Введение к работе
Актуальность исследований. В настоящее время оімечаются тенденции возрастания внимания к качеству цветоводческой продукции, а также мерам по обеспечению ее фипк'аниіарной безопасное!н. особенно при жепорге расітельного материала. В мире доход от продажи декоративных растений составляет около 50 миллиардов долларов, ит них 12 приходится на Западную Европу н 6 - на США и Японию. В Нвропе дилерами являются Нидерланды (50 % мировой продукции цветоводе і ва), а также Линия. Кельтия, Германия, Италия, Htpaii.ii. (I.avvson, 1996). Луковичные культуры приобретают вес большую популярность благодаря не юлько их замечаимьным декоративным свойствам и незаменимостью при создании ландшафти в раннсвесеїіпиГі период, по и тем, что они относятся к категории важнейших ныгоночных
КуЛЬТур, ПОЗВОЛЯЮЩИХИОЛуЧаТЬ ВЫСОКОКаЧССТВеННуЮ ПРОДУКЦИЮ Н.ШМ1>"С
время (Вылов, Зайцева. 1990).
Среди декоративных луковичных растений нарциссы занимают одно in
ведущих мест, уступая лишь тюльпанам по разнообразию окраски цветка.
Увлечение згой культурой началось в XIX
веке, когда в Англии, были получены многочисленные гибриды между трубчатыми п крупнокорончагымн нарциссами. Современные сорта сложные гибриды, многие из них полиплоиды. Коллекция ГНС РАН им. II. В. Цицина насчитывает 265 крупнокорончатых сортов; Кб -' трубчатых; 47 -. мелкокорончатых; 34 - разрезнокорончагых; 2ft - махровых и 26 - из всех прочих групп.
Промышленная основа цветоводства имеет свою специфику, которая подразумевает. широкую интродукцию посадочного материала, его вегетативное размножение и монокулыуру, что способствует интенсивному развитию болезней и расширению их ареала (Бойко, 1990).
. Сдерживающим фактором промышленного цветоводства являются инфекционные болезни, среди которых вирусные занимают наибольший удельный вес (Макутенайте. 1992). Они вызывают потерю декоративных качеств, ухудшение физиологического состояния растений и, в конечном счете, причиняют значительный экономический ущерб. Интенсификация процессов производства усиливает вредоносность вирусных болезней и особенно смешанных вирусных инфекций. Особенностью вирусных болезней растений является гетерогенность вирусных популяций, представленных различными вирусами и их штаммами с разнообразными биологическими свойствами. Отрицательное влияние вирусов на репродуктивную способность растений приводит к фенотяпическому изменению признаков сорта.
, ЦЕНТРАЛЬНАЯ
НАУЧНАЯ ЄИ5ЛИОТЕКА
Моск. . ідамии
снижению \рожая іскор їїиянои цнеіочпоп про ічкннії па 40-70 "о її ни рож ісіініо іюсіїріїпмчинич к пирчс їм сорюн (Мшроф шова \1)Ч2)
і'сІсріІ.1І|ІІЯ IllipVctWi ІШСІО'ІІКІЧ К\ ІЬ|\р К McliipillfkOllMX п і» «>ны\ II
іссіпіч ірсиссні.іч расісіїпяч способе і нчє і ні іжпнанпіо її цпркч іяции ноібч іпіс їси і 1с іоскію шоси сне ісіпш о сосіапс и распрос і ранении нирчеон с южное її. п\ іи.іі шістки оісМсінпс мер борьбы с ними с 1С іа-іи акічалі.пмм течение чои ірчипп паїоісііоіі
Цс її. н і ідачи пес іс юнаиин інісраі\рш і\ іапнмч її про інарпіс псе іе іон шия и ропо шмне п І !>(. РЛ1І спи ісіс іьсівчюг о широком расіїросірамснпп вирчеон рніичнмч іаксоиочіичсскич грчпіі в ко і ІСМНШННІ.ІЧ пасаж ісііняч іскораінніп іч цнсіочні.іч к\ імчр
II скній с ним і і ікжс ііс (осіаючнои інччспііосіі.н) іанпшо вопроса ноінпкасг нсобчо інмосп бо ice ici lii.hoio кіччснпн ннрчеон на put шчнмч ирс Іеі.тиіе іяч \ iruwis І Це іикі наїиич пес іс ншанпп являюсь обоє нов тис мер борі бы с порчеными мбо іспанцями на митні к\ іьічрс U спят с >гпм сіапн шсі. с іе (чіопшс іадачи
-
II іч чин. сісіісін. распрос і ранения и чаракіср сіімпіочіон нпрченмч іабо іспаннії в ко і іскппопнмч насаж існпяч Narcissus І
-
Опре іс пі 11, ми юнон сосіан вирчеон и переносчиков и вьііеінН.
