Содержание к диссертации
Введение
1 Введение 5
2 Современные методы исследования натуральных соков, виноматериалов и вин 10
2.1 Современные представления о составе натурального сока, виноматериалов и вина из винограда и плодово-ягодных культур 10
2.2 Технологическая схема производства виноградного и плодовоягодного виноматериала 18
2.3 Проблемы фальсификации натуральных вин 23
2.4 Рекомендуемые к применению в винодельческой промышленности методы оценки качества виноградных вин 24
2.5 Физические и физико-химические методы анализа пищевых продуктов 25
2.6 Методы определения качества вина по устойчивость к коллоид ным и кристаллическим помутнениям 31
2.7 Методы исследования отдельных компонентов виноматериалов и вина 39
2.8 Химические способы исследования отдельных компонентов на туральных соков, виноматериалов и вин 39
2.9 Электрофоретический метод исследования компонентов вина и виноматериалов 41
2.10 Хроматографическое определение основных компонентов вино материалов и вина 45
3 Объекты и методы исследования 52
3.1 Объекты исследования 53
3.2 Методы исследования 55
3.3 Методики исследования главы 3 55
3.4 Методики исследования главы 4 60
3.5 Методики исследования главы 5 61
3.6 Методики исследования главы 6 63
3.7 Особенности получения и свойства плодово- ягодных соков и вин 71
3.8 Влияние высокомолекулярных синтетических флокулянтов (ВСФ) на общие физико-химические характеристики, на содержание азотистых веществ и коллоидов в соках и виноматериалах 76
3.9 Изменение содержания полифенольных соединений в плодовоягодных виноматериалах после обработки высокомолекулярны ми синтетическими флокулянтами (ВСФ) 85
3.10 Хроматографическое исследование антоцианов плодово - ягодных соков 88
3.11 Определение глкжозидных форм пеларгоеидина 92
3.12 Исследование содержания микроэлементов и металлов в аытоциановом комплексе 95
3.13 Исследование общего содержания некоторых микроэлементов в соках 95
3.14 Качественный состав микроэлементов плодово-ягодных вин и натуральных соков 98
3.15 Спектрофотометрическое изучение различных типов вин и ком понентов виноматериалов 100
3.16 Изменение ультрафиолетового спектра поглощения модєльных
3.5 растворов некоторых веществ, входящих в состав вина, при их нагревании 110
4. Исследование взаимодействия карбошїлсо-держащих компонентов натуральных соков с соединениями S02 123
4.1 Сульфятиравание моносахаров, входящих в состав натуральных вин и соков 126
4.2 Бисульфитные карбонилсодержащие соединения несахарной природы 134
5. Сравнительная характеристика физико- химических свойств фенольных компонен тов виноматериалов, вина и натуральньгх соков 143
5.1 Сравнительная характеристика полифенольной фракции виноградного и яблочного вина 143
5.2 Исследование коллоидных свойств полифенольной фракции натуральных соков, виноматериалов и вина 147
5.3 Применение метода гель-хроматографии для исследования полифенольной фракции соков, виноматериалов и вин 156
5.3.1 Обоснование полиэлектролитной природы полифенольной фракции методом эксклюзионной жидкостной хроматогрфии 157
5.3.2 Сравнительная устойчивость полифенольных фракций в услови ях кислотного, щелочного и ферментативного гидролиза 164
5.4 Применение метода электрофореза для исследования количественного и качественного состава полифенольной фракции виноматериалов 170
6. Хроматофоретический метод анализа белков, полисахаридов и белково- полисахаридных комплексов в винах и соках 177
6.1 Физико-химическое обоснование применения электрофоретиче-ского метода в исследованиях белков и полисахаридов вин и виноматериалов 177
6.2 Сравнительная характеристика белков и полисахаридов виноградного и яблочного виноматериала 181
6.3 Исследование белково-полисахаридных полимерных комплексов хроматофоретическим методом 191
6.4 Метрологическое обоснование хроматофоретического метода 205
6.5 Практическое применение хроматоэлектрофоретического метода для прогнозирования стабильности соков, виноматериалов и вин и оценки качества Обоснование применения хроматоэлектрофоретического метода 287
6.5.1 в технологических исследованиях устойчивости вин к помутнению Исследование процесса стабилизации виноматериалов
6.5.2 электрофоретическим методом 233
6.5.3 качества виноградных вин и их идентификации 242
Заключение 240
- Технологическая схема производства виноградного и плодовоягодного виноматериала
- Химические способы исследования отдельных компонентов на туральных соков, виноматериалов и вин
- Особенности получения и свойства плодово- ягодных соков и вин
- Спектрофотометрическое изучение различных типов вин и ком понентов виноматериалов
Введение к работе
В условиях перехода к рыночной экономике наиболее актуальной проблемой винодельческой промышленности являются неограниченный рост производства и потребление населением фальсифицированной продукции. Отсутствие инструментальных методов оценки качества вин и виноматериалов не только способствует получению огромных прибылей, производителям фальсифицированной продукции, создает угрозу здоровью потребителей, но и в значительной степени снижает престиж России на международном винодельческом рынке.
С давних времен лучшими считаются виноградные вина. Однако в результате социально-экономических преобразований на территории стран СНГ резко сократилось производство винограда.
В мировой практике плодово-ягодные вина занимают значительное место среди алкогольных напитков. Они выпускаются во многих странах под наименованиями плодово-ягодные вина, плодовые вина, фруктовые вина, медовые вина и т. п., либо им дается название без наименования «вино» — сидр (алкогольный яблочный напиток), пуаре (алкогольный грушевый напиток) и др.
