы незначительны, ее возделывание сосредоточено в основном на юге России, вследствие чего предприятия вынуждены перерабатывать
импортную кукурузу, что снижает рентабельность производства крахмала
[10].
Принимая во внимание выше изложенное, оценка свойств пшеницы и ячменя как источников для крахмалопаточнои промышленности является актуальной как для Европы в целом, так и для России в частности. Однако, несмотря на то, что доля зернового сырья для крахмалопаточнои промышленности увеличивается, требования к свойствам пшеницы, а также ячменя как к источникам крахмала для промышленной переработки еще не сформулированы.
Цели и задачи работы
Цель работы состояла в определении роли дефектов в структурной организации нативных гранул пшеничных и ячменных крахмалов с различным содержанием амилозы и взаимосвязи между их структурой и термодинамическими свойствами. Использование в работе крахмалов, экстрагированных из растений, выращенных при различных условиях окружающей среды, применение различных физико-химических представлений и моделей, обычно используемых для описания структуры и термодинамических свойств частично-кристаллических синтетических полимеров, дает возможность проследить взаимосвязь структуры и термодинамических свойств исследованных крахмалов. Для решения практических задач, связанных с получением продуктов питания лечебно-профилактического действия, были исследованы процессы образования и свойства энзимрезистентных крахмалов.
Для достижения вышеуказанных целей были поставлены следующие задачи:
1. Определить структуру и термодинамические свойства пшеничных крахмалов с различным содержанием амилозы.
2. Оценить дефектность структурной организации ячменых крахмалов с различным содержанием амилозы.
3. Определить влияние отжига на дефектность гранул крахмала на
различных уровнях структурной организации.
4. Определить возможность образования энзимрезистентных крахмалов
из высокоамилозных пшеничных крахмалов.
Научная новизна Оценены размеры надмолекулярных структур на различных уровнях макромолекулярнои организации полисахаридов пшеничных и ячменных крахмалов с различным содержанием амилозы. Впервые установлено, что увеличение содержание амилозы приводит к увеличение толщины частично кристаллических колец роста от 182 нм до 312 нм, тогда как толщина амилопектиновых кластеров и кристаллических ламелей как для пшеничных, так и для ячменных крахмалов остается неизменной. Впервые показано, что существенный вклад в термодинамические параметры плавления исследуемых крахмалов вносят дефекты, а именно: амилозные проходные цепи, молекулярно упорядоченные структуры, содержание которых увеличивается как при увеличении содержания амилозы в крахмалах, так и при уменьшении температуры окружающей среды при росте растений. Установлено, что отжиг высокоамилозных крахмалов, независимо от источника их выделения, приводит к увеличению размеров кристаллических ламелей, в то время как для амилопектиновых крахмалов эти размеры остаются неизменными. Показано, что отжиг исследуемых крахмалов приводит к уменьшению содержания дефектов в нативных гранулах, располагающихся как в кристаллической, так и в аморфных ламелях. Установлено, что циклическая обработка (нагрев-охлаждение) водных дисперсий высокоамилозного пшеничного крахмала приводит к образованию крахмалов, которые рядом физико-химических методов (ДСК, малоугловое и широкоугловое рентгеновское рассеяние), а также методом ферментативного гидролиза, охарактеризованы как резистентные крахмалы III типа.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены: 1. Пятнадцатые международные Плехановские чтения, апрель, 2002 г.; 2. Вторая ежегодная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗЫ «Биохимическая физика», май, 2002 г.; 3. XI Международная конференция по крахмалу Москва-Краков, Москва, 17-19 июня, 2003 г.; 4. «X International Starch Convention», Cracow (Poland), June 12-14, 2002; 5. Международная научно-техническая конференция "Разработка и производство продуктов функционального питания, инновационные технологии конструирование оборудования для переработки сельхозсырья, культура питания населения Украины", Украина (Киев), 21-23 октября, 2003 г.; 6. «XII International Starch Convention Cracow-Moscow», Cracow (Poland), June 14-17, 2004; 7. Четвертая ежегодная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗЫ «Биохимическая физика», октябрь, 2004г.; 8. «XIII International Starch Convention, Moscow-Cracow», Moscow (Russia), June 21-23, 2005.
