Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Введение 9
1.2. Оптические свойства гидрозолей композитных наночастиц (КНЧ) с диэлектрическим ядром и металлической оболочкой 10
1.2.1. Локализованный поверхностный плазмонный резонанс (ЛППР) 10
1.2.2. Зависимость положения и интенсивности ЛППР от структуры КНЧ 13
1.2.3. Эффект усиления гигантского комбинационного рассеяния света и флуоресценции вблизи поверхности КНЧ со структурой «ядро/металлическая оболочка» 16
1.3. Синтез КНЧ и модификация их поверхности 18
1.3.1. Синтез КНЧ 18
1.3.2. Модификация поверхности частиц с диэлектрическим ядром и металлической оболочкой 30
1.4. Возможные биомедицинские приложения КНЧ яд ро/серебряная оболочка 31
Глава 2. Методическая часть 34
2.1. Реактивы и материалы 34
2.2. Синтез наночастиц со структурой «ядро/оболочка»
2.2.1. Наночастицы Si02 36
2.2.2. Мезопористые наночастицы Si02 36
2.2.3. Наночастицы (гидр)оксида железа 36
2.2.4. Модификация поверхности частиц-ядер 37
2.2.5. Синтез затравочных наночастиц серебра 38
2.2.6. Синтез затравочных наночастиц золота 38
2.2.7. Синтез затравочных наночастиц серебра в присутствии частиц-ядер
2.2.8. Адсорбция затравочных наночастиц металла на поверхности ядер 39
2.2.9. Синтез металлической оболочки на поверхности ядер 40
2.2.9.1. Восстановление ионов серебра аскорбиновой кислотой 40
2.2.9.2. Восстановление ионов металла (Ag, Au) формаль дегидом 40
2.3. Модификация поверхности КНЧ «ядро/оболочка» полиэти ленгликолем 41
2.4. Исследование устойчивости коллоидных растворов КНЧ со структурой «ядро/оболочка» 42
2.5. Биомедицинские эксперименты
2.5.1. Количественный анализ золота и серебра в тканях и органах мышей 43
2.5.2. Импульсная лазерная гипертермия 43
2.6. Основные методы исследования 44
2.6.1. Просвечивающая электронная микроскопия 44
2.6.2. Оптическая спектроскопия 44
2.6.3. Динамическое рассеяние света 45
2.6.4. Адсорбционная порометрия 45
2.6.5. Атомно-абсорбционная спектроскопия 46
3. Результаты и их обсуждение 47
3.1. Синтез КНЧ «ядро/А-оболочка»
3.1.1. Синтез ядер требуемых размера и формы 47
3.1.2. Модификация поверхности частиц-ядер 52
3.1.3. Получение затравочных наночастиц металла 54
3.1.4. Адсорбция затравочных наночастиц Au на поверхности различных ядер 63
3.1.5. Формирование Ag-оболочки на поверхности ядер 67
3.1.6. Исследование агрегативной устойчивости коллоидных рас творов КНЧ ядро/металлическая оболочка и их конъюгатов с по лиэтиленгликолем 94
3.2. Биомедицинские эксперименты 103
Общие выводы 117
Благодарности 118
Список литературы
- Локализованный поверхностный плазмонный резонанс (ЛППР)
- Синтез КНЧ и модификация их поверхности
- Синтез затравочных наночастиц серебра в присутствии частиц-ядер
- Адсорбция затравочных наночастиц Au на поверхности различных ядер
Введение к работе
Актуальность темы
Проблема получения дисперсий композитных наночастиц (КНЧ), состоящих из диэлектрического или магнитного ядра и металлической (в первую очередь, золотой или серебряной) оболочки с заданным положением локализованного поверхностного плазмонного резонанса (ЛППР) в последнее десятилетие является одним из актуальных направлений физической химии. Это объясняется сочетанием уникальных оптических свойств таких частиц, их высокой химической инертности и, одновременно, возможности ковалентного закрепления на их поверхности молекул с той или иной функцией. Главным достоинством КНЧ является возможность тонкой «настройки» их ЛППР на нужную длину волны в видимой и ближней ИК областях за счет варьирования размера и/или формы ядра и толщины оболочки. Кроме того, такое варьирование позволяет обеспечить требуемое соотношение относительных вкладов рассеяния и поглощения в спектр экстинкции. Все это делает весьма перспективным применение КНЧ в медицине для диагностики и для терапии злокачественных новообразований.
