Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Теория свободнорадикального окисления 11
1.1. Общая теория цепных разветвленных процессов окисления органических соединений 11
1 2. Теоретические представления о механизме ингибирования 16
1.3. Мицеллообразование. Основы и особенности межфазного и мицеллярного катализа 23
1.4. Окисление углеводородов в присутствии мицелл и в двухфазных водно-органических системах 29
1.5. Фракционный, жирно-кислотный состав и биологическая активность липидов 31
1.6. Особенности кинетики и механизма окисления липидов и их жирно-кислотных компонентов 34
1.7. Методы тестирования эффективности антиоксидантов 39
Глава 2. Материалы и методы исследования 46
2.1. Получение и очистка эфиров ненасыщенных жирных кислот 46
2.2. Очистка инициатора 46
2.3. Очистка растворителей 47
2.4. Очистка ингибиторов 47
2.5. Схема и принцип работы манометрической установки 48
2.6. Методики окисления 49
2.7. Методики определения критической концентрации мицеллообразования 50
Глава 3. Результаты исследования эффективности кинетических моделей тестирования биоантиоксидантов в гомогенной среде 53
3.1. Обсуждение результатов 80
Глава 4. Результаты исследования эффективности водно-липидной кинетической модели тестирования биоантиоксидантов 83
4.1. Исследование мицеллообразования водно-липидных систем 83
4.2. Подбор катализатора 88
4.3. Подходы для расчета кинетических параметров и оценки эффективности ионола при каталитическом окислении этилолеата 95
4.4. Исследование эффективности и механизма действия а-токоферола при окислении метиллинолеата в условиях водно-липидной модели 104
4.5. Исследование эффективности фенола и его производных при каталитическом окислении этилолеата 110
4.5.1. Исследование эффективности и механизма действия осалмида при каталитическом окислении этилолеата 114
4.5.2. Исследование эффективности и механизма действия эмоксипина при каталитическом окислении этилолеата 118
4.5.3. Исследование эффективности и механизма действия парацетамола при каталитическом окислении этилолеата 123
4.6. Исследование эффективности и механизма действия пирокатехина при каталитическом окислении этилолеата 125
4.6.1. Исследование эффективности и механизма действия адреналина при каталитическом окислении этилолеата 129
4.6.2. Исследование эффективности и механизма действия метилдофы при каталитическом окислении этилолеата 132
4.7. Исследование эффективности и механизма действия капотена при каталитическом окислении метиллинолеата 136
4.8. Обсуждение результатов 140
Выводы 146
Библиографический список использованной литературы 148
Приложения 163
Методические рекомендации 175
- Мицеллообразование. Основы и особенности межфазного и мицеллярного катализа
- Окисление углеводородов в присутствии мицелл и в двухфазных водно-органических системах
- Методики определения критической концентрации мицеллообразования
- Исследование эффективности и механизма действия а-токоферола при окислении метиллинолеата в условиях водно-липидной модели
Введение к работе
Настоящая работа посвящена исследованию эффективности липидной и водно-липидной кинетических моделей и подбору критериев тестирования во-донерастворимых и водорастворимых биоантиоксидантов.
Актуальность темы. За 90 лет после патентования гидрохинона в качестве стабилизатора окислительной деструкции акролеина области применения антиоксидантов значительно расширились. Антиоксиданты применяют в химической технологии, для стабилизации автомобильных, авиационных видов топлива и смазочных масел, в пищевой и фармацевтической промышленности. За этот период установлен радикально-цепной механизм окисления углеводородов и их производных и механизм действия многих ингибиторов в этих условиях.
С развитием радиобиологии в 50-х годах XX века появились представления о радикально-цепном механизме не только радиационного поражения, но и развития других патологий. К настоящему времени сформировалась теория свободнорадикального механизма развития большинства патологий путем нарушения проницаемости биомембран при изменении интенсивности окисления липидов. Эти научные достижения стимулировали широкое применение антиоксидантов в медицине. Но прогресс в антиоксидантотерапии, применении антиоксидантов в пищевой, фармацевтической технологиях требует разработки сопоставимых и достоверных методов тестирования биоантиоксидантов.
К биоантиоксидантам предъявляются требования их нетоксичности и эффективности в биологических средах.