В СССР плодово-ягодное виноделие было развито во всех союзных республиках, за исключением Туркменской ССР. Причем, производство плодово-ягодных вин в последние 90-е годы составляло более ПО млн. дал в год (в 1971 г. было вьшущено 44 млн. дал). В результате экономических и социальных изменений на территории бывшего Советского Союза производство этих вин практически: прекращено. А количество некачественной и, что особенно опасно, поддельной винодельческой продукции как отечественной, так и зарубежной возрастает в геометрической прогрессии и весьма насущным становится вопрос об обеспечении безопасности алкогольного рынка РФ.
Показатели качества вина определяются сочетанием свойств и параметров, которые формируются на различных этапах технологического цикла и находятся в зависимости от многих факторов. Определяющими среди них являются: характеристики сырья (винограда и плодовоягодных культур); технологические процессы переработки винограда на виноматериалы в стадии первичного виноделия; процессы обработки виноматериалов и приготовления вина на стадии вторичного виноделия; процессы, происходящие при выдержке, хранении и сбыте вина [21б;217].
Основными задачами являются возобновление государственных винодельческий предприятий, эффективности их производства и улучшение качества. Для этого необходимо, в первую очередь, завершить по областям и республикам России оценку имеющегося ассортимента плодов и ягод применительно к виноделию. Весьма важной в связи с этим является задача выделения технических сортов плодов и ягод, обоснование их оптимальных пропорций в ассортименте, изучение технологических свойств и сортовых особенностей, нормирование физико-химических показателей сырья, а также разработка основных направлений комплексного использования плодов и ягод по характерным зонам страны с учетом сроков их созревания, создание безотходной технологии переработки плодов и ягод.
Практически до середины 80-х годов в винодельческой промышленности существовал жесткий контроль выпускаемой продукции. Поэтому в научных исследованиях практически не стоял вопрос определения натуральности виномате-риалов и вин. Основные исследования были посвящены изучению методов, позволяющих прогнозировать устойчивость вин к возникновению физико-химических помутнений, так как непродолжительная розливостойкость отечественной винодельческой продукции наиболее часто является причиной снижения ее конкурентоспособности иа внутреннем и внешнем рынках. Традиционные методы прогнозирования розливостоикости вин основаны на визуальной оценке прозрачности имеют ряд недостатков, наиболее существенным из которых является высокая погрешность измерений, продолжительность анализа, ограниченность характеристики стабильности качественной безразмерной оценкой.
Широко распространенный органолептический способ определения качества натуральных вин в этом случае требует особого подхода. Для объективной органо-лептической оценки качества натуральных вин следует разработать единый унифицированный способ отбора дегустаторов с учетом психологических и физиологических особенностей, который позволил бы отбирать лиц с сенсорной чувствительностью без патологии, высокой распознавательной способностью и устойчивостью мнения. Последний критерий должен обязательно иметь количественную оценку и характеризовать дегустатора. Очевидно, только методы физико-химического анализа позволяют дополнить и более объективно обосновать результаты дегустационной оценки, получить количественные параметры для характеристики качества продукта, многие из которых не могут быть определены органолептически. Только на основании методов техиохимического контроля можно сделать заключение о безвредности продукта, его экологической чистоте и натуральности.
До представленного в данной работе исследования совершенно отсутствовали представления о влиянии технологических параметров на физико-химические превращения моносахаров, полисахаридов и фенольных компонентов, а также их комплексов. Нами были выявлены наиболее информативные: методы исследования полифенолБной компоненты виноматериалов и вин с целью определения основных физико-химических характеристик для применения их при идентификации исследуемых образцов с эталонными, которые соответствуют технологическим, физико-химическим и вкусовым параметрам качества определенного сорта, изучен процесс взаимодействия диоксида серы с сахарами и карбонилсодержащими компонентами несахарной природы.
Кроме этого, выявлены наиболее оптимальные условия и механизм макро-молекулярных процессов осветления и стабилизации вин посредством применения высокомолекулярных синтетических флокулянтов и разработаны количественный электрофоретический метод определения полисахаридов в винах и виноматериалах. Создан и обоснован метод дифференцированного анализа нативных полимерных комплексов в тех же объектах, позволяющий определять соотношение молекулярных масс и количества белково-полисахаридных комплексов, свободных белков и полисахаридов и их соответствия относительной электрофоретической подвижности с целью идентификации исследуемых образцов с эталонными для каждого конкретного сорта.
Мы исходили из представления о том, что наиболее изученными с точки зрения структурных превращений, а также в меньшей степени подверженным деструктивным химическим реакциям являются белки. Необходимость оптимизации их содержания в виноматериале для. исключения процесса помутнения значительно сокращает количество возможных надмолекулярных структур формируемых в виноматериале. Отметим, что, именно белки, в наибольшей степени определяют выпадение осадка как полисахарид-белкового, так и танатно-белкового комплекса, а возможно и металлического касса, наиболее характерного для плодово-ягодных виноматериалов, И, как следствие, определяют качество натуральных вин и соков.
Сознательный выбор способа обработки сока и виноматериалов может быть, воспроизведен только на основании знания состава полимеров каждого конкретного вида виноматериалов, понимания, какие именно полимерные составляющие ответственны за помутнения вин (полисахариды и белки не только ухудшают свойства вин, но и участвуют в сложении их нужных органолептических свойств), а также знания механизма действия используемых осветлителей и стабилизаторов. Как показали проведенные исследования и литературно-патентный поиск, единственным инструментом по всем этим вопросам может быть предлагаемый в данной работе хроматоэлектрофоретический метод анализа полимеров в соках, виноматериалах и винах.
В настоящей работе предложены объективные физико-химические методы контроля и оптимизации технологических процессов производства соков и вин, а также определения качества получаемой продукции и идентификации ее соответствия натуральным сокам и винам на основе сочетания хроматографического и электрофоретического методов исследования:.