Отметим, что одним из основных условий обеспечения высокой эффективности методов терапии опухолей (например, импульсной лазерной гипертермии - ИЛГ) является использование лазеров с длиной волны от 600 до 1100 нм (соответствующей «окну прозрачности» биологических тканей), поскольку в этом случае достигается максимальная глубина проникновения излучения в организм. В этой связи особый интерес вызывают наночастицы (НЧ), максимум ЛППР которых находится именно в этом оптическом диапазоне.
Методы синтеза сферических КНЧ с ядром из диоксида кремния и золотой оболочкой отработаны достаточно хорошо. Однако конструирование аналогичных наноструктур на основе серебра до настоящего времени являлось практически нерешенной задачей. В то же время они, на наш взгляд, более перспективны, т.к. Ag обладает значительно большим сечением резонансного поглощения по сравнению с Аи (что весьма существенно при ИЛГ опухолей) и ярко выраженными бактерицидными свойствами.
Цели работы
Синтез композитных наночастиц с диэлектрическим или магнитным ядром и металлической оболочкой, характеризующихся возможностью тонкой настройки положения ЛППР в диапазоне 600-1100 нм.
Определение возможности использования таких КНЧ в качестве термосенсибилизаторов при ИЛГ злокачественных новообразований.
Разработка и реализация коллоидно-химического способа синтеза новых бифункциональных КНЧ с настраиваемым положением ЛППР, ядро которых представляет собой «контейнер», который может быть загружен тем или иным лекарственным препаратом.
Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи.
С использованием как существующих, так и специально разработанных методик синтезировать наночастицы-ядра заданного размера, состава и формы (в том числе с развитой пористой структурой), а также отработать способы химического модифицирования их поверхности, обеспечивающие в дальнейшем формирование на таких частицах тонкой сплошной металлической (в первую очередь - серебряной) оболочки.
Синтезировать ультрамалые НЧ металла (золота и серебра) и оптимизировать физико-химические параметры процесса получения плотного моно-слойного ансамбля таких НЧ на поверхности частиц-ядер.
Исследовать влияние типа восстановителя ионов Ag+ на структуру серебряных оболочек, формирующихся на ядрах различной природы, формы и размера, и определить оптимальные условия синтеза, позволяющие получить частицы с оболочкой контролируемой толщины и, как следствие, с точно настраиваемым положением ЛППР.
Модифицировать полученные КНЧ молекулами биосовместимого полимера - полиэтиленгликоля (ПЭГ) с целью повышения агрегативной устойчивости коллоидных растворов, содержащих такие частицы, в присутствии
сильного электролита и обеспечения их последующей длительной циркуляции в кровотоке. 5. Исследовать возможность использования КНЧ «ядро/металлическая оболочка» в качестве термосенсибилизаторов при ИЛГ злокачественных новообразований.
Основные методы исследования: в работе применяли просвечивающую электронную микроскопию (ПЭМ), динамическое рассеяние света (ДРС), спек-трофотомерию в видимой и ближней ИК областях спектра, адсорбционную по-рометрию, атомно-абсорбционную спектроскопию.
Научная новизна:
- разработаны оригинальные коллоидно-химические методы синтеза
дисперсий композитных наночастиц со сферическим или анизотропным ядром
и серебряной оболочкой, и впервые получены систематические данные о влия
нии условий синтеза на структуру и, как следствие, оптические свойства таких
частиц, в частности, на их плазмонно-резонансные характеристики;
синтезированы КНЧ с однородной серебряной оболочкой, характеризующиеся максимумом поглощения в диапазоне длин волн от 600 до 1100 нм и обладающие существенно большим сечением резонансного поглощения по сравнению с аналогичными плазмонными структурами на основе золота;
разработан и реализован способ синтеза конъюгатов ПЭГ и КНЧ со сферическим или веретенообразным ядром и серебряной оболочкой, и получена информация об агрегативной устойчивости коллоидных растворов, содержащих такие конъюгаты;
впервые проведены медико-биологические эксперименты in vivo по ИЛГ злокачественных новообразований у мышей с применением в качестве термосенсибилизаторов сферических КНЧ с серебряной оболочкой и анизотропных КНЧ с оболочкой из Аи или Ag; оценена эффективность действия таких наноструктур;
- принципиально новыми являются результаты исследования возможности создания бифункциональных композитных наночастиц, состоящих из мезо-пористого БЮг-ядра, способного выступать в качестве контейнера для лекарственного препарата, и серебряной оболочки.