Все существующие методы тестирования антиоксидантов делятся на кинетические и некинетические. Для некинетических методов известно использование суспензии митохондрий в фосфатном буфере и оценка результатов тестирования хемилюминесцентным методом [9]. Предполагается, что хемилюми-несценция связана с окислительно-восстановительными реакциями. Однако суть этого явления однозначно не установлена, так как свечение могут давать соединения разной химической природы [13; 30; 48; 62].
Показана возможность тестирования биоантиоксидантов путем аскорбат-зависимого окисления олеиновой кислоты в присутствии солей железа (II), аскорбиновой кислоты и растворов испытуемых веществ. В качестве субстратов используют также микросомы, суспензию желточных протеинов в фосфатном буфере, модельные системы липосом, сформированные из раствора яичного лецитина в глициновом буфере. Эффективность биоантиоксидантов в этих моделях оценивают по величине отношения периодов образования определенных концентраций пероксядов и гидроксидов в контрольной пробе и проб с биоанти-оксидантом [89].
Недостатком всех перечисленных методов является низкая точность из-за использования в качестве показателя окисляемости концентрации таких неустойчивых продуктов, как пероксиды. При этом в пробах со слабыми ингибиторами, способными участвовать в распаде гидропероксидов, могут быть зафиксированы высокие значения отношений периодов индукции. Применение аскорбиновой кислоты также может вносить неточности в результаты тестирования, так как известно, что она служит восстанавливающим агентом катионов Fe3+ и способна к синергизму с рядом фенолов и ароматических аминов.
Недостатком этих методов также является трудность стандартизации субстратов, и поэтому невозможность повторить результаты экспериментов.
С целью увеличения точности и информативности методов тестирования биоантиоксидантов широко используют в качестве кинетических моделей растворы углеводородов, таких как кумол, этилбензол, стирол. Кинетические параметры процессов окисления этих соединений хорошо изучены, что позволяет оценить эффективность антиоксидантов и биоантиоксидантов по величине константы скорости обрыва цепей [17; 26; 57]. В этилбензоле и стироле определены значения константы скорости обрыва цепей для токоферолов и убихинонов [24; 25; 27; 51; 96]. Однако использование углеводородов для тестирования антиоксидантов для биологических и пищевых субстратов ограничено большой разницей в структуре и механизмах окисления углеводородов и липидов.
В качестве модельных субстратов для оценки эффективности антиокси-дантов для пищевых продуктов, масляных основ фармацевтических препаратов известно использование процессов инициированного окисления безводных растворов олеатов, линолеатов [1.00]. Кинетика и механизм окисления эфиров высших ненасыщенных жирных кислот достаточно хорошо изучены, что позволяет использовать эти субстраты в качестве модельных для тестирования липидрастворимых биоантиоксидантов [10; 74-76; 78; 115].
Модель для тестирования биоантиоксидантов должна удовлетворять следующим условиям:
а) реакция окисления должна протекать с высокой скоростью, что обес
печивается температурой проведения эксперимента (при 60,0±0,2С);
б) реакция должна протекать в кинетической области (не зависеть от ско
рости перемешивания окисляемого субстрата);
в) необходимо исключить соокисляемость компонентов системы.
В целом актуальность настоящей работы обусловлена необходимостью разработки кинетических методов тестирования водорастворимых и водонерас-творимых биоантиоксидантов.
Особенно актуальным представляется разработка и оценка эффективности модели для тестирования водорастворимых биоантиоксидантов. Именно водорастворимые нетоксичные соединения могут применяться для антиоксидан-тотерапии, торможения процессов окисления водных биологических и пищевых субстратов. Представляются актуальными сравнение эффективности разных кинетических моделей тестирования биоантиоксидантов и разработка практических рекомендаций по их применению.
Цели и задачи исследования. Целью работы является разработка и оценка эффективности кинетических моделей тестирования растворимых и нерастворимых в воде биоантиоксидантов.
8 В процессе достижения цели в работе решались следующие задачи:
разработка кинетической модели тестирования липидрастворимых биоантиоксидантов;
разработка метода внешнего стандарта для оценки эффективности и механизма действия липидрастворимых биоантиоксидантов;
исследование критериев оценки эффективности и механизма действия липидрастворимых биоантиоксидантов методом математического моделирования;
разработка кинетической модели тестирования водорастворимых биоантиоксидантов по результатам исследования процессов мицеллообразования и кинетики каталитического окисления водно-липидных субстратов;
исследование критериев тестирования эффективности и механизма действия водорастворимых биоантиоксидантов;
тестирование водорастворимых соединений классов фенолов, аминов, тиолов в условиях водно-липидной модели, оценка их эффективности и механизма действия с помощью разработанных критериев;
сравнение водно-липидной и безводной кинетических моделей по информативности и области применения.