Теоретической предпосылкой для данной работы явилось сделанное ранее обоснование того, что при завершении технологического цикла производства в многокомпонентных системах виноматериалов и вин устанавливается некоторое равновесное состояние, и любое вмешательство из вне приводит к нарушению их стабильности (помутнению). Поскольку характеристики равновесного состояния лежат в основе классификации вин, а отклонение от них представляет наиболее распространенный способ фальсификации (выдача ординарных вии за марочные, разбавление, купаж прессовых и самотечных фракций сусла, петиотизация (настаивание сахарного сиропа на мезге, оставшейся после отделения виноградного сока, замена винограда на плодово-ягодное сырье и т.п.), необходимо уметь производить идентификацию продукции, исключающую попадание на рынок вин несоответствующего качества. Идентификация предполагает разработку целого ряда вопросов, среди которых первостепенное значение имеют методические подходы и принципы, лежащие в основе такого анализа.
Цель настоящей работы - создание хроматоэлектрофоретического метода как надежного способа прогнозирования склонности вин к помутнениям на основе характеристики их полимерных свойств, обоснование, разработка и испытание на практике высокоэффективной методики определения натуральности вии и идентификации их эталонным образцам. Для этого проведены систематические исследования, направленные на выявление особенностей поведения высокомолекулярных соединений виноградного и плодово-ягодного сока, виноматериала и вина при варьировании технологических параметров для установления общих закономерностей, механизма и путей обеспечения стабильности и качества вин. Получены развернутые количественные характеристики химического состава полимерной фракции вин и ее изменений в зависимости от методов выделения высокомолекулярных соединений и способов стабилизации. Исследованы перспективы создания надежного способа диагностики помутнений вин, оценки их качества на основе количественной характеристики высокомолекулярных соединений и организации специаль- ных лабораторий по оценке качества и соответствия предлагаемых виноматериалов натуральным винам и сокам для охраны здоровья потребителя.
Использование в практике виноделия хроматофоретического метода в научных исследованиях позволит изучить химический состав сырья, полуфабрикатов и готовой продукции, их физико-химические, биологические и технологические возможности с целью создания оптимальных технологических процессов для переработки сырья с максимальной пользой и наилучшими производственными показателями для получения готовой продукции высокого качества, а также повысить надежность химико-аналитического контроля на предприятиях, обеспечить автоматизацию технологических процессов, улучшить качество выпускаемой продукции.
По существу, работа открывает новое направление в энохимии, которое рассматривает вино, как систему, представляющую собой единый комплекс высокомолекулярных соединений и изучает закономерности физико-химических превращений компонентов виноматериала.
Технологическая схема производства виноградного и плодовоягодного виноматериала
Плодово-ягодные экстракты готовят экстрагированием прессованных выжимок сульфитированной водой (150— 200 мг/л SOi). Их разрешается добавлять в сусло до брожения вин с таким расчетом, чтобы при изготовлении купажных крепленых и ароматизированных вин из свежих и сброженно-спиртованных соков с экстрактами было внесено кислот в первом случае не более 25%, во втором—10% суммарного их количества, содержащегося в соках и экстрактах, входящих в состав купажа. Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962—67 и спирт этиловый ректификованный плодовый применяют для приготовления сброженно-спиртованных и спиртованных соков, а также вин. Сахарозу (сахар-песок, ГОСТ 21—57, и сахар-рафинад, ГОСТ 22—бб) применяют в сухом виде или в виде сиропа (75— 80%-ного раствора) для подсахаривания соков перед брожением, а также доведения вин до кондиций по сахаристости. Мед натуральный используют при изготовлении медовых вин для придания им аромата и вкуса, доведения кондиций по сахаристости, а также при производстве некоторых типов специальных вин. Вода питьевая применяется для получения соков II фракции при экстрагировании выжимок, а также разбавления сока до брожения или купажей при изготовлении вин из сброженно-спиртованных соков с целью снижения в них кислотности. Водно-спиртовые настои плодов и различных частей растений применяют при изготовлении ароматизированных, а также некоторых специальных вин. Так, например, технология вин Пайремлык, Лимонное, Чаровница, Латвияс и др. предусматривает введение в купаж водно-спиртовых настоев лимонной цедры, изюма, липового цвета и меда натурального. Прием и оценку качества плодово-ягодного сырья производят так же, как и винограда. Измельчению подвергается практически все сырье. Исключение составляют лишь некоторые ягоды: малина, спелая земляника, прессование которых возможно без дробления. Извлеченные из раздробленного сырья самотек и сок после прессования объединяют. Они составляют сок I фракции. После б—12-часового экстрагирования выжимки вновь прессуют.