По материалам диссертации опубликовано 19 печатных работ, из них 1 обзор, 8 статей в отечественных и зарубежных журналах и 10 тезисов в сборниках трудов научных конференций.
Дефекты в структурной организации нативных гранул крахмала
В настоящее время хорошо известно, что процессы структурного образования гранул крахмала в ходе биосинтеза растений сопровождаются накоплением дефектов в различных упорядоченных структурах крахмала [59,69,70,75,76]. Такими дефектами могут быть проходные цепи амилозы, амилопектиновые В-цепи, молекулярно упорядоченные структуры, т.е. двойные спирали А-цепей амилопектина, расположенные в кристаллической ламели, но не участвующие в образовании кристаллитов крахмала [59,69,70,75,76]. Известно, что отжиг частично-кристаллических синтетических полимеров приводит к формированию более совершенных структур, что сопровождается повышением температуры плавления и сужением пика плавления по сравнению с неотожженными образцами. Согласно полимерной теории [63], эти явления могут быть вызваны, как минимум, двумя взаимосвязанными причинами, а именно: уменьшением степени распределения гранул по размерам и/или увеличением кооперативной единицы плавления кристаллитов. Те же эффекты (повышение температуры плавления и сужение пика плавления) обычно наблюдаются при отжиге разбавленных водных дисперсий крахмала при температуре немного ниже начальной температуры плавления крахмала [77-79]. Тем не менее, в отличие от синтетических полимеров, точный молекулярный механизм отжига крахмала все еще остается неизвестным, хотя в настоящее время осуществляются интенсивные попытки решения этой проблемы.
Отжиг практически не изменяет характер рентгенографических проявлений и размер амилопектиновых кластеров в нормальных пшеничных и картофельных крахмалах [80-83]. Предложенные объяснения влияния отжига на термодинамические свойства обычно включают гипотезу, касающуюся увеличения стабильности гранулы и реорганизации гранулярной структуры [77-79]. Предполагается также, что при отжиге совершенствуется главным образом структура кристаллической ламели, т.е. происходит оптимизация кристаллического порядка [77-79]. Действительно, Nakazawa и Wang [84] наблюдали более длинные цепи в Naegeli декстринах отожженных крахмалов по сравнению с нативными крахмалами. Кроме того, опубликованные недавно данные относительно отжига нормального картофельного крахмала [85] и крахмалов сладкого картофеля [86], т.е. крахмалов с разными полиморфными структурами, показали, что значительное увеличение температур плавления в процессе отжига сопровождается, как правило, небольшим увеличением энтальпии плавления и незначительными изменениями размера кристаллической ламели. Учитывая, что общее количество двойных спиралей до и после отжига пшеничных крахмалов остается тем же [78], предполагается, что во время отжига новые двойные спирали не формируются и оптимизация их длины происходит, по-видимому, в основном за счет дополнительной спирализации неупорядоченных концов существующих двойных спиралей. Несмотря на то, что явные доказательства были получены только при исследовании картофельных и ячменных крахмалов, предполагается, что и в общем случае реорганизация молекул крахмала во время отжига происходит главным образом в пределах кристаллической ламели.