Научная новизна:
Разработаны две кинетические модели, которые позволяют производить поиск эффективных биоантиоксидантов не только среди традиционно исследуемых водонерастворимых соединений, но и среди природных и синтетических водорастворимых соединений, а также оценивать интегральную антиоксидантную активность всей совокупности компонентов биологического материала и биологических сред.
Разработана совокупность критериев оценки эффективности и механизма действия биоантиоксидантов с помощью метода внешнего стандарта, а также по величинам параметров аппроксимирующих функций и их производных. Это позволяет оценить периоды полного торможения и выхода на стационарный режим, участие ингибитора в обрыве, продолжении, разветвлении цепей, величины начальной и максимальной скоростей, минимальную критиче-
скую концентрацию, при которой биоантиоксидант не влияет на кинетику процесса, и максимальную критическую концентрацию, при которой биоантиоксидант проявляет высокую антиоксидантную активность.
3. Впервые показаны особенности механизма действия некоторых фенолов при каталитическом окислении водно-липидных субстратов, высокая антиоксидантная активность водорастворимых лекарственных препаратов различного фармакологического действия, способных расширить ассортимент средств антиоксидантотерапии.
Практическая значимость работы заключается в том, что предложены две кинетические модели, позволяющие тестировать антиоксидантную активность всей совокупности водо- и липидрастворимых компонентов биологического сырья и тем самым расширить ассортимент нетоксичных биологических добавок и средств антиоксидантотерапии.
В работе экспериментально доказана антиоксидантная активность ряда гипотензивных, адреномиметических, желчегонных препаратов, что дает основание исследовать возможность расширения их фармакологического действия и терапевтического применения.
Водно-липидная кинетическая модель, разработанная соискателем, практически применима для тестирования синтетических и природных водорастворимых соединений, а кинетические и математические критерии позволяют всесторонне оценить эффективность и механизм действия антиоксидантов.
Разработан оригинальный способ тестирования антиоксидантов и расчета кинетических параметров. Доказана антиоксидантная активность ряда гипотензивных, адреномиметических лекарственных препаратов и возможность их применения в антиоксидантотерапии.
Апробация работы. Основные результаты доложены на Всероссийских Менделеевских чтениях «Д.И. Менделеев и Сибирь: История и современность» (Тобольск, 1999), Всероссийской научно-практической конференции «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере» (Сургут, 2000), межвузовской конференции «Научная молодежь-XXI веку» (Сургут,
2001), в сборнике научных трудов (Сургут, 2001), на Ш окружной конференции «Наука и инновации Ханты-Мансийского автономного округа» (Сургут, 2002), IV окружной научно-практической конференции «Наука и инновации XXI века» (Сургут, 2003), Всероссийской научной конференции «Экологические проблемы и здоровье населения Севера» (Сургут, 2004), Международной научной конференции «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере» (Сургут, 2004), V окружной конференции «Наука и инновации XXI века» (Сургут, 2004), VI окружной конференции «Наука и инновации XXI века» (Сургут, 2005). По результатам исследования опубликованы статьи в журналах «Вестник ТюмГУ» (Тюмень, 2006), «Вопросы современной науки и практики. Университет им. В.И. Вернадского» (Тамбов, 2006).
Публикации. По результатам экспериментов опубликовано 13 печатных работ, в том числе приняты в печать статьи в журнал «Кинетика и катализ» и «Химико-фармацевтический журнал», подана заявка на изобретение (дата поступления 24.05.2005, входящий № 017934, регистрационный № 2005115666).
Мицеллообразование. Основы и особенности межфазного и мицеллярного катализа
Многие пищевые продукты, лекарственные и витаминные препараты представляют собой прямые эмульсии масла в воде. Ухудшение качества этих продуктов во многом определяется интенсивностью окисления липидов, которое, в свою очередь, ускоряется присутствием даже следовых концентраций катионов металлов переменной валентности. Проблемы мицеллярного и межфазного катализа актуальны для развития теории свободнорадикального окисления липидов биомембран.