Полученный водный экстракт с целью повышения содержания в нем сухих веществ может быть использован повторно для обработки новых партий выжимок. Экстрактивные вещества выжимок таких ягод, как вишня, черная смородина, черника и др., извлекают горячей водой (70—80 С). Объединенные водные экстракты выжимок составляют сок II фракции. Он может быть использован при получении плодово-ягодных вин как отдельно, так и в виде смеси с соком I фракции. Приготовленные соки обеих фракций сульфитиругот до 50— 100 мг/л S02, осветляют отстаиванием, сепарированием (центрифугированием) либо фильтрацией. Осветленный сок затем направляют на приготовление вина, сброженио-спиртованных соков либо на консервирование и хранение. Плодово-ягодные вина могут быть приготовлены из свежих соков или спиртованных материалов: спиртованных либо сброженно-спиртов энных соков. Первые материалы готовят спиртованием свежих соков и их последующей обработкой. Общий технологический цикл составляет 6—19 дней. При приготовлении сброженно-спиртованных соков проводятся следующие технологические операции: Брожение сока - 8 дней; Осветление 3 - 7; Снятие с осадка- Ідень; Спиртование - 1 день; Хранение (условно) и Обработка- 5 - 18 дней. Общий технологический цикл составляет 18-35 дней. Для приготовления столовых сухих белых вин используют осенне-зимние сорта яблок, крыжовник, белую смородину; для розовых — красную смородину, клюкву, яблоки в сочетании с черной смородиной или черникой; для красных — черную смородину и чернику. Их готовят сбраживанием осветленных соков I фракции, а также смеси I и II (водной) фракции, полученной настаиванием выжимок водой (до 30 % к массе выжимок) и последующим ее прессованием. Яблочные сухие столовые вина готовят только из сока I фракции. Кислотность поступающего на брожение сока для повышения качества яблочных вин корректируют купажированием высоко— и низкокислотных соков. При получении сухих вин из крыжовника используют соки I фракции, полученной после ттодбраживания мезги в течение 2— 3 дней, и водные фракции. После смешивания фракций сок разбавляют водой до требуемой кислотности, подсахаривают и сбраживают насухо. Полученное вино обрабатывают и после отдыха и фильтрации направляют на розлив. Технологическая схема приготовления столовых сухих вин включает следующие операции (время проведения представлено в днях): Брожение сока - 30-45; Осветление - 3-7; Снятие с осадка- 1; Обработка виноматериалов 5-18; Отдых 10; Фильтрация и розлив - 1. Общий технологический цикл составляет 50—82 дня. При приготовлении красных сухих столовых вин мезгу обрабатывают пектолитическими ферментными препаратами либо теплом. В первом случае из обработанной мезги получают соки I и П фракции и сбраживают их насухо, как и при изготовлении белых вин. В случае обработки ягод теплом полученную мезгу разбавляют водой до кислотности 12—13 г/л, затем подсахаривают до 8,5—9 % и сбраживают насухо. После прессования и получения сока I фракции готовят сок II фракции, добавляя в мезгу воду. Обе фрак- ции смешивают, обрабатывают и после отдыха и фильтрации направляют на розлив. Столовые полусухие и полусладкие вина готовят из обработанных сухих столовых киноматериалов подсахариванием до заданных кондиций затем фильтруют, разливают горячим способом либо, если ои технически неосуществим на данном предприятии, вносят сорбиновую кислоту из расчета 150—200 мг/л и 40 мг/л S02 или сульфитируют из расчета содержания в вине 300 мг/л S02.
Вина некрепленые получают сбраживанием подсахаренных плодово-ягодных соков без добавления спирта. Соки I и II фракции смешивают и разбавляют водой до кислотности не выше 12 г/л. Затем в сок добавляют сахар из расчета общего его содержания 270 г/л. Сахар добавляют в два приема — вначале доводят сахаристость до 19— 20%), а после завершения бурного брожения при накоплении 11 —11,5% об. спирта вводят оставшееся количество сахара. Брожение проводят на чистой культуре дрожжей с дополнительным азотистым питанием при температуре 20—25 С. Главное брожение (до накопления 11 —11,5% об. спирта) длится 30—50 дней, дображи-вание оставшегося сахара завершается в течение 30—70 дней. По окончании брожения получают виноматериал крепостью 14— 17 % об. спирта. Его осветляют отстаиванием или обрабатывают бентонитом и после отдыха купажируют, вводя нужное количество сахара для обеспечения кондиций вина. Сортовые вина готовят из виноматериалов одного наименования (добавление других виноматериалов разрешается в количестве не более 20%), купажкые — из двух или нескольких видов виноматериалов. Готовый купаж выдерживают в течение 210 дней, фильтруют и направляют на розлив. Общий технологический цикл составляет 365 дней. Технологическая схема приготовления некрепленых вин, разработанная ранее в Литве, состоит из следующих операций (в днях): Брожение сока- 120; Осветление (отстаивание или обработка бентонитом) - 10; Переливка- 1; Отстаивание -10; Переливка - 1; Фильтрация - 1; Отдых - 9; Купажирование - 1; Выдержка - 210; Фильтрация и розлив-2. Существующим законодательством о плодово-ягодных винах допускается в зависимости от вида сырья и конкретных условий производства сокращение длительности технологического процесса в этой схеме за счет отдельных технологических операций (например, брожения, выдержки). Крепленые вина готовятся из свежих либо из сброженно-спиртованных соков. В первом случае технологический процесс ведут, как и при получении сброженно-спиртованных соков. Спирта естественного брожения при этом должно быть не менее 5 % об. Общий технологический цикл составляет 29— 46 дней. Технологическая схема приготовления крепленых вин включает следующие операции (в днях): Брожение сока - 81; Осветление 3—7; Снятие с осадка - 1;Купаж с доведением до кондиции - 1; Обработка купажа 5—18; Отдых - 10; Фильтрация и розлив -1 В Белоруссии была разработана технологическая схема приготовления крепленых плодово-ягодных вин улучшенного качества с содержанием в готовом вине спирта естественного брожения не менее 12 % об.