Практическая значимость работы
В ходе выполнения работы были получены результаты, обладающие несомненной практической ценностью. Во-первых, впервые синтезированы композитные наночастицы с однородной серебряной оболочкой, характеризующиеся возможностью тонкой настройки положения ЛППР в широком оптическом диапазоне. Результаты биомедицинских испытаний in vivo свидетельствуют о высокой эффективности термосенсибилизирующего действия указанных КНЧ при лазерной гипертермии злокачественных новообразований.
Во-вторых, разработан и реализован оригинальный метод получения бифункциональных композитных наночастиц-контейнеров для лекарственных препаратов с мезопористым ядром и серебряной оболочкой. Такие структуры могут быть использованы в сочетанном лечении злокачественных новообразований с применением методов ИЛГ и химиотерапии.
Лпробаиия работы
Основные результаты работы докладывались и обсуждались на следующих научных мероприятиях: III Межд. конф-ции по коллоидной химии и физико-химической механике (Россия, Москва, 2008); I Nanomaterials and Nanotech-nology Meeting Nano Ostrava-2008 (Czech Republic, Ostrava, 2008); конф-циях молодых ученых ИФХЭ РАН (Россия, Москва, 2008 и 2009 гг.); I Межд. форуме по нанотехнологиям (Россия, Москва, 2008); 3-я Троицкая конф-ция «Медицинская физика и инновации в медицине» (Россия, Троицк, 2008); XV и XVI Всероссийских конф-циях «Структура и динамика молекулярных систем» (Россия, Казань, 2008 и 2009 гг.); Trends in Nanoscience (Germany, Kloster Irsee, 2009); Nanospain (Spain, Zaragoza, 2009); Научно-практической конф-ции с
межд. участием «Совершенствование медицинской помощи при онкологических заболеваниях, включая актуальные проблемы детской гематологии и онкологии. Национальная программа» (Россия, Москва, 2009); Съезде аналитиков России «Аналитическая химия - новые методы и возможности» (Россия, Клязьма, 2010); III Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2010» (Россия, Москва, 2010), XLVI Zakopane School of Physics "Breaking frontiers: Submicron structures in physics and biology" (Poland, Zakopane, 2011); XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Россия, Волгоград, 2011).
Публикации
Основное содержание диссертации изложено в одной монографии, 5 статьях, в том числе в 3-х - в журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук, а также в тезисах 11 докладов на конференциях разного уровня.
Личный вклад автора состоит в постановке и проведении экспериментов, анализе и обобщении результатов исследований.
Эксперименты по изучению элементов фармакокинетики КНЧ после внутривенного введения их дисперсий подопытным животным, а также эффективности термосенсибилизирующего действия КНЧ в ИЛГ опухолей проведены совместно с сотрудниками ГЕОХИ РАН (к.х.н. Э.М. Седых, Л.Н. Банных), ФГУП «ГНЦ «НИОПИК» (к.ф.-м.н. Б.Я. Коганом), РОНЦ РАМН (д.м.н. Р.И. Якубовской, к.м.н. А.А. Панкратовым).
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 129 страницах, содержит 4 таблицы, 40 рисунков, 4 диаграммы и состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, основных выводов и биб-
лиографического списка, содержащего 111 ссылок на цитируемые литературные источники.
Локализованный поверхностный плазмонный резонанс (ЛППР)
Согласно [18] для КНЧ с диэлектрическим ядром и металлической оболочкой существует возможность получения одинаковых относительных вкладов рассеяния и поглощения в спектр экстинкции. Так, например, для КНЧ «сферическое ядро/Аи-оболочка» разного размера (радиус частиц варьировали от 10 до 80 нм) были рассчитаны коэффициенты поглощения и рассеяния при фиксированном значении D/H= 0.8. На рис. 1.5 представлены зависимости этих коэффициентов от внешнего радиуса R частицы. Оказалось, что для КНЧ с R 100 нм вклады от рассеяния и поглощения приблизительно равны. Таким образом, можно конструировать КНЧ ядро/оболочка с заданными оптическими коэффициентами, которые могут применяться в медицине как для диагностики, так и для терапии злокачественных опухолей. 20 30 40 50 60 70
Спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) света является весьма эффективным инструментом исследования строения молекул, однако относительно малая интенсивность сигнала ГКР делает его регистрацию достаточно сложной задачей. К настоящему моменту известно множество работ, в которых для усиления сигнала используются агрегаты НЧ серебра, полученные различными способами (см. обзор [20]). Оказалось, что КНЧ со структурой ядро/металлическая оболочка также обладают способностью существенно усиливать электромагнитное поле в непосредственной близости от их поверхности, выступая в качестве своеобразных нанолинз [21-23].