Особенности физико-химических свойств растворов ПАВ изложены в многочисленных монографиях и обзорных статьях [38; 47; 58; 59]. Показано, что дифильные частицы анионных, катионных и неионных ПАВ обладают ограниченной ионной или молекулярной (Ю -Ю""2 моль/л) растворимостью в воде [95; 131; 114]. Увеличение концентрации ПАВ приводит к спонтанной самоассоциации ионов или молекул в мицеллы и резкому увеличению растворимости ПАВ в воде [120; 121; 126]. Способность к мицеллообразованию определяется величиной гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ) между гидрофобной и гидрофильной частями молекулы ПАВ [127; 130; 138]. Оптимальный баланс характерен для ПАВ, молекулы которых имеют ддинноцепочные углеводородные хвосты и ионные либо полярные гидрофильные головки. Важной характеристикой мицеллообразова-ния является критическая концентрация мицеллообразования (ККМ) - сравнительно малая область концентраций ПАВ, при которой в растворе начинается процесс мицеллообразования. За нижний предел ККМ принята концентрация ПАВ в растворе, ниже которой мицеллы не образуются (молекулярный раствор). За верхний предел ККМ принята концентрация ПАВ в растворе, выше которой все добавленное количество ПАВ образует мицеллы.
Величина ККМ зависит от молекулярной природы ПАВ, среды и поверхностной активности ПАВ, рН раствора, температуры, содержания примесей и других факторов [38; 60; 114; 126]. Высокой величине поверхностной активности ПАВ соответствуют низкие значения ККМ. Величина ККМ определяет размеры и форму мицелл [46; 58-60; 136]. Мицеллы, образующиеся при достижении ККМЬ имеют сферическую форму и узкое распределение по размерам, число агрегации обычно составляет от 10-100 молекул. Радиус мицеллы равен длине вытянутой молекулы ПАВ (3-5 нм). Для ККМ2 и других характерна полидисперсность мицелл и широкое распределение по размерам. Мицеллы находятся в динамическом равновесии с неассоциированными молекулами ПАВ. Релаксационные методы показали, что процесс мицеллообразования включает быструю и медленную релаксацию. Быстрые ассоциативно-диссоциативные равновесия - процесс обмена «неассоциированная молекула ПАВ - мицелла» составляет 10" -10 с; медленная релаксация связана с изме-нением числа агрегации мицелл - от 1 до 10 с. В работе [125] показано, что для додецилсульфоната натрия время существования мономера в мицелле в среднем составляет 10 с, время жизни мицеллы - 10"3 с, время жизни противо-ионов и воды - 10"9 с.
Большинство экспериментальных данных [51; 134; 137] свидетельствует о том, что в водных растворах в области KKMi гидрофобные части дифильных молекул ПАВ образуют внутреннюю область (ядро) мицеллы, которая имеет промежуточное состояние между жидким и кристаллическим из-за упорядоченности непредельных углеводородных хвостов молекул. Полярные головки молекул ПАВ образуют поверхностный слой и всегда гидратированы одной или несколькими молекулами воды. Например, для лаурилтриметиламмоний хлорида и цетилтриметиламмоний бромида проникновение молекул воды зафиксировано до 5-й, 7-й метиленовой группы углеводородной цепи.
В работах [52; 130] показано, что добавки солей уменьшают ККМ, причем поливалентные ионы уменьшают ККМ в большей степени, чем одновалентные. Это можно объяснить экранирующим действием противоионов на полярные группы заряженной поверхности мицеллы. Энергия взаимодействия противоиона с мицеллой зависит от эффективных гидратных радиусов противоиона и полярной группы молекулы ПАВ [130].
На величину ККМ оказывают влияние добавки органических соединений, при этом низкомолекулярные соединения (метанол, ацетон и др.) повышают ККМ, а высшие жирные спирты снижают.
При концентрации ПАВ в воде [60], значительно превышающей 10 ККМ, форма и число агрегации мицелл меняется; сферические мицеллы трансформируются в цилиндрические (ККМ2), при этом растворимость ПАВ дополнительно возрастает. Наблюдается нелинейное (скачкообразное) изменение физико-химических свойств системы, что используют для определения ККМ. Дальнейшее повышение концентрации ПАВ приводит к образованию другого типа микрогетерогенных самоорганизующихся ансамблей (микроэмульсий) больших размеров 1(Г5-1(Г7м [114; 126].
В зависимости от способа диспергирования размер капель эмульсии может быть различным. Из-за высокой суммарной поверхности и большой свободной энергии такие системы агрегативно неустойчивы. Поэтому очень важным является вопрос повышения устойчивости эмульсионных систем.