Химические способы исследования отдельных компонентов на туральных соков, виноматериалов и вин
Как правило, измерительные методы исследования используют для изучения отдельных компонентов состава вина [222]. К способам определения белков относятся: специфическое осаждение с целью их концентрирования и очистки различ- иьщи растворами (трихлоруксусной кислоты (ТХУ), сульфата аммония, этиловым спиртом и т. п.); биуретовый метод, метод Кельдаля, окраской амидочерным после осаждения ТХУ, использованием реактива Фолина-Чокальтеу или красителя Ку-масси голубого G-25 0, не требующего предварительного концентрирования белков, методом жидкостной хроматографии, гидролиза и хроматографии аминокислот. Для определения массовой концентрации белков наиболее широко применяется метод Лоури и его модификация — метод Шактерле-Поллак, основанные на цветной реакции с реактивом с реактивом Фолина-Чокальтеу. Методы определения полисахаридов основаны на фенол-серной реакции (или орцинол-серной) на сегодня наиболее апробированной. Перспективными можно считать хроматографические методы, как при определении отдельных полисахарщщых фракций так и олигомерного и мономерного состава. С помощью гель хроматографического метода установлено, что полисахариды с ММ оті00000 и выше находятся в сусле в виде комплексов, а также как низкомолекулярная фракция [231], Для определения углеводов (моно-, ди- и полисахаридов), органических кислот используют следующие методы: коло-риметрию\ спектроколориметрию, полярометрию [232]. Среди способов определения углеводов в виноматериалах заслуживает выи-мания способ на основе модернизированного антронового метода. Авторами разработан анализатор углеводов в виноматериалах. Исследована специфика и условия протекания антроновой реакции с виноматериалом, проведен подбор качественного и количественного состава компонентов модельных (стандартных) растворов для метрологического обеспечения предполагаемого экспресс-анализатора. Опыты показали, что количественное определение углеводов в виноматериалах с помощью антроновой реакции можно проводить иа ФЭК - 56 М с полосой пропускания светофильтра в области длин волы 630 нм f233]. Определение пектиновых веществ (уроновых кислот) проводят при помощи мета-оксидифенила (мета-фенил-фенола) и орсинола для совместного определения галактуроново й кислоты и нейтральных Сахаров, Применение обоих хромогенов позволяет установить содержание указанных веществ в пектинах [234,235].
Разработан спектрофотометрический метод анализа пектиновых веществ в растительных материалах с применением 0 - толуидинового реагента (ОТР), В основе метода лежит реакция моносахаридов с ОТР, приводящая к образованию окрашенных продуктов. Перед анализом пектиновые вещества экстрагируются раствором лимоннокислого аммония и гидролизуются серной кислотой. Проведено сравнение спектрофотометрического и кальцийпектатного методов анализа пекти- новых веществ. Выявлены недостатки кальцийпектатного метода: неполное осаждение полиуроновых кислот, осаждение нейтральных полисахаридов. Предлагаемый метод позволяет определять раздельно гголиуроновые кислоты, гексозаны и пентозани при совместном их присутствии непосредственно з растворе без осаждения пектиновых веществ [236]. Молекулярная масса пектиновых веществ находится в пределах нескольких, десятков-тысяч, поэтому их электрофоретнческое разделение позволяет получить конкретную информацию (ОЭП и моя.массу каждой фракции). К методам определений фенольных веществ относятся перманшнатометри-ческий (классический), колориметрические методы Фолина-Дениса и Фолина-Чокальтеу, а также высокоэффективная жидкостная (ВЭЖХ) или гель-проникаїощая хроматография. 1,7.2. Электрофоретический метод исследования компонентов вина и внноматсриалов Хедрик и Смит подробно исследовали белки методом электрофореза в поли-акриламидном геле и пришли к заключению, что график Фергюсона [223,224] дает важные сведения о заряде и размерах белковых молекул. Заслуживает внимания метод электрофореза с изменением рН. Принцип этого метода заключается в том, что компоненты белковой смеси дважды подвергаются электрофоретическому разделению в одном и том же геле при разных рН . Этим способом удалось разделить два белка, различающихся лишь на одну единицу заряда [225]. Для первого элек-трофоретического разделения был выбран такой рН , при котором двигался лишь один компонент, тогда как другой оставался на старте. Затем изменяли.. заменив прежний буфер на новый, в результате чего второй компонент также приобрел заряд и электрофоретическую подвижность. Аналогичная методика была использована при: изучении, белковых комплексов [226]. Вопрос изучения ИСТОЧНИКОВ ошибок при электрофорезе в полиакриламид-ном геле всегда является актуальным. Во-первых, температурный фактор (повышение температуры только на 1С приводит к увеличению скорости перемещения белков на 20%). Если отвод тепла недостаточен, то образуются.искривленные полосы, так как центральная часть геля обычно нагревается сильнее, чем края, и потому подвижность макромолекул в ней выше. Для устранения этого эффекта нужно использовать более разбавленный гель или буферный раствор, а электрофорез проводить в .холодильнике, Причиной искривления полос может быть также слишком быстрая полимеризация геля: в этом случае целесообразно снизить концентрацию катализаторов полимеризации N, N , N , N - тетраметил-этилен-диамина (ТЕМЭД) и персульфата аммония либо добавить к раствору феррицианид калия. Во-вторых, старение геля, недостаточно чистые реактивы, пузырьки воздуха или неаккуратное наслаивание воды могут вызвать серьезные искажения результатов. Вследствие осаждения белков, особенно на границе концентрирующего и разделяющего гелей, образуются хвосты.