Принимая во внимание, что плавление кристаллитов начинается с их дефектов, определенную долю увеличения температуры плавления кристаллитов можно отнести за счет некоторых структурных изменений в аморфной ламели. В частности, фрагменты амилозных проходных цепей, располагающиеся в аморфной ламели, в процессе отжига могут приобрести более энергетически выгодную конформацию. К тому же, отжиг крахмала сопровождается сужением температурного интервала плавления [77], что в соответствии с [12], определяется размером гранул крахмала. Можно, следовательно, предположить, что структурные изменения, наблюдаемые при отжиге, затрагивают структурную организацию более высоких уровней, чем кристаллическая и аморфная ламели. 1.4 Резистентные крахмалы
Крахмалы в пищевых продуктах бывают двух типов - гликемические и резистентные. Гликемические крахмалы расщепляются в желудочно-кишечном тракте и в зависимости от скорости переваривания рассматриваются как быстро- и медленно перевариваемые крахмалы. Так, например, приготовленное картофельное пюре, где крахмал находится в желатинизированном состоянии, является показательным примером продуктов, которые быстро перевариваются в тонком кишечнике. Медленно, но полностью перевариваемые крахмалы содержатся, например, в макаронных изделиях.
Резистентный крахмал определяется как «крахмал и продукты его деградации, не абсорбируемые в тонком кишечнике здоровых людей». Из самого определения резистентного крахмала следует, что такой крахмал недоступен для ферментации в тонком кишечнике. Однако, попадая в толстый кишечник и прямую кишку, он становится доступным для . ферментации присутствующими здесь бактериями и переваривается с образованием коротко-цепных жирных кислот, углекислоты, водорода и метана. Таким образом, его физиологическая функциональность подобна функциональности пищевых волокон из различных источников. Как те, так и другие улучшают состояние толстого кишечника и увеличивают выход фекальных масс. Однако, резистентные крахмалы, по сравнению с пищевыми волокнами, способствуют образованию большего количества бутиратов, которые, как предполагается, улучшают состояние толстого кишечника и прямой кишки
Резистентные крахмалы
Для оценки размеров частично-кристаллических крахмальных колец роста использовали метод сканирующей электронной микроскопии. Для этого крахмалы обрабатывали раствором соляной кислоты [104]. К 50 мг крахмала (сухой вес) добавляли 3 мл 8%-ной (2.2 Н) соляной кислоты, помещали в центрифужную пробирку (30 мл) и плотно закручивали. Затем образцы крахмала инкубировали в течение 12 часов при 38 С в термошейкере. После кислотной обработки к образцам добавляют 15-20 мл холодной дистиллированной воды и центрифугировали. Осадок промывали до нейтрального рН и высушивали при 25 С.
Затем исследуемые образцы помещали на медный диск, напыляли слоем золота в вакуумном испарителе (JEOL JEE 44Е) и проводили съемку на сканирующем электронном микроскопе (JEOL JSM 5200) при ускоряющем напряжении 10 кВ. Для каждого образца было сделано 5-7 фотографий.
Для определения толщины частично-кристаллических колец роста применяли метод анализа цифровых изображений. Фотографии образцов крахмалов, полученных методом сканирующей электронной микроскопии, (размер 12.2 х 8.7 см, увеличение 5 000) сканировали на сканере (Epson Expression 1680 Pro), соединенном с компьютером (Pentium 4) с установленной операционной системой MS-Windows. Изображения сохраняют в формате TIF при разрешении 800 dpi и 256-разрядной цветовой (серо-черной) гамме. Для обработки фотографий используют программу ADOBE PHOTO SHOP 5.LE. Полученные рисунки анализируют при помощи программы OLIMPUS MICRO IMAGE 4 (Olympus Europe).
Рентгеновское рассеяние под большими углами
Измерения рентгеновского рассеяния образцов крахмала под большими углами, содержащие 12% воды, проводили на диффрактометре, оснащенным одномерным позиционно-чувствительным детектором, сконструированным в Объединенном институте ядерных исследований (Россия, Московск. обл., г.Дубна) [105]. Рефлексы рассеяния под большими углами записывались в просвечивающей геометрии с излучением СиКа как функция I(S) от S=(2sin6)/X, где Я равна длине волны СиКа (0,1542 нм) и 9 - половина угла рассеивания.