Эмульсии, стабилизированные ПАВ, имеют различную степень устойчивости, при этом ПАВ не оказывают влияние на взаимную растворимость фаз [99]. Показано, что прямой зависимости между устойчивостью эмульсий и поверхностным натяжением не наблюдается. По результатам исследования был описан механизм стабилизации эмульсий. Показано, что защитный слой ПАВ должен предотвращать коалесценцию капель эмульсии, не допуская их на расстояние радиуса действия поверхностных сил в жидкости ( Н(Г9 м). Часть молекул ПАВ должна находиться в непрерывной фазе; молекулы ПАВ должны прочно удерживаться на поверхности раздела фаз, не десорбируя ни в одну из них. Концентрация ПАВ в объеме должна быть достаточной, чтобы вся межфазная поверхность была покрыта их молекулами. Ниже этой концентрации ПАВ практически не понижает поверхностное натяжение и не проявляет эмульгирующих свойств. При образовании молекулами ПАВ предельного адсорбционного слоя на поверхности капель эмульсии максимально проявляются их стабилизационные свойства.
Показано, что концентрация ПАВ влияет на тип эмульсии: низкие концентрации стабилизируют прямые эмульсии, высокие - обратные [116]. Например, для стабилизации эмульсий используют гептилтриметиламмоний иодид, нонилтриметиламмоний хлорид, цетилтриметиламмоний бромид и др. Максимальная эмульгирующая способность наблюдается у гомологов с 14-16 атомами углерода (максимум Данона) [1]. Введение в систему электролитов приводит к инверсии мицелл [126; 137]. В обратных мицеллах число агрегации в 3-5 раз меньше, чем в прямых. При этом наблюдается внутримицеллярная солюбилизация воды. Например, мицеллы ди-и-додецилфосфата бария в бензоле при 25С солюбилизируют 12 молей воды на 1 моль мицеллярного ПАВ. Мицеллярные растворы способны солюбилизировать вещества мало или совсем не растворимые в чистом растворителе. Процесс солюбилизации протекает самопроизвольно с уменьшением свободной энергии и образованием термодинамически равновесной системы.
Окисление углеводородов в присутствии мицелл и в двухфазных водно-органических системах
При введении в раствор прямых мицелл электролита наблюдается процесс обращения мицелл [118; 119; 129], что влияет на скорость окисления. С увеличением концентрации растворенной соли число мицеллярных частиц в единице объема сначала увеличивается пропорционально концентрации, затем рост числа частиц практически останавливается, и дальнейшее увеличение концентрации соли приводит к увеличению числа агрегации мицелл. В соответствии с этим скорость инициирования цепей катализатором сначала пропорционально растет с увеличением его концентрации, а затем снижается. Объяснение причин снижения активности катализатора в системах обратных мицелл в литературе отсутствует.
Наличие обратных мицелл в системе увеличивает не только скорость распада гидропероксида, но и скорость окисления углеводородов [90-92]. Изучалась система окисления кумола, катализируемая ацетатом кобальта в присутствии ионогенных и неионогенных ПАВ: ди-(2-этилгексил)сульфоната натрия, цетилтриметиламмония бромида. Показано, что природа ПАВ оказывает существенное влияние на процесс окисления: цетилтриметиламмоний бромид (ЦТМАБ) ускоряет, что может быть обусловлено образованием сложного ко-бальт-бромидного катализатора. Анализ кинетики распада гидропероксида кумила в присутствии ди-(2-этилгексил)сульфоната натрия и ацетата кобальта основан на предположении, что в системе образуются мицеллы, каталитический эффект которых обусловлен увеличением константы скорости распада комплекса гидропероксида с катализатором, а также концентрированием реагентов в мицеллярной фазе. За-пределивание скорости окисления при увеличении концентрации ЦТМАБ до 1-10" МОЛЬ/Л и ди-(2-этилгексил)сульфоната натрия до 1-10" моль/л характерно для кинетических закономерностей мицеллярного катализа.
Наблюдается специфическое влияние солюбилизированной воды на каталитическую активность обратных мицелл: в системе «додекан - ПАВ вода» при малых добавках воды (до 0,5%) наблюдается прекращение процесса окисления [49] или резкое замедление [65]; в системе, где вода солюбилизирована, в обратных мицеллах каталитическая активность ПАВ не проявляется [8; 22]. При добавлении значительного количества воды возникает двухфазная водно-органическая система (эмульсия) и наблюдается увеличение скорости окисления, что можно объяснить увеличением поверхности раздела фаз.