Большой интерес представляет недавно опубликованная работа [24], в которой предложен универсальный метод получения ансамблей КНЧ «ядро/Ag-оболочка» с контролируемыми оптическими свойствами. Авторы исследовали зависимость коэффициент усиления ГКР от размера КНЧ и расстояния между ними. Максимальное усиление ГКР наблюдалось в случае КНЧ «ядро/Ag-оболочка» диаметром 60 нм, адсорбированных на планарной подложке, при межчастичном расстоянии 20 нм. Коэффициент усиления оказался на 7 порядков больше, чем для серебряных пленок, полученных традиционной реакцией Толленса (реакцией «серебряного зеркала»).
Увеличение интенсивности (напряженности) электрического поля вблизи поверхности КНЧ при возбуждении поверхностного плазмона наряду с описанным выше усилением ГКР света приводит и к росту интенсивности флуоресценции молекул красителя, адсорбированных на поверхности частиц. Отметим, что наибольший эффект усиления наблюдается при совпадении длины волны, соответствующей максимуму J1111 IP, и длины волны возбуждения флуоресценции.
В случае КНЧ ядро/металлическая оболочка существует возможность введения флуоресцирующих молекул органических красителей (родамина, фта-лоцианинов, нильского голубого и др.) непосредственно в кремнеземное ядро с последующим формированием на нем сплошной металлической оболочки [25-28]. При этом ограничивается доступ к ядру кислорода, способного вступать в фотохимические реакции с молекулами флуорофора. Показано [25-28], что по мере увеличения толщины оболочки наблюдается рост интенсивности флуо ресценции и резкое уменьшение времени жизни возбужденного состояния флу-орофора. Последнее способствует увеличению его фотостабильности, поскольку фотохимическим превращениям подвергается главным образом возбужденное состояние красителя.
Следует, в частности, отметить работу [28], результаты которой свидетельствуют о многократном увеличении интенсивности флуоресценции и уменьшении времени жизни возбужденного состояния комплекса Еи(3+). На рис. 1.6. представлены спектры флуоресценции Еи(3+), инкапсулированного в КНЧ с ядром из SiCb диаметром 50 нм и серебряной оболочкой разной толщины (от 5 до 60 нм). Концентрация комплекса Еи(3+) в КНЧ составляла 1 х Ю"4 М. Видно (см. рис. 1.6), что интенсивность флуоресценции немонотонно зависит от толщины металлической оболочки. Наибольшее усиление флуоресценции (примерно в 9 раз по сравнению с комплексом Еи(3+), инкапсулированным в частицы кремнезема, при той же его концентрации) наблюдается для КНЧ с серебряной оболочкой толщиной 20 нм.
Таким образом, очевидно, что КНЧ «ядро/металлическая оболочка» способны выступать в качестве флуоресцирующих «молекулярных» зондов, позволяющих существенно увеличить контрастность изображения и глубину зондирования. Как следствие, они представляют существенный интерес с точки зрения диагностики опасных заболеваний (в частности, онкологических).
Синтез КНЧ и модификация их поверхности
Модификация поверхности наночастиц-ядер Для прививки органосиланов на поверхность кремнеземных частиц к 10 мл их коллоидного раствора добавляли 10-12 мкл АПТЭС или МПТЭС. Необходимое количество органосилана рассчитывали исходя из монослойного заполнения поверхности частиц-ядер его молекулами (площадь, занимаемая мо-лекулой органосилана на поверхности, составляет 0.6 нм [16]). Отметим, что введенный в коллоидный раствор органосилан может расходоваться по двум «каналам». Часть молекул идет на покрытие поверхности частиц-ядер, а часть (большая, согласно данным [16]) полимеризуется в объеме раствора. Поэтому для формирования на поверхности ядер плотного монослоя органосилана его вводили в большом избытке (примерно в 10 раз больше, чем требуется для монослойного заполнения). Реакционную смесь интенсивно перемешивали в течение длительного времени (17 ч) при комнатной температуре. После этого для завершения реакции ее дополнительно прогревали с обратным холодильником 1 ч при повышенной температуре (« 65С).
Аналогичным образом модифицировали частицы из мезопористого кремнезема и (гидр)оксида железа. Однако прежде чем модифицировать наночасти-цы-ядра изБеООН, необходимо было перевести их из водной в спиртовую дисперсионную среду во избежание полимеризации органосилана в объеме реакционной системы. С этой целью частицы осаждали центрифугированием в течение 15 мин при скорости вращения ротора 10000 об./мин. Полученный осадок редиспергировали в таком же количестве этанола. Эту процедуру повторяли дважды, затем еще раз осаждали наночастицы FeOOH в тех же условиях и редиспергировали в безводном этаноле, уменьшив его объем в два раза.