lOMiiiiiipvioiiiiic піни инфекции \\л нарциссах а іаюкс ил раї шчнмч
пре іс йти і с ія\ порч іка { (dales про (сіан існнмч и ко і іскішяч
фон мной оранжереи І митно боїаїшческоіо сала
» Раїрабогаїь мсмсніьі сисіемкі оі юров існня Narcissus І для
V і\ чтения качесіпа іекорливпой цветочной продчмши и
сочрансіїпя ви ціною и сортовою рашообраіия коліскішй
Наочная повним рабоїьі На нарциссах лиаі і юстированы
іісснонсінснпме nofl кч імчрс нпрчсі.і Bean >еІІочч mosaic virus (BYMV)
Polalo virus Y (PVY) Carnation latent virus (Crnl V) tarnation mottle virus
(CrnMV) lobacco necrosis vims (TobNV) Arabis тоьаїс virus (AMV) Tomato
ringspol virus (lomRSV) ЛІІаІГа mosaic 4irus VAI MV) Raspberrv ringspol virus
(RRSV) Tulip breaking virus (TBV) lobacco rattle virus, (TobisV) Всего
выявлено 16 во ібудігге іей принадлежащих к 10 таксономическим группам
(Potv- Potex- ЛІ MV-group ГоЬато- Ncpo- Cutumo- Carmo-, Carta-. Carmo-
ГоЬга- Tobacco nee-osis group)
Иі>чешіе характера распространения BiipvcoB на различных сортах Narcissus L и представите іях фонической и ечбтропической флоры порядка Ltliales выявило наличие смешанных инфекций доминирующими компонентами которых являются Tobacco mosaic virus (TMV) и Cucumis mosaic virus (CMV) Число компонентов комплексной инфекции достигает 6
(сорт I'astelina). Покачано, что частота встречаемости AMV; RRSV; TobNV; lomRSV: BYMV; TobRV составляет 18: 7; II: 5 - 6:,12. и 5.3 % соответственно ятя каждого вируса
В результате проведенных исследовании, покачана возможность передачи на нарциссы CMV двумя нсспсцпфичсскнмм видами глей: Macrosiphum rosae (1..) и My/us ccrasi (I.): BYMV - Aphis labae Scop., a I'VY -A. labae Scop, и My/us omatus l.aing.
Проведена оценка устойчивости растений Narcissus 1.. (12 сортов) к 5 видам глей, регулярно выявляемых и посадках нарцисса. Апалігі устойчивое! и различных сортов не выявил образцов, обладающих абсолютной устойчивостью.
Определены размеры жеиланта. обеспечивающие іффсктишіосіь
оздоровления ог комплекса вирусов при макснмазмюм выходе растении:
составы питательных сред язя получения адвентивных побегов и индукции
ризогенеза. ' -
Впервые в растениях Narcissus L. и некоторых представителях порядка l.iliales диагностирован вирус, серологически родственный Х-вирусу шалота (XBII1: ShXV) и принадлежащий, как мы предполагаем, к іруппе ХВ1ІІ-кодобных вирусов (Впшниченко, Арушанова, Келдыш и др., 1999).
Практическая значимость работы, В результате комплексных
вирусологических исследований на культуре Narcissus 1,. получены данные по
війтовому составу вирусов, характеру их сочетаний в составе комплексной
инфекции, особенностям распространения. Они являются обоснованием язя
раіработки и усовершенствования комплекса профилактических мероприятий
в создании системы противовирусной зашиты коллекционных насаждений
Narcissus L. -,'.*'
На основании экспериментальных. данных с учетом имеющихся сведений разработана методика оздоровления нарциссов от комплекса вирусов, Определен оптимальный размер , жеплапта ятя получения освобожденных от вирусов растений.
Идентифицирован новый ХВШ-подобный вирус на p. Narcissus L. и некоторых представителях порядка l.iliales. .
Апробация работы. Материалы доложены на XYII Международном симпозиуме (23 - 27 June, 1997. Beihesda. USA): на III Международной .конференции «Цветоводство -сегодня и завтра» (Москва, 1998).