Кристалличность резистентного крахмала (С), т.е. массовая доля кристаллической фазы, определяли, учитывая коэффициент рентгеновской абсорбции K=IJlt! где 10 и It интенсивности падающего и отраженного рентгеновского пучка, соответственно. Расчеты проводили с учетом фонового рассеяния h(S), определенного для пустой кюветы, и рефлексов рассеяния под широкими углами «аморфного» пшеничного крахмала (получен 6-часовой обработкой нативных крахмалов в шаровой мельнице) для получения значения нормализованного рефлекса широкоуглового рассеяния Inorm(S), отнесенного к единице массы образца: horm(S) = P(S) -К- Ib(S)J -[ln(K)Jl (6) Кристалличность крахмала определяли по формуле: С = (1-)-100% (7), где к — коэффициент аппроксимации нормализованной кривой рассеяния под большими углами «аморфного» крахмала к кривой рассеяния исследуемого образца крахмала при значениях S l .5 нм" и 8=2.4 нм .
Малоугловое рентгеновское рассеяние Для определения размеров амилопектиновых кластеров и кристаллических ламелей гранул крахмала использовали метод рассеяния под малыми углами. Для этого приготавливали дисперсии крахмала с массовой долей вещества 50% [40,41]. Измерения проводили на рентгеновском диффрактометре, оборудованном в Институте биохимической физики (Россия, Москва). Дисперсии крахмала помещали в ячейки и запечатывали с целью предотвращения потери воды. Рентгеновский луч, исходящий из острофокусной медной рентгеновской трубки с Ni-фильтром (излучение СиКД действующей при 30KV/30mA, фокусировался коллиматором со стеклянным зеркалом по схеме Франкса) [106]. Рефлексы малоуглового рентгеновского рассеяния регистрировали одномерным позиционно-чувствительным детектором, заполненным газом (85% Ксенон, 15% Метан), с линией задержки, созданным в Объединенном институте ядерных исследований (Россия, Московск. обл., г.Дубна)[105]. Расстояние образец-детектор составляло 415 мм.
Диффереіщиальная сканирующая калориметрия
Как было отмечено ранее, в структурной организации полисахаридов крахмала могут быть выделены, как минимум, три уровня: гранулярный (2-100 мкм), кластерный (9-10 нм) и кристаллический ламелярный (4-5 нм). Иерархическая структура крахмалов может быть исследована с помощью различных методов. Гранулярный уровень структурной организации обычно исследуется с помощью световой и сканирующей электронной микроскопии. Для определения размеров амилопектиновых кластеров используется метод мало-углового рентгеновского рассеивания, тогда как для определения размеров кристаллических ламелей могут быть использованы как метод мало-углового рентгеновского рассеивания, так и дифференциальной сканирующей калориметрии. Принимая во внимание, что различные сорта мутантных пшеничных крахмалов, содержащих различное количество амилозы, были выведены только в середине 90-х начале 2000-х годов, структурная организация гранул таких крахмалов оставалась неизвестной до проведения исследований, описанных в этой главе.
Морфологические и термодинамические исследования пшеничных крахмалов с различным содержанием амилозы Как известно, в гранулах крахмала наблюдается чередование частично-кристаллических и аморфных колец роста.
В картофельном крахмале кольца роста можно наблюдать визуально, без какой-либо предварительной обработки гранул крахмала, методом световой микроскопии, в то время как для других крахмалов [111-113] требуется использование атомной микроскопии или, в случае исследования пшеничного крахмала, может быть использован метод сканирующей электронной микроскопии. В последнем случае для получения количественных результатов необходима предварительная ферментная или кислотная обработка гранул [111]. После чего компьютерная обработка фотографий, полученных методом сканирующей электронной микроскопии, позволяет оценить размеры частично-кристаллических колец роста. Хорошо известно, что частично-кристаллические кольца роста состоят из амилопектиновых кластеров, которые в свою очередь состоят из аморфных и кристаллических ламелей. Размеры последних могут быть оценены, используя методологию Привалова и Хечинашвили [101], разработанную для описания процесса денатурации малоглобулярных белков и адаптированную в работах [45,57-59,69,] для описания процессов плавления крахмалов. Эта модель подразумевает, что в процессе плавления существует только два состояния: нативное и расплавленное. С помощью этой модели была определена кооперативная единица плавления различных крахмалов, т.е. минимальная последовательность повторяющихся звеньев в цепи, переходящая как целое из неупорядоченного в упорядоченное состояние. Было показано, что кооперативная единица плавления соответствует степени полимеризации А-цепей амилопектина, образующих кристаллическую структуру крахмала.