Модифицированные АПТЭС или МПТЭС частицы Si02 и FeOOH отделили от избытка реагентов и продуктов реакции путем многократного центрифу-гирования/редиспергирования в абсолютированном этаноле, а на заключительном этапе редиспергировали в деионизованной воде.
Для оценки степени прививки органосиланов были проведены измерения зависимости -потенциала исходных и модифицированных частиц Si02 обоих типов и частиц FeOOH от рН среды. Значение рН варьировали в диапазоне 2.9-10.7 путем добавления к гидрозолю заданных количеств NaOH и НС1. Для удобства введем следующие обозначения для модифицированных органосила-нами частиц «простого» и пористого Si02 и FeOOH: Si02-NH2, Si02-SH, Si02(nop.)-NH2,Si02(nop.)-SH, FeOOH-NH2, FeOOH-SH.
1. К 50 мл раствора нитрата серебра концентрации 0.5 мМ прилили 50 мл раствора цитрата натрия такой же концентрации. Затем к этой смеси при интенсивном перемешивании добавили 1.5 мл раствора борогидрида натрия концентрации 10 мМ (реакционная смесь мгновенно стала темно-коричневой, что свидетельствует о быстром протекании реакции восстановления). Перемешивание продолжали в течение 30 с. По окончании этого времени цвет коллоидного раствора стал ярко-желтым.
2. К 50 мл раствора цитрата натрия концентрации 0.6 мг/мл добавили 10 мг AgN03. К этой реакционной смеси сначала из пипетки добавили 1 мл 0.1 н. раствора NaOH со скоростью введения « 8.5 мкл/с, а затем 10 мл раствора аскорбиновой кислоты концентрации 2 мг/мл со скоростью 33.5 мкл/с. Интенсивное перемешивание продолжали еще в течение 1 часа.
2.2.6. Синтез затравочных частиц золота К 45.5 мл деионизованной воды добавили при перемешивании 1.5 мл 0.2 н. раствора NaOH, 1 мл водного раствора ТГФХ концентрации 9.6 мг/мл и, спустя разные промежутки времени (от 0 до 5 мин), 2 мл 1 %-ного раствора НАиСЦ. Полученный золь в течение 2-х недель хранили в холодильнике при 4С перед использованием в дальнейших экспериментах. Средний диаметр частиц, определенный методом ДРС, составил около 3 нм. Концентрация частиц в золе — 7 х Ю мл1.
2.2.7. Синтез затравочных частиц серебра в присутствии частиц-ядер В ходе наших экспериментов была исследована возможность синтеза затравочных наночастиц Ag в присутствии частиц ПС-латекса или аминирован-ного Si02. Определены оптимальные условия процесса, обеспечивающие нук-леацию и рост наночастиц серебра преимущественно на поверхности частиц-ядер. Установлено, что смесь коллоидного раствора, содержащего частицы-ядра, с раствором нитрата серебра необходимо выдерживать в течение как минимум 10 мин перед добавлением раствора борогидрида натрия.
Эксперименты проводили следующим образом. К 1 мл дисперсии поли-стирольного латекса добавили 8 мл деионизованной воды, затем по 1 мл растворов AgN03 и NaBH4 концентрации 0.24 М и 4 х 10"2 М соответственно. Цвет раствора мгновенно изменился с молочно-белого на мутно-зеленый, что свидетельствовало о восстановлении ионов серебра и формировании наночастиц металла. Для удобства обозначим этот золь как ПС/Ag.
К 4.5 мл предварительно синтезированного золя Si02-NH2 концентрации ЗхЮ мл" добавили по 0.5 мл растворов AgN03 и NaBR концентрации 0.24 М и 4x10" М соответственно. Цвет раствора мгновенно изменился с молочно-белого на песочно-зеленый. Далее этот золь обозначен как Si02-NH2/Ag.
Удаление наночастиц металла, образовавшихся в объеме раствора, осуществляли путем центрифугирования системы со скоростью 5000 об ./мин в течение 15 мин. Осадок редиспергировали в 0.1 мае. % растворе цитрата натрия или в деионизованной воде.