Публикации. Основные р«ультаты исследований опубликованы в 8 печатных работах.
Объем и содержание работы. Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста и состоит из введения, 15 глав, выводов и заключения.
-в-
І'абоїа to up/Kin 2o і jfi піп, її і iiocipiiponaiia 9 фоюі рафиями и рисунками Списик imepaivpi.i нк помасі 294 паїїмсіїонаїпш їм коюрых 220 па ііносірімніїх чінках
(О II І'ЛЧІШІ і'\І,ОІМ
І (ІЬЙІІ1 ЛИП І'ЛІУІ'ЬІПО ІГ МІ
І) позоре шісраїчрм іірімчс ким тГыикации пос іе ши\ юг. лаюшие харакісрнсінкл основным внрчсным іабо ісвліиям поражающий рол Narcivab І осооспносіям (їпо юі ип кх імхрьі Иоіроіїію рассмотрены и обсх-ж ієни pauipoctранение и врс юиосноегь впрхеных іабо іевапин, поражающих нірцпссм ими раснросірінсіїня нирхеон мею іьі и\ иселе юнапіш и основные прием и инісірнропаннон прогнвовир\спон (.шипы Особое Hi'iiM.iiiitc \ (с iciio iiciio іьюваїшкі к\ тьгхры апикальных мериекм как о тою їм важнейших мето юв освобождения растений от йирхсмон инфекции
2 УСЛОВИЯ МАП РИАЛЫ ИМ! ГОДЫ ИССЛ1 ДОВАНИИ
Экспериментальная работа проводи ысь на кафедре іаїшпьі растений Российском) Универсніеіа ірузкбьі народов и в огдсіе іашіпьі расгений Г іавногобоїаннчсскоіосала им II І) Цишіна в течение 1995-1999 і г
Основными объемами пес іелований явіятись представ иге'і и порядка Lihalcs семсіїсіва Amarxllidaceae род Narcissus L, также проводили скринниш на зараженность вир>сами среди различных представителей гропнческой и с\ бтропнческон флоры
Д їм выявления и идентификации вирусов испотьзовали общепринятые схемы со сгаптаргным набором индикаторных расгений ( F-ulton,l960, 1967, Murant 1970а Помазков. 1978 Помазков Келдыш 1979, Келдыш, Помазков, 1980 Index оГ , 1983)
Опенка устойчивости форм, сортов и видов к возбудителям, переносчикам и векторный перенос проводили по стандартным методикам (Помало>в, Келды.и, 1979, Втасов и др , 1990)
Испытание чкепериментальных растений посредством переносчиков проводили в боксах при оптимальной температуре 18-23 С (Bnggs, 1959, Келдыш, 1967) Применяли наїрузку от I до 100 особей Обособленные популяции глей-переносчиков в отношении которых проводится оценка на
—Ч-
устойчивость, поддерживали на основном кормовом растении под ізолятором. Наблюдения за характером поведения переносчика проводили в течение 24 часов. Учитывали число особен, оставшихся после подсадки. Если чсрс» сутки на исследуемых «Ьормах не остается ни одной особи, то их относят к иммунным. Растения, на когорыч остается исходное количесгво .тлей или более, считаются восприимчивыми и могут рассматриваться в качестве кормовых растений. Растения, на которых сохранилось меньше исходного числа особсй,относят к заселяемым (Келдыш. Помазков, 1980).
Все .женеримепгальные работы по инфицированию и тестированию растений проводились и контролируемых условиях, исключающих возможность вторичного и перекрестного заражения.
Биологическое тестирование выполнялось по типовым для изучаемых групп вирусов методикам. В набор травянистых растсний-инликаюров для механической передачи входили виды: Nicotiaiia tabacum; N.ruslica; N. glutinosa: Petunia hybrida; Datura stramonium; Cucuinis sativus; Chenopodium amaranticolor; Ch quinoa: Phaseolus vulgaris.