Согласно [63] кристаллические ламели могут содержать различного рода дефекты, такие как амилозные проходные цепи, упорядоченные молекулярные структуры и т.д. Известно, что для качественной оценки содержания дефектов могут быть использованы данные, полученные с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии и сканирующей электронной микроскопии. В частности в работах [48] было показано, что увеличение содержания амилозы в кукурузных крахмалах сопровождается увеличением гидратационного вклада в изменение теплоемкости при переходе крахмала из нативного в расплавленное состояние. Таким образом, анализ литературы показывает, что использование различных приближений для описания ДСК-термограмм позволяет определить не только размеры кристаллических ламелей, но и их дефектность. Тогда как компьютерная обработка фотографий, полученных методом сканирующей электронной микроскопии, позволяет определить размеры частично-кристаллических колец роста. В этой главе используются данные, полученные методами ДСК и сканирующей электронной микроскопии, для выяснения структурной организации полисахаридов пшеничных крахмалов с различным содержанием амилозы.
Фотографии пшеничных крахмалов, полученные методом сканирующей электронной микросколии, представлены на рисунке
Анализ цифровых изображений, полученных методом сканирующей электронной микроскопии (Таблица З.1., рис.10) показывает, что, в принципе, определенные значения толщины частично-кристаллических колец роста согласуются с результатами исследований крахмалов, экстрагированных из других источников [114]. Однако, в отличие от опубликованных данных, проведенные исследования позволяют проследить влияние амилозы на размеры частично-кристаллических колец роста. Как видно из таблицы 3.1 увеличение содержания амилозы в крахмалах от 1.5% до 39.5 % сопровождается увеличением толщины частично-кристаллических колец роста в 1.7 раза.
Таким образом, сравнение опубликованных данных [113,114] с полученными результатами дает право сделать вывод, что толщина кристаллической ламели зависит не только от источника крахмала, но и от количества содержания амилозы.
Как было отмечено ранее, информация о размерах кристаллических ламелей может быть получена из ДСК-исследований. На рис.11 показаны кривые плавления 0.3 % дисперсий крахмалов.
Исследование пшеничных крахмалов с различным содержанием амилозы методом рассеяния под малыми углами. Взаимосвязь структурных и термодинамических параметров
Видно, что независимо от условий окружающей среды и сорта ячменя, увеличение продолжительности отжига приводит к уменьшению доли дефектной структуры.
Хорошо известно, что при отжиге V-типа комплексов амилозы со спиртами при 65С или 70С происходит существенное увеличение толщины кристаллита [132]. Кроме того, уменьшение скорости нагрева с 3 К/мин до 0.5 К/мин или повторное нагревание нормальных и высокоамилозных ячменных крахмалов после отжига не сопровождается изменениями термодинамических свойств амилозо-липидных комплексов [44,133]. Можно предположить, что процедура отжига не оказывает существенного влияния на термодинамические параметры амилозо-липидных комплексов. Действительно, как видно из таблицы 3.11. температура плавления амилозо-липидных комплексов существенно не увеличивается (АТ 3 К). Вероятно, некоторое увеличение энтальпии диссоциации амилозо-липидных комплексов, может быть вызвано изменением расположения липидов на поверхности комплексов во время отжига крахмальных дисперсий и формированием дополнительных термостабильных комплексов [44,133]
Таким образом, анализ результатов отжига ячменных крахмалов показал, что при отжиге происходит незначительное удлинение амилопектиновых А-цепей, формирующих двойные спирали, с последующим увеличением толщины кристаллической ламели. Отжиг высокоамилозных крахмалов, экстрагированных преимущественно из ячменя, выращенного при низких температурах, приводит к увеличению доли менее дефектной структуры. Отжиг нативных крахмалов не влияет на плавление амилозо-липидных комплексов, хотя для некоторых крахмалов наблюдаются небольшие изменения в энтальпии плавления.