Синтез затравочных наночастиц серебра в присутствии частиц-ядер
Прежде чем приступить к получению композитных наночастиц «ядро/металлическая оболочка», мы решили оценить плазмонно-резонансные свойства сферических КНЧ ядро/А-оболочка. С этой целью с использованием многочастичного решения Ми [11] были рассчитаны спектры экстинкции КНЧ с ядром из кремнезема диаметром от 80 до 150 нм и серебряной оболочкой толщиной от 10 до 30 нм.
В качестве примера на рис. 3.12 представлены расчетные спектры экстинкции для КНЧ с диаметром ядра 90 и 120 нм. Видно, что такие частицы характеризуются достаточно интенсивным пиком в длинноволновой области спектра, отвечающим дипольному плазмонному резонансу, и одним или несколькими пиками на меньших длинах волн, относящимися к резонансам более высоких порядков. Увеличение //расч. приводит к закономерному смещению положения ЛППР в синюю область [8].
Проанализировав результаты расчетов, мы сочли целесообразным использовать для синтеза КНЧ частицы-ядра диаметром от 90 до 120 нм. Во-первых, максимум ЛППР таких частиц находится в видимой области при достаточно значительном изменении толщины оболочки (рис. 3.12); это позволяет вести визуальный контроль процесса формирования оболочки. Во-вторых, КНЧ диаметром 100-200 нм, сформированные на ядрах такого размера, представляют существенный интерес с точки зрения их использования в медицине (в частности, для диагностики и терапии опухолей).
Синтез серебряной оболочки с использованием аскорбиновой кислоты в качестве восстановителя ионов Ag
На начальном этапе работы были выполнены несколько серий экспериментов по исследованию возможности синтеза сплошных серебряных оболочек на ядрах различной природы и формы с использованием в качестве восстановителя аскорбиновой кислоты [94]. 10
Вообще говоря, необходимую толщину оболочки можно обеспечить с помощью двух подходов: изменяя объем золя, содержащего частицы-ядра с затравочными НЧ металла на их поверхности, при постоянном количестве доращивающей смеси либо, наоборот, варьируя объемы растворов AgN03 и СбНзОб при фиксированном содержании таких ядер. Мы выбрали второй способ варьирования толщины серебряной оболочки.
В общем виде методика синтеза заключается в следующем. Перед синтезом оболочки золь, содержащий ядра с затравочными наночастицами Аи ИЛИ Ag, разбавляли раствором цитрата натрия до числовой концентрации от 2 х 10 до 2 х 107 частица/мл. Цитрат натрия в данном случае вводили для стабилизации формирующихся КНЧ. К порциям этого золя объемом 1 мл каждая добавляли равные объемы растворов AgN03 и аскорбиновой кислоты с концентрацией от 0.56 до 5.6 мг/мл и от 0.28 до 2.8 мг/мл соответственно.
Результаты экспериментов показали, что в растворе смеси AgN03, СбНвОб и Na3C6H507-2H20 действительно имеет место рост затравочных металлических наночастиц, адсорбированных на частицах-ядрах. Подчеркнем, что в отсутствие затравки восстановления ионов серебра не происходит (нет видимых изменений цвета раствора). Не наблюдается и поглощения в области 410 нм в спектре экстинкции, характерного для серебряных наночастиц.
Очевидно, адсорбированные на поверхности частиц-ядер затравочные НЧ металла катализируют окисление аскорбиновой кислоты и восстановление ионов Ag+. Как отмечалось выше, каждая такая наночастица выступает в качестве «наноэлектрода», на котором протекает электрохимическая реакция. Процесс восстановления ионов Ag+ на «наноэлектроде» оказывается термодинамически более выгодным, чем в объеме коллоидного раствора. Это вызвано различием в значениях окислительно-восстановительного потенциала пар Ag+/AgnoB. и Ag /Ag на поверхности наночастиц и в объеме раствора соответственно. Аналогичную картину наблюдали для частиц платины [90].
На начальной стадии была исследована возможность получения серебряных оболочек на ядрах из диоксида кремния, покрытых золотыми затравочными наночастицами3.