Выпадение белков в осадок относят за счет их чрезмерного концентрирования или взаимодействий белок-белок [227]. В - третьих, плохое разделение компонентов исследуемой смеси может быть также результатом недостаточной длительности опыта, неподходящей концентрации геля, неудачного выбора ионной силы и буфера, слишком высокой ионной силы раствора, содержащего пробу, избыточного выделения тепла или просачивания буфера между стенкой трубки и гелем. При электрофоретическом анализе встречаются многочисленные затруднения охарактеризованные в работе [228]. Во-первых, если очищенный белок при электрофоретическом исследовании оказывается гомогенным, то возникает вопрос о том, какое количество второго компонента может присутствовать, но не быть обнаруженным. Это зависит от ряда факторов. Если подвижность обоих компонентов одинакова при рН данного опыта, то их смесь в любых пропорциях не будет разделяться. Во-вторых, при оценке электрофореграмм сложных смесей белков, в которых присутствуют компоненты, различающиеся в широком интервале подвижно-стей, возникает значительная неопределенность при вычислении концентрации на основе измерения площадей под кривыми. Так как выделение площадей под каждым пиком до некоторой степени произвольно, различие площадей на несколько процентов не может быть достоверным. Из этого следует, что если белковый компонент составляет менее 1 - 2% от общего количества присутствующего белка, то его обнаружение на электрофореграмме окажется невозможным. В-третьих, наличие одного пика на электрофореграмме не обязательно свидетельствует о гомогенности. Так, в сывороточном альбумине при рН 7,0-8,0 обнаруживается один компонент, а при рН 4,0 - два компонента и более [228]. Успех разделения белкового комплекса виноматериалов во многом зависит от правильного подбора рИ геля и электродного буфера. Оказалось, что в большинстве случаев при электрофорезе белков вина нецелесообразно пользоваться кислым буфером [228]. Кроме того, выяснили, что от свойств специфических красителей и свойств продуктов их взаимодействия с белками в значительной мере зависит чув- ствительность метода Б смысле предела обнаружения, благодаря чему появилась возможность трансформации метода в количественный. В тех случаях, когда при окрашивании белков важна чувствительность, использовали, краситель кумаси; если же предъявляли требования к воспроизводимости и прочности связывания с белками, выбирали амидошварц и процион.
Особенности получения и свойства плодово- ягодных соков и вин
Одним из основных условий научного обоснования технологии производства плодово-ягодных соков и вин и улучшения их качества является подбор осветляющих веществ и исследование их влияния на химический состав соков, виноматериалов и вин. Это предопределяет необходимость решения задач ускоренного осветления высокомолекулярными флокулянтами (ВСФ) свежеотжатых плодово-ягодных соков с целью облегчения их фильтрации и использования для выпуска пастеризованных натуральных соков и вин. А также исследование возможности интенсификации процесса осветления белых плодово-ягодных виноматериалов и вин бентонитом и ВСФ, розовых и красных плодово-ягодных виноматериалов и вин ВСФ прямого действия. Кроме того, установить условия их применения и дозировки ВСФ, изучить влияние ВСФ на химический состав и качество плодово-ягодных вин и соков. Натуральные соки, полученные из ягод и плодов путем прессования, содержат частицы ткани и мякоти, клетки дрожжей диких культур, балластные примеси и т. п. Таким образом, уже в самом способе получения плодово-ягодных соков и вин заложена возможность образования помутнений. Белковые помутнения в плодово-ягодных винах и соках возникают относительно редко. Однако белки могут участвовать в образовании помутнений в виде белково-танатного комплекса, вместе с камедями, пектиновыми веществами, катионами поливалентных металлов, а также в процессе отстаивания соков и вин в результате связывания аминной и карбоксильной групп молекулами воды. Очевидно, что выделение осадка обусловлено высокой степенью молекулярно массового взаимодействия разноименных белковых макроионов, обусловленной электростатическим притяжением, которое усиливается в полиэлектролитах вследствие их малой подвижности. А также за счет сил Ван-дер-Ваальсового взаимодействия между гидрофобными молекулами, сопровождаемое в дальнейшем образованием солевых мостиков. Содержание азотистых веществ в плодово-ягодном вине представлено в таблице 3.1. Для белково-таннатно - пектинового комплекса окисление не единственная причина выпадения в осадок красящих веществ в процессе хранения вина. Здесь играют роль также явления коллоидного порядка, взаимодействие антоцианов с альдегидами, конденсация антоцианов, деметоксилирование их, переход антоцианов в лейкоформы. В отдельных сортах айвы, рябины, сливы содержание полифенолов доходит до 10 г/л. Дубильные вещества или таняды делятся на две основные группы: гидро-лизуемые и конденсированные.
Первые представляют собой сложные эфиры или гликозиды, в которых гидроксиды Сахаров ацетилированы галловой или дигалло-вой кислотами. При взаимодействии с солями они приобретают синий цвет, а с белками образуют хлопья и рыхлые осадки. В негидролизуемых или конденсированных дубильных веществах фенольные остатки связаны не эфирными, а С-С или С-ОС связями и под действием солей железа окрашиваются в зеленый цвет. С белками образуют хлопья и рыхлые осадки. В анаэробных условиях танин в соках связывается с соединениями железа, меди, фосфора и находится в растворенном виде. Кислород воздуха нарушает химическое равновесие, в вине образуются нерастворимые соли тяжелых металлов с танином, что вызывает помутнение черного или грязно-синего цвета (металлический касс). Если полифенольные соединения окисляются ферментом оксидазой, то возникший осадок в этом случае называется оксидазным кассом. Медный касс образуется в герметически загсрытых емкостях при содержании диоксида серы и меди до 0.6 мг/л. Главная причина непрозрачности плодово-ягодных вииоматериалов, особенно при содержании до 5 - 8% об. алкоголя - дрожжи. При титровании яблочного сусла обнаружено, что при брожении вииоматериал теряет до 22-23% от исходного количества титруемой кислоты. Плодово-ягодные культуры делятся на быстро темнеющие (яблоки, айва, абрикосы, персики, сливы, клубника, виноград) и медленно темнеющие (цитрусовые, ананасы, дыни, красная смородина). Первая группа содержит полифенолы и оксидазы покоричневения за счет окисления полифенолов при участии кислорода и катехолоксидазы. К причинам потемнения плодово-ягодных соков и вин относятся: реакция между редуцирующими сахарами и аминокислотами, карамелизация, иногда отмечают существенное влияние кислорода без участия ферментов, а также ферментативное покоричневение. К не ферментативному потемнению относят также взаимодействия аминокислот или белков с сахарами, аминокислот с аскарбиновой кислотой и карбонильными соединениями (фурфурол и т. п.), взаимодействие Сахаров с органическими кислотами (лимонной, винной и т. п.). Отметим, что осветлить исследуемые образцы фильтрованием в большинстве случаев невозможно, поскольку частицы, вызывающие помутнение сразу закупоривают поры фильтрующих перегородок. Термическая обработка предполагает строительство дорогостоящих холодильных установок и потерю интенсивности окраски. Ферментативная обработка ограничивается возможностью загустевания и помутнения соков.