Скорость эмульсионного окисления увеличивается в присутствии ПАВ. Роль эмульгатора в процессе эмульсионного окисления не может быть сведена только к стабилизации эмульсии, ПАВ являются существенным кинетическим фактором, влияющим на ускорение процесса окисления углеводородов. Согласно топохимической схеме эмульсионного окисления, приведенной в работе [50; 111], углеводород из капель эмульсии поступает в прямые мицеллы за счет солюбилизации, реакция окисления протекает в мицелле, а образующийся гидропероксид экстрагируется в углеводородную фазу. Отмечается, что в результате солюбилизации углеводорода и гидропероксида в мицелле существует высокая локальная концентрация реагирующих веществ, причем распад гидропероксида на радикалы в данных условиях ускоряется.
Данная схема экспериментально не обоснована, так как при высокой скорости инициирования в мицеллах и небольшом количестве солюбилизированного углеводорода длина цепей не может быть большой и, соответственно, селективность гидропе-роксидов высокой. Более вероятно, что в мицеллах протекает только стадия инициирования, а продолжение и обрыв цепей осуществляется в углеводородной фазе. Скорость реакции окисления в двухфазных системах зависит не только от скорости массообмена между сплошной фазой и границей раздела фаз, но и от соотношения между скоростью физического переноса массы и скоростью химической реакции внутри диспергированной фазы. Экспериментально установлено, что состав продуктов при эмульсионном окислении качественно не отличается от состава продуктов, образующихся при гомогенном окислении углеводородов [14].
В настоящем разделе рассмотрен фракционный, жирно-кислотный состав, локализация и биологическая активность липидов лабораторных животных и человека.
Природные липиды делятся на липиды биологических мембран и лилиды жировых клеток (липиды «депо»), В организме человека и теплокровных животных наиболее богаты липидами мозг, нервная ткань, печень, мембраны органов и тканей [28; 39]. В клетках печени крыс наибольшая концентрация общих липидов характерна для митохондрий, наименьшая - для ядер [30; 53] (см. приложение I). При гомогенизации большая часть нейтральных липидов переходит в супернатант. Показано, что липиды ядер, митохондрий, микросом содержат 92-94% фосфолипидов и 4-6% холестерина.
Большинство биомембран содержит до 40% липидов. Состав и структура липидов определяют функции мембран. Липиды входят в состав эндоплазмати-ческих, митохондриальных, цитоплазматических и ядерных мембран и внутриклеточных органелл. В зависимости от локализации концентрация состава липидов значительно варьируется. В миелине содержание липидов достигает 80% сухой массы, а во внутренней мембране митохондрий - 20%. Основными компонентами липидов биомембран являются фосфатидил-холины (ФХ) и фосфатидилэтаноламины (ФЭА). Для крыс фосфолипидный состав биомембран клеток печени представлен в приложении 2. Наибольшая концентрация фосфатидилхолинов отмечена в ядерной мембране и эндоплазмати-ческом ретикулуме. Липиды мозга человека составляют 10-12% сухой массы, из них на долю фосфолипидов приходится 65-70% и содержат определенную концентрацию нейтральных липидов. Идентифицировано около 30 жирных кислот, из них 70-90% ненасыщенных жирных кислот. У теплокровных животных содержание липидов мозга достигает 40% сухой массы. Фракционный состав липидов закреплен генетически [39]. Локализация и фракционный состав фосфолипидов в субклеточных фракциях мозга белых крыс представлен в приложении 3, Главными литтидами мозга являются холинплазмалогены и этаноламино-плазмалогены. Внутренние мембраны наиболее богаты кардиолипидами. Поли-фосфатидилинозитолы составляют 5-10% фосфолипидов мозга. В работе ИМ. Бабаскина [4] приведены результаты определения фракционного состава липидов сыворотки и цельной крови доноров (см. приложение 4). Отмечены более высокие концентрации триглицерядов, эфиров холестерина, фосфатидилхолинов и более низкие концентрации свободного холестерина, лизофосфатидилхолинов, сфингомиелинов, фосфатидилэтаноламинов. Содержание общих липидов в плазме, сыворотке и цельной крови человека составляет 2,85-8,00 г/л, в том числе триглицеридов - 0,26-3,79; свободного холестерина - 0,43-2,13; фосфолипидов - 1,38-2,90 г/л. Показано, что главным компонентом фосфолипидов плазмы крови являются фосфатидилхолины, концентрация которых достигает 2 г/л, содержание фосфатидилэтаноламинов - 300 мг/л, шгазмалогенов - 70-80 мг/л, сфингомиелинов - 100-500 мг/л. В липопротеинах высокой плотности (ЛПВП) плазмы крови женщин содержится до 59% а-токоферола, у мужчин - 33%. В плазме крови крыс содержание а-токоферола составляет 9 мг/л. В работе [35; 42; 85] отметили изменение концентрации общих липидов в сыворотке крови в зависимости от локализации, которое составляет 2,60±0,15 г/л у мужчин и 2,80±0,12 г/л у женщин; содержание холестерина для мужчин и женщин, соответственно, равно 1,99±0,06 и 1,84±0,05 г/л.