На рис. 3.13 представлены спектры экстинкции гидрозолей, содержащих композитные наночастицы с диаметром БіОг-ядра 120 нм и //расч. оболочки от 10 до 45 нм. Видно, что при минимальном значении //расч. в спектре золя наблюдаются два довольно широких пика ЛППР на длинах волн 440 и 600 нм. Такой вид спектра, на наш взгляд, указывает на то, что на поверхности частиц-ядер имеет место рост затравочных НЧ и их частичная коалесценция, тогда как сплошная серебряная оболочка не образуется. При увеличении 7/расч. положение ЛППР смещается от примерно 600 до 750 нм (кривые 1—4). Согласно [8], это может указывать на то, что даже при достаточно большом значении Нрасч., равном 30-40 нм, формирования сплошной оболочки не происходит. Однако анализ данных ПЭМ показал (см. вставку на рис. 3.13), что такие КНЧ характеризуются сплошной Ag-оболочкой с весьма неоднородной структурой. В первом приближении такую оболочку можно рассматривать как «двумерный» агрегат, состоящий из достаточно крупных частиц серебра, некоторые из которых уже приобрели огранку. При этом, судя по данным ПЭМ, можно говорить о преимущественном росте этих частиц в направлении, нормальном к поверхности ядра. Формирование такой дефектной оболочки из взаимодействующих наночастиц серебра, очевидно, и объясняет батохромный сдвиг ЛППР с ростом /7расч.. Действительно, по мере увеличения номинального значения толщины на-нооболочки должны увеличиваться и размер образующих ее частиц, и степень их электромагнитного связывания (степень агрегирования), что и приводит к сдвигу ЛППР в длинноволновую область.
Адсорбция затравочных наночастиц Au на поверхности различных ядер
Результаты выполненных нами экспериментов позволяют сделать следующие выводы, касающиеся устойчивости дисперсий КНЧ ядро/металлическая оболочка.
Дисперсии КНЧ всех типов обладают относительно низкой седиментаци-онной устойчивостью вследствие большого размера частиц. Однако даже после кратковременной УЗ-обработки КНЧ очень легко редиспергируются и оптические характеристики коллоидного раствора полностью восстанавливаются. Об этом свидетельствуют спектры экстинкции золей Si02/Ag и FeOOH/Ag (рис. 3.26), измеренные сразу после синтеза и после их озвучивания спустя 1.5 месяца хранения.
При добавлении к дисперсиям КНЧ раствора хлорида натрия их устойчивость существенно уменьшается. В качестве примера на рис. 3.27 представлены спектры экстинкции золя, содержащего частицы FeOOH/Ag, до и после его смешения с раствором NaCl. Видно, что при физиологической концентрации хлорида натрия (0.9 мае. %), заметное (и необратимое) уменьшение оптической плотности раствора, обусловленное агрегированием и последующей седиментацией частиц, имеет место уже спустя 10 мин после введения соли. Спустя 19 ч этот процесс практически полностью завершается.
С учетом имеющихся в литературе данных можно было ожидать, что модификация композитных наночастиц ПЭГ обеспечит повышение устойчивости КНЧ в присутствии хлорида натрия.
О «прививке» ПЭГ на поверхность КНЧ судили по батохромному сдвигу полосы J1111 IP (АХ). Этот сдвиг обусловлен изменением диэлектрической проницаемости среды в непосредственной близости от наночастиц. Значения АХ несколько различаются для КНЧ разных типов. На рис. 3.28 представлены спектры экстинкции исходных и конъюгированных с молекулами ПЭГ композитных частиц ядро/металлическая оболочка. 400
Спектры гидрозоля, содержащего конъюгат ПЭГ и композитных частиц с ядром из FeOOH и серебряной оболочкой, до (7) и после (2-5) его смешения с раствором хлорида натрия. Время после смешения: 1 (2), 5 (3), 20 (4) и 40 суток (5). Концентрация NaCl в гидрозоле - 0.9 мае. %. Конъюгирование КНЧ с ПЭГ действительно существенно повышает агре-гативную устойчивость их дисперсий при физиологических концентрациях NaCl: оптические характеристики соответствующих коллоидных растворов остаются практически неизменными в течение примерно суток (см. рис. 3.29). Заметное изменение спектров, связанное, в первую очередь, с седиментацией большей части КНЧ, наблюдается лишь спустя 30-40 суток после добавления NaCl. Отметим, что агрегативная устойчивость дисперсий КНЧ закономерно уменьшается с ростом числовой концентрации частиц.
В заключение этого раздела следует подчеркнуть, что при исследовании устойчивости дисперсий КНЧ было впервые обнаружено изменение структуры (разрушение) Ag-оболочки композитных частиц в присутствии NaCl. Этот эффект особенно ярко выражен для частиц, полученных «аскорбиновым» методом. Из данных, представленных на рис. 3.30, следует, что добавление к свежеприготовленному гидрозолю Si02/Ag/n3r раствора NaCl до концентрации 0.9 мае. % приводит к постепенному уменьшению оптической плотности этого гидрозоля в длинноволновой области (к 600 нм). Одновременно наблюдается гипсохромный сдвиг максимума экстинкции. Такое изменение оптических характеристик коллоидного раствора обусловлено, на наш взгляд, травлением Ag-оболочки под действием хлорид-ионов. В пользу этого предположения свидетельствуют данные работ, посвященных растворению и/или перекристаллизации наночастиц серебра под действием СГ (см., например, [106]).