Для приготовления инокулюма использовали 0,02 М фосфатный буфер рН 7,5-8,0 с добавлением различных стабилизирующих соединении: кофеина, ДИЭКА, 2 М1-, никотннсудьфата, активированного угля, аскорбиновой кислоты и iip.(Cadman, 1956; Fulton, I960; 1967; Picrpoint, Harrison, 1963; Lister, 1964; Метьюз. 1973; Гиббс. Харрисон, 1978). В качестве абразива использовали целит или карборунд: непосредственно после инокуляции листья промывали водой, что способствовало увеличению числа образующихся местных поражении, а затем растения помешали в затененные условия на несколько часов для повышения восприимчнвости.( Holmes, 1929; Bawrden, Roberts, 1948). В качестве инфекционного материа-та использовали листья Narcissus I.., травянистых индикаторов с признаками заболеваний. Очистку ; и концентрирование . препаратов выполняли с помощью дифференциального центрифугирования по схемам, которые рассматриваются " в- . ' соответствующих разделах данной работы. ' Инфекционность препаратов контролировали методом биологического \ тестирования на травянистых индикаторах, применяемых для диагностики и идентификации определенных вирусов
Видовой состав тлей в биоценозе декоративных луковичных растений .определяли методом желтых чашек Мериісе (Moericke. 1951).
При диагностике и идентификации вирусов, поражающих Narcissus L., использовались: визуальная . оценка зараженности, серологический тест (двойная иммунодиффузия в агаровом геле по Ouchterlony (1953)),
-і"-
иммунофсрмсншыи аналиі І 1 ISA (Clark Adams 1977 Ьобкова. Чирков, 1ЧХ1 І путова. \чнч Лтабсков I4SS І angveld \ЧЧЬ Beck, Husted 19%) с псгюлыоианисм гесі-сисгсм upon людства Ml У ПИИКХ, НПО «Ьиочар» Дія постановки ссролої ических реакции испотыовлди іаюьс сыворотки н аитиі сны, но ученные ш учреждении Ьодгарнн І о ілшшіїн І ермапин СІНА Кроме гою, примени шсь отечес і венные сыворогкп и лпшиїм ні UllCTinVTd биоорганическои химии им Шемякина. 1С ХЛ НИИКХ
Регистрацию регультагов нммупофериеитного анализа проводили на адсорбшюмстре фирмы «Dynattch» модсть HR-700 «Microplale Reader» Ссролої ическочу aiiaiiiuy методом иммуноблоттиша подвергали растігге іьііис жстракты после низкоскоростпого центрифугирования (10 000 \ g 30 мин ) и очищенные препараты "Экстракты по іучали in свежих или замороженных тистьев исследуемых сортов Листья гомоісшгтнровали на холоде в crvmce в присутствии зкстрагирмошего 02 М калий-фосфатої о буфера. рН 8 5
Иммупоблоттипг проводили в соответствии с протоколом, исполыуемым в качестве стандартною (Пшнничеико и др 1996, Vislmichcnko et al, 1994) В работе иснолыовались ангисыворотки против рекомбипаїггної о капсидною бе іка ЧВШ (As 37) и рротив высокоочшненното препарата интактных вирусныч частиц ХВШ (As I 4)
'Электронно-микроскопические исследования проводили в злектронном микроскоп; ЕМ-301 (Philips) Контрочь осуществлялся как в очищенных препаратах, так и прямым методом (Brandcs |457, Проиенко 1966)
Методы иммуносорбшш и декорирования пеполмовалн в модификациях Вишниченко В К, Стельмащук В Я , Завриева С К (1996)
Пассаж ХВШ-подобного вируса ш Narcissus L (сорт Super Star) проводили на 2-х недельные сеянцы шалота A ascalomcum (cr Creation) методом механической инокуляции при температуре 25С и относцтечьной влажности 70% Тест-растения содержались в контролируемых условиях в течени* 3-4 недель Присутствие в них капсидною белка ХВШ-подобного регистрировали на основании результатов нммуноблотинга с использованием As I 4
Оздоровление растений от вирусных болезней проводили методом
культуры апикальных меристем Поверхностная стерилизация
осуществлялась 0,1 % раствором сулемы или 0 1 % раствором диацида, время зкепозиции 7 минут (Высоцкий, Шершень, 1993) Апексы выделяли при помощи препаровальной ипы и малого глазного скальпеля Техника приготовления питатетьных сред, стерилизация бокса, инструментов, табораторной посуды, растительного материала, методика вычленения н
посадки апексов, а также выращивание растсний-регснсрантов общепринятые (Бугснко, 1964; Калинин, 1980; Трофимен, Остапенко, Бойко, 1985). Основная -питательная среда содержала макро- и микроэлементы по Мураснге-Скугу (Murashige, Scoog, 1962), сахарозу 30 г/л; агар-агар 7 г/л: рН среды 5,6-5,8. Размер экспланта контролировали с помощью окулярмикромстра.