Выбор высокомолекулярных синтетических флокулянтов (ВСФ) для осветления плодово-ягодных соков и вин, а именно, полиакриламида (ПАА), ионнооб-менных смол КФ-4 и КФ-6, полиэтиленоксида (ПЭО) обусловлен высокой молекулярной массой, высокой эффективностью иоииогенных групп, способностью к флокуляции в зависимости от конкретных условий производства, отсутствием токсичности. ПАА и ПЭО - неионогенные флокулянты выпускаются промышленностью в довольно больших объемах, ПЭО абсолютно нетоксичен. Катиоииые флокулянты на основе ПАА серии КФ способны к образованию положительных зарядов на макроионах за счет внедрения в ПАА нуклеофильных групп. Флокулянты использовались как совместно с бентонитом (природный порошкообразный минерал) в качестве ускорителя осаждения, так и самостоятельно в качестве флокулянтов прямого действия. Оптимальные дозы устанавливались опытным путем. Степень и кинетику осветления изучали визуальным и фотометрическим методами. Бентонит вносился в виде 10% сокобентонитовой суспензии, флокулянты в виде 1% водного винно-соковых растворов. рН соков и виноматериалов измеряли на приборах рН-301 и Потенциал. Дозировка флокулянтов ПАА, КФ-4 и КФ-6 составляла 25 мг/г, время отстоя 1 час. Фотометрические исследования проводили на длине волны 550 нм в кювете 10 мм. Установлено, что применение ПАА оказывает наименьшее воздействие. При оптимальном рН= 3.5 — 4,2 возможна флокуляция с помощью ВСФ практически всех мутных соков и виноматериала таблица 3.2, при этом ВСФ обеспечивают стойкость к спиртовому брожению за счет резкого снижения дрожжевых клеток. В данном параграфе представлены материалы о влиянии обработки ВСФ на некоторые общепринятые физико-химические характеристики плодово-ягодных соков и изготовляемых из них виноматериалов. Специфической особенностью плодово-ягодного виноделия является часто наблюдаемая стойкая мутность виномагериалов. Существующими технологическими схемами для ликвидации этого недостатка предусмотрено самоосветление или обработка бентонитом. По этим схемам на проведение указанных операций отводится от 5 до 12 дней. Несмотря на то, что эти сроки являются достаточно длительными, фактически на производстве в них редко укладываются, так; как самоосветление, в особенности сливовых и яблочных соков, продолжается в течение нескольких месяцев, а стабилизация бентонитом около двух недель. Для улучшения качества и сокращения времени осветления соков мы использовали совместно с бентонитом ПАА (в качестве ускорителя его осаждения), а катионные флокулянты и полиэтиленоксид применялись совместно с бентонитом и самостоятельно в качестве, так называемых, флокулянтов прямого действия, непосредственно осаждающих мутящие компоненты вин.
Спектрофотометрическое изучение различных типов вин и ком понентов виноматериалов
В настоящее время основным методом анализа натуральных вин и соков является преимущественное оргаполептические, визуальные и спектрофотометриче-ские методы исследования. Было проведено изучение различных вин, отличающихся по типу, составу, по технологии их изготовления. Исследованию подвергались сухие столовые вина виноградные и натуральные плодово-ягодные, крепленые крепкие и десертные - отечественного производства и зарубежные, а также коньяки разных марок. Измерения проводились с предварительной подготовкой образцов, описанной в разделе методик исследований. Все вина спектрофотометрировались в-ультрафиолетовой части спектра, где, согласно многочисленным литературным данным, отмеченным ранее, наиболее выражено различие в их спектрах поглощения. Оптическое поглощение в видимой части спектра, небольшое по величине и не различающееся резко для разных типов вин, в дальнейшем измерялось только при их получении из сусла. Исключение составляли также коньяки, для которых такие измерения проводились в силу особой необходимости. Проведенные исследования показали, что кривые поглощения ультрафиолетового света для различных типов вин по своему характеру идентичны кривым, описанным в литературе впервые Н.М.Сисакяном, В.Б. Евстигнеевым, И.А. Егоровым (1948). И подробно рассмотренные позднее И.А. Егоровым (1966). Некоторые расхождения имеются лишь в определении положения максимума поглощения света, который в исследовавшихся типах вин постоянно находился в диапазоне длин волн от 270 до 280 нм (рис.3.5), Изучение абсорбции света в ультрафиолетовой области показало значительное различие в спектрах поглощения столовых сухих и крепленых вин. Это различие выражалось в самом характере кривой, а также величине поглощения света. Так, для сухих столовых вин характерным являлся незначительным максимум в диапазоне длин волн от 270 до 280 нм или площадка равного поглощения в этом же диапазоне. Величина поглощения света на этом участке спектра для исследованных столовых сухих вин, а также сухих виноматериалов, полученных сбраживанием различных виноградных соков, как правило, не превышала 10 единиц Е. Подобный характер кривой поглощения ультрафиолетового света был получен и для плодово-ягодного натурального яблочного вина.