Методики определения критической концентрации мицеллообразования
В монографиях К. Шиноды и других авторов [1; 36; 38; 93] критически рассмотрены более 70 методов определения критической концентрации мицеллообразования (ККМ) и свыше четырех тысяч значений ККМ различных ПАВ. В настоящее время широко используются спектральные и физико-химические методы определения ККМ: ЯМР атомов, обладающих магнитной анизотропией, ЭПР, метод флуоресцентных меток, образование и аннигиляция позитронов, скорость распространения ультразвука, полярография, трансляционная самодиффузия, поточная ультрамикроскопия, микрокалориметрия и другие методы [1; 60; 83; 97]. В основе экспериментальных методов определения ККМ лежит изменение физико-химических параметров растворов ПАВ в этой точке; резко возрастает вязкость, светорассеяние, меняется ход зависимости показателя преломления от концентрации и др. В настоящей работе использован метод Ребиндера, или метод наибольшего давления пузырька, согласно которому исследуют поверхностное натяжение растворов ПАВ и строят изотермы поверхностного натяжения от логарифма концентраций. По излому полученной кривой находят ККМ исследуемого раствора ПАВ. Расчет может быть проведен с помощью компьютерной программы. Схема установки приведена на рисунке 2.2. Для этого капилляр (2) вертикально погружают в исследуемую жидкость (1) так, чтобы кончик едва касался поверхности жидкости. Давление в капилляре больше, чем над поверхностью жидкости, поэтому на конце капилляра образуется пузырек воздуха. Избыточное давление прямо пропорционально поверхностному натяжению и обратно пропорционально радиусу капилляра В качестве эталонной жидкости была использована бидистиллированная вода, поверхностное натяжение которой известно (Р0 = 72,7-10 3 Н/м), тогда справедливо соотношение: Для исследования ККМ был использован и рефрактометрический метод. По перегибу зависимости показателя преломления от концентрации исследованных растворов судили о величине ККМ ПАВ и эфиров ненасыщенных жирных кислот. Рефрактометрическим методом определяют показатели преломления двух- и трехкомпонентных систем в зависимости от концентрации ПАВ и эфиров ненасыщенных жирных кислот. По результатам исследования строят график зависимости показателя преломления от концентрации исследуемого соединения и определяют критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ).
Поиск нетоксичных антиоксидантов является актуальной задачей для пищевой, фармацевтической технологий и медицины. В медицине в последние 15-20 лет большое внимание уделяется антиоксидантотерапии как профилактическому методу снижения стрессовой чувствительности, улучшения адаптации к неблагоприятным воздействиям окружающей среды, а также лечебному средству в совокупности с противовоспалительными, гипотензивными и другими препаратами. В известных, моделях тестирования антиоксидантов [32; 55; 67; 77; 84; 100; 121] в качестве показателя эффективности последних используют период индукции, вычисляемый разными способами, и не исследуются другие параметры, что затрудняет их практическое использование и сравнение результатов различных авторов. В настоящей главе приводятся результаты всесторонней кинетической оценки эффективности модельной реакции тестирования липидрастворимых биоантиоксидантов.