Аналогичный (хотя и не так ярко выраженный) эффект разрушения оболочки может иметь место и в процессе длительного пэгелирования КНЧ. На это указывает сравнительный анализ микрофотографий анизотропных КНЧ, сделанных до смешения дисперсии FeOOH/Ag с раствором ПЭГ (рис. 3.31а) и спустя 7 дней после этого (рис. 3.316). Эффект травления наблюдали также в случае золотой оболочки на КНЧ Si02/Au - под действием бифункционального ал-кантиола (цистеамина) [107] или при селективном растворении серебра в НЧ сплава Au-Ag - в присутствии тиолированного ПЭГ [108]. Отметим, что механизмы разрушения оболочки в обоих описанных случаях могут быть достаточно сложными и для их выяснения необходимы дальнейшие эксперименты. Таким образом, нами впервые исследована возможность повышения агре-гативной устойчивости водных коллоидных растворов композитных наноча-стиц со сферическим (SiCb) и анизотропным (FeOOH) ядром и металлическими оболочками в растворах сильных электролитов путем модификации поверхности таких частиц тиолированным полиэтиленгликолем. Показано, что такая модификация действительно обеспечивает возрастание агрегативной устойчивости соответствующих дисперсий при физиологических концентрациях соли. Поэтому можно предположить, что конъюгированные с ПЭГ частицы ядро/Аи(А)-оболочка будут циркулировать в кровотоке без агрегирования достаточно длительное время. Это открывает возможность использования таких КНЧ в различных биомедицинских приложениях.
Изучение элементов фармакокинетики конъюгата композитных наночастиц SiO/Ag с ПЭГ Применение КНЧ со структурой «ядро/металлическая оболочка» в различных биомедицинских приложениях требует изучения элементов их фармакокинетики в некоторых тканях и органах мышей после их внутривенного введения в виде коллоидного раствора.
Наши исследования преследовали две цели (соответственно были проведены две серии экспериментов). Во-первых, необходимо было получить количественную информацию о динамике перераспределения КНЧ в тканях и органах мышей-опухоленосителей (в частности, - в опухоли) на относительно коротком временном интервале (от 5 мин до 24 ч). Эта информация является принципиально важной для использования КНЧ в терапии опухолей, поскольку с ее помощью можно определить оптимальные дозу КНЧ и интервал между их введением и лазерным облучением пораженного участка (At). Во-вторых, требова 103
лось определить временной интервал, необходимый для полного выведения частиц из организма. (В этом случае исследования проводили на здоровых мышах; период наблюдения составлял 9 месяцев.)
Совместно с сотрудниками ГЕОХИ РАН нами были разработаны и реализованы методы количественного определения Аи и Ag в тканях и органах животных с помощью электротермической атомно-абсорбционной спектроскопии [109].
Результаты количественного анализа тканей и органов мышей-опухоленосителей на содержание Ag представлены на рис. 3.32. Видно, что конъюгированные с молекулами тиолированного ПЭГ композитные наночасти-цы «Si02/Ag-oбoлoчкa» достаточно долго циркулируют в кровотоке мышей, постепенно накапливаясь в опухоли по механизму пассивной адресной доставки [ПО]. Такое селективное накопление НЧ обусловлено повышенной васкуля-ризацией и проницаемостью эндотелия кровеносных сосудов и капилляров опухоли. В результате, в первые 24 ч после инъекции концентрация наночастиц в опухоли существенно возрастает.
На рис. 3.33 представлены результаты количественного анализа тканей и органов здоровых мышей на содержание Ag спустя разное время после введения коллоидного раствора конъюгата Si02/Ag/n3r. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что конъюгированные с молекулами тиолированного ПЭГ композитные наночастицы БЮгА -оболочка за 9 месяцев практически полностью выводятся из организма. Наиболее резко концентрация серебра снижается в печени, убывая в 250 раз уже за 4 месяца.
В то же время, в почках и селезенке концентрация серебра в течение месяца после введения остается практически неизменной. Однако и в этом случае при максимальном времени эксперимента наблюдается существенное (в 17 и 67 раз соответственно) уменьшение содержания Ag по сравнению с зарегистрированным через сутки после введения коллоидного раствора конъюгата.