Спектры поглощения ультрафиолетового света крепленых вин значительно отличались по характерным особенностям от спектров поглощения сухих столовых вин. Крепленые вина обладали четко выраженным максимумом поглощения света при длине волны около 230 нм (с возможным отклонением до 5 нм в обе стороны): Величина поглощения света в этом диапазоне длин волн - больше 10 единиц. И достигала в некоторых образцах выдержанных вин, а также специальных (мадера, портвейн), 30 единиц Е. Как правило, крепленые вина характеризовались четко очерченным пиком поглощения при длине волны около 280 с перепадом значений в экстремальных точках (максимума и минимума) более 5 единиц Е. Наиболее ярко выраженными отмеченные особенности были у образцов крепленых вин, подвергавшихся тепловой обработке в процессе их изготовления. Нами бьшо отмечено также, что образцы одного типа вин, имеющие большую величину коэффициента экстинкции в максимуме кривой поглощения, как правило, отличались более высокими органолептическими свойствами. Четко очерченный максимум на кривой поглощения света при длине волны около 280 им характерен и для коньяков. Однако, величина его не дает правильного представления о качестве и длительности выдержки готовых коньяков. При этом, определенное влияние на величину максимума поглощения света при 280 нм коньяками может оказывать количество вносимого в них колера. Задачей дальнейших исследований являлось спектрофотометрическое изучение вин на различных этапах их изготовления с целью установления степени влияния используемых технологических приемов на характер оптического поглощения вина в ультрафиолетовой области. Исследования проводились на яблочном сусле, полученном из разносорти-цы. Содержание сахара 17,2% достигалось добавлением в сусло, содержащего 7,5% сахара, фруктозы В приготовленное сусло задавалась разводка чистой культуры дрожжей (раса Шампанская 7) из расчета 4% к объему. В процессе брожения после сбраживания 11% сахара подвергалось исследованию бродящее сусло. При достижении сахаристости в сусле из яблок -5%, а в сусле, полученном добавлением фруктозы - 10% производилось крепление спиртом-ректификатом высшей очистки до кондиций, соответствующих кондициям ординарных крепленых вии - 19% об. и 18% об. спирта. Часть сусла сбраживалась насухо. Исследовались полученные сухие и крепленые виноматериалы и эти же виноматериалы, подвергнутые различным видам обработки, наиболее часто применяемым в производстве. Сравнительная характеристика спектров поглощения показывает некоторое различие в кривых оптического поглощения уже у исходного сусла до брожения. Кривая поглощения яблочного сока имеет в области длин волн около 260-280 нм площадку равного поглощения с коэффициентом экстинкции Е около 13 (рис.3.б). Сусло, полученное добавлением фруктозы, имело кривую поглощения с ясно выраженным максимумом при длине волны около 280 им (рис.3.7). Исследования показали, что бродящее сусло и полученные из него сухой и крепленый виноматериалы имеют характер кривых оптического поглощения в ультрафиолетовой части спектра подобный исходному суслу. Аналогичный характер кривой поглощения был получен для бродящего сусла и крепленого виноматериала, приготовленного из вакуум-сусла. Однако в этом случае наблюдалось сглаживание отмеченного у исходного разбавленного вакуум-сусла максимума при 280 нм в процессе брожения.
Величина оптического поглощения исследуемыми образцами в ультрафиолетовой части спектра при брожении уменьшалась. Так, для исходного яблочного сусла коэффициент экстишщии при длине волны 270нм был равен 13, у бродящего сусла он снизился до 10 единиц, для крепленого виноматериала был равен 7,5 единицам, для сухого - 6,5 единицам (рис.3.6). Несколько меньшее снижение величины поглощения оптического поглощения наблюдалось нами для подобных образцов, сусла с добавлением фруктозы (рис.3.7), При двухмесячном хранении виноматериалов, полученных из свежих яблок, наблюдалось достаточно хорошее естественное их осветление. Спектры оптического, поглощения осветлившихся виноматериалов отличались от спектров поглощения свежеприготовленных виноматериалов лишь величиной оптического поглощения. У естественно осветлившихся образцов величина поглощения света по всему спектру была несколько ниже, хотя характер кривой поглощения сохранялся (рис.3.6). Исследования, проведенные в видимой части спектра для образцов виноматериалов, полученных в процессе брожения из свежего яблочного сусла, показали незначительные различия в величине оптической плотности. Характер кривой поглощения света сохранялся, при этом, от исходного сусла до готовых виноматериалов (рис.3.8). Заметные различия в величине поглощения бродящего сусла и готовых виноматериалов подтверждают большое влияние мутности образцов на величину поглощения в видимой части спектра. Сухой и крепленый виноматериалы, приготовленные из свежего яблочного сус-ла в дальнейшем были подвергнуты различным приемам технологической обработки, обычно принятым в винодельческом производстве. Образцы обрабатывались: бентонитом (из расчета 5 г/дал), предварительно набухавшем в малом количестве виноматериалов в течение 2-х часов; кизельгуром - путем фильтрации через намытый фильтр; альбумином крови (из расчета .5 г/дал); смесью оклеивающих веществ из расчета 1 г/дал); ионитами.- фильтрацией через колонку, наполненную предварительно обработанным в %% растворе НС1 катиоиитом СДВ-3; теплом - кратковременной пастеризацией (20 мин при 70 С) и нагреванием в течение суток при температуре 65-70С. Образцы, не подвергавшиеся в процессе обработки фильтрации, были перед спектрофотометрировани-ем профильтрованы. Сухой виноматериал обрабатывался также гексациано-(П)-ферратом калия (ЖКС) (из расчета 0,5 г/дал). Однако эта доза для данного виномате-риала оказалась завышенной, что было установлено последующей пробной обработкой.