В качестве модельной выбрана реакция окисления при 60,0±0,2С раствора метиллинолеата в хлорбензоле в присутствии добавок различных концентраций инициатора 2, 2 -азобисизобутиронитрила. Модель выбрана на основе предшествующих работ В.Н. Ушкаловой с соавторами [76; 77], а также известных работ по кинетике окисления эфиров высших ненасыщенных жирных кислот Н. Янишлиевой с соавторами [100; 135] и других авторов [24; 98]. Выбор метиллинолеата обусловлен тем, что линолевая кислота входит в значительных концентрациях в состав большинства липидов [35; 77; 85] и обладает оптимальной окисляемостью по сравнению с другими высшими жирными кислотами. Известно, что скорость аутоокисления линолевой кислоты в 10-12 раз выше скорости окисления олеиновой кислоты и примерно в 100 раз выше скорости окисления стеариновой кислоты [27; 74; 100]. В качестве инициатора выбран 2, 2 -азобисизобутиронитрил, для которого хорошо изучена активность и кинетические параметры окисления в различных субстратах. Для оценки эффективности выбранной модели использован метод внешнего стандарта [86]. Суть его состоит в том, что предварительно изучаются все возможные кинетические параметры стандартного ингибитора, которые затем сравниваются с кинетическими параметрами исследуемого ингибитора. По результатам сравнения оцениваются антиоксидантная активность и механизм действия исследуемого биоантиоксиданта.
Исследование эффективности и механизма действия а-токоферола при окислении метиллинолеата в условиях водно-липидной модели
В аналогичных условиях исследовано влияние различных концентраций а-токоферола на кинетику и механизм окисления метиллинолеата. На рисунке 4.16 приведены типичные кинетические кривые каталитического окисления метиллинолеата при 60,0±0,2С в присутствии а-токоферола в интервале концентраций. Из рисунка 4.16 наблюдаем для всех исследованных концентраций а-токо-ферола отсутствие периода торможения. При концентрациях а-токоферола от 1-10 моль/л и ниже характер кинетических кривых соответствует характеру кинетической кривой окисления контрольной пробы. При увеличении концентрации а-токоферола до І-ІСҐ моль/л наблюдается снижение начальной и максимальной скоростей практически пропорционально его концентрации.
При дальнейшем увеличении концентрации а-токоферола выше 1-Ю моль/л наблюдается увеличение начальной и максимальной скоростей процесса окисления метиллинолеата пропорционально увеличению концентрации биоантиоксиданта. Далее для расчета кинетических параметров и оценки эффективности биоантиоксиданта кинетические кривые обрабатывали математическим методом, описанным выше. Показано, что кинетические кривые окисления метиллинолеата содержат два участка (рис. 4.17а): первый участок аппроксимировали функцией параболы, второй - прямой. В результате их дифференцирования получены значения начальной и максимальной скоростей, равные (1,8±0,2)-10"4 и (2,5±0,3)-10 моль-л"1-с" , и(2,8±0,5)-10 моль-л -с ускорения. Сравнивая полученные кинетические параметры со значениями начальной и максимальной скоростей и ускорения для процесса окисления этилолеата, наблюдаем увеличение начальной скорости и ускорения примерно в сто раз, максимальной - в три раза.
Что соответствует большей окисляемости метиллинолеата, связанной с его большей ненасыщенностью по сравнению с молекулами этилолеата. По указанной методике проведено исследование кинетических кривых окисления метиллинолеата в присутствии различных концентраций а-токоферола. Показано, что характер аппроксимирующих функций а-токоферола в кон- —7 центрации 1-Ю моль/л и ниже и их кинетические параметры практически соответствуют характеру функций и параметрам кинетической кривой контрольной пробы. Результаты дифференцирования для указанных концентраций а-токоферола приведены на рисунке 4.176, в, кинетические параметры представлены Показано, что минимальная критическая концентрация а-токоферола в 100 раз ниже минимальной критической концентрации ионола. При концентрациях а-токоферола от 1-Ю"7 до 1-КҐ моль/л характер аппроксимирующих функций не меняется. Результаты дифференцирования функций при различных концентрациях а-токоферола приведены на рисунках 4.17г-е, кинетические параметры - в таблице 4.5. Наблюдается уменьшение всех кинетических параметров практически пропорционально увеличению концентрации биоантиоксиданта, период окончания ускорения незначительно увеличивается с увеличением концентрации а-токоферола. При концентрации а-токоферола выше 1-Ю-4 моль/л характер функций соответствует контрольной кинетической кривой, но значительно отличается кинетическими параметрами (рис. 4.17ж-и и табл. 4.5). Из таблицы видно, что начальная скорость окисления для исследованных концентраций биоантиокисданта остается практически постоянной с увеличением концентрации а-токоферола, и наблюдается увеличение всех других кинетических параметров практически пропорционально увеличению концентрации биоантиоксиданта.