Для лучшего понимания макромолекулярной организации полисахаридов крахмалов на различных уровнях их структурной организации в этой главе рассматривается влияние процедуры отжига на структуру гранул пшеничных крахмалов с различным содержанием амилозы с использованием различных физических методов, обычно применяемых для исследования синтетических и природных полимеров. Эти методы исследования были выбраны таким образом, чтобы проследить происходящие изменения на всех уровнях структурной организации.
Микрофотографии крахмалов пшеницы, полученные методами световой и сканирующей электронной микроскопии и представленные на Рис. 18-21, показывают, что отжиг амилопектинового (Рис. 18 С, D - сорт Леона) и высокоамилозного (Рис. 19 С, D - сорт Булава) крахмалов не сопровождается существенными изменениями морфологии гранул.
По сравнению с нативньши крахмалами (фото не представлено), наблюдаются небольшие деформации и сморщивание линзообразных гранул. Можно наблюдать, что по сравнению с амилопектиновыми крахмалами для высокоамилозных крахмалов деформация гранул была более заметной (появление гранулярных «сколов»). Исследование тех же самых крахмалов методом световой микроскопии (Рис. 20 А, В и Рис. 21 А, В) с контрастом Номарского в поляризованном свете показывают, что после отжига крахмалов концентрические кольца роста и Мальтийские кресты остаются практически неизменными. Это означает, что структура крахмала на гранулярном и ламелярном уровнях организации остается практически неизменной после отжига.
Хорошо известно [84], что на первом этапе обработки крахмалов кислотой происходит гидролиз аморфной основы. Это позволяет получить ясную визуальную картину внутреннего строения крахмальной гранулы при микроскопическом исследовании. На микрофотографиях, полученных с помощью сканирующей электронной микроскопии, нативных и отожженных крахмалов после кислотной обработки видны чередующиеся светлые и темные слои; светлые относятся к частично-кристаллическим кольцам роста, а темные - к аморфным кольцам роста . Как видно из Рис. 19 А, В и Рис. 19 Е, F для высокоамилозного крахмала (сорт Булава), плотность чередующихся структур была выше у отожженного образца по сравнению с нативным. Кроме того, обработка кислотой амилопектинового (сорт Леона) крахмала (Рис. 18 Е, F) не выявила структуру, относящуюся к частично-кристаллическим и аморфным кольцам роста. Такое поведение, а именно более высокая плотность чередующихся структур высокоамилозного крахмала и невозможность их проявления в гранулах амилопектинового крахмала после кислотной обработки, может быть следствием образования более плотных структур в процессе отжига, которые препятствуют проникновению кислоты внутрь гранулы. Учитывая, что частично-кристаллические кольца роста состоят из амилопектиновых кластеров, можно сделать вывод, что в процессе отжига происходит формирование более совершенной структуры кластеров.
Кривые рассеяния крахмальных гранул под малыми углами представлены на Рис. Кривые рассеяния нативных и отожженных пшеничных крахмалов под малыми углами. 1,3 — нативные; 2,4 - отожженные (10 часов) крахмалы из пшениц сортов Леона и Булава Как видно из Рис.22 кривые нативных и отожженных крахмалов практически не отличаются друг от друга. Вычисления показывают, что в нативных и отожженных крахмалах толщина амилопектиновых кластеров, рассчитанная согласно уравнению Вульфа-Брегга, равна приблизительно 10 мкм и не зависит от содержания амилозы в крахмалах. Этот вывод согласуется с ранее опубликованным данным [83] для картофельного крахмала.
