Содержание к диссертации
Введение
1. Состояние изученности бактериальных болезней винограда 8-22
1,1, Бактериальный рак 8-16
Г;2. Бактериальный некроз 16-20
Г.З. Бактериальные листовые пятнистости 20-22
1.4» диагностика бактериальных заболеваний . 22-25
1,4.1. Микробиологический метод диагнос
тики 22-23
1;4.2. Серологический метод диагностики 23-25
2. Материалы и методы исследований 26-38
2.1. Материалы исследований 26-26
2.2. Методы исследований 26-27
2.2.1. Методы определения интенсивности развития и распространения болезни 27-28
2.2.2. Методы содержания пигментов в пораженном растительном материале 28-28
2.2.3. Методы проведения обследований и выделения возбудителей 28-30
2.2.4 Методы изучения морфологических, культуральных, биохимических и физиологических свойств возбудителей бактериальных болезней винограда 30-34
2.2.5. Методы заражения индикаторных растений 34-36
2.2.6. Методы определения эффективности применения пестицидов 36-36
2.2.7. Методы получения диагностических сывороток и постановки серологических реакций CLASS 3. Изучение бактериальных болезней винограда в молдавии 39-92 CLASS
3.1. Распространение бактериальных заболеваний винограда в республике 39-55
3.2. Идентификация возбудителей бактериальных болезней винограда . 55-92
3.2 1. Выделение возбудителей бактериозов 57-59
3.2.2.1 Подбор питательных сред 59-61
3.2.3. Сравнительное изучение свойств возбудителей бактериальных болезней 61-92
4. Разработка методов борьбы с бактериальными заболеваниями винограда . 92-110
4.1. Методы фитосанитарного отбора растений винограда 92-108
4.1.1.. Фитосанитарный отбор микробиологи ческим методом 93-98
4.1.2. Усовершенствование метода диагностики возбудителя бактериального рака 98-108
4.1.2. Меры борьбы с листовыми пятнистостями винограда І08-ІІ0
5. Выводи
6. Предиожения и рекомендации производству
7. Внедрение в производство
Литература
- Бактериальные листовые пятнистости
- Методы определения интенсивности развития и распространения болезни
- Идентификация возбудителей бактериальных болезней винограда
- Фитосанитарный отбор микробиологи ческим методом
Введение к работе
Виноградарство является традиционной отраслью сельского хозяйства Молдавии. Доходы от виноградарства составляют более 30 % всех доходов колхозов и совхозов республики, а в некоторых хозяйствах достигают 60-70 %.
Молдавия является одним из крупнейших районов производства винограда в стране, на ее долю приходится свыше 20 % площадей виноградных насаждений СССР и около 25 % общесоюзного валового сбора винограда. В перспективе удельный вес республики в производстве этой продукции возрастет до 35-36 %.
Директивами ХХУТ съезда КПСС и ХУ съезда КП Молдавии по пятилетнему плану развития народного хозяйства СССР на 1981-1985 гг. в Молдавской ССР предстоит увеличить среднегодовой объем валовой продукции сельского хозяйства на 20-22 %, обеспечить среднегодовое производство винограда на 1,5-1,6 млн, тонн. За пятилетие намечается посадить более 55 тыс. гектаров промышленных массивов виноградников.
В Продовольственной программе СССР на период до 1990 года намечено довести производство винограда до 7,5-8 млн. тонн в одиннадцатой пятилетке и в двенадцатой пятилетке до 10-11 млн, тонн.
Наряду с расширением площадей, занятых под виноградом, основным направлением в повышении валовых сборов винограда принадлежит интенсификации виноградарства, повышению урожайности существующих и вновь закладываемых плантаций. Одним из существенных резервов дальнейшего повышения урожайности винограда является его защита от вредителей и болезней, среди которых большой вред приносят бактериальные болезни.
При низкой эффективности обработок имеющимися химическими -препаратами, бактериальный рак существенно снижает количество и ухудшает качество урожая винограда, выход саженцев из шкожи и сокращает долговечность виноградных кустов.
Потери урожая от бактериального рака, при средней степени повреждения кустов, составляет 37 % ( Zinka , 1972).
Возбудитель бактериального рака может существовать в растениях латентно (без проявления внешних симптомов), что приводит к распространению болезни посадочным материалом.
В связи с этим единственно правильным направлением в борьбе с бактериальным раком винограда является отбор растений,свободных от возбудителя и дальнейшее их размножение в условиях, предотвращающих повторное заражение. Учитывая вышеуказанные свойства возбудителя бактериального рака, была поставлена задача: разработать методы диагностики заболевания для осуществления фитосанитарного отбора здорового посадочного материала.
С этой целью возникла необходимость проведения следующих экспериментальных исследований:
- разработать методы выделения возбудителя;
- подобрать элективные питательные среды, для культивирования бактерий;
- изучить морфологические признаки Agrobacterium tume-faciens на различных питательных средах;
- определить биохимические свойства агробактерий;
- подобрать индикаторные растения и разработать методы их заражения для изучения вирулентных свойств патогена.
В целях ускорения и уточнения диагностики рассматривалась возможность применения серологического метода; для чего было необходимо:
- изучить физиологические свойства возбудителя для выявле
ния штаммовых различий;
- разработать схему иммунизации кроликов для получения высокоспецифичных диагностических сывороток.
В основу этих исследований была положена научная предпосылка о возможности установления возбудителя заболевания методом капельной агглютинации на предметном стекле между диагностической сывороткой и пасокой проверяемого растения.
Внедрение в производство милдьюустойчивых сортов винограда и сокращение в связи с этим количества обработок медьсодержащими препаратами, а также применение заменителей бордоской жидкости стали причиной развития заболеваний типа некротических пятнистостей листьев и увядания побегов винограда, которые при сильном развитии вызывают опадение листьев уже в середине лета и представляются весьма вредоносными.
При изучении этиологии возбудителей заболеваний листьев и побегов винограда ставились на разрешение следующие задачи:
- изучить распространение и вредоносность заболеваний типа некротических пятнистостей листьев и увядания побегов винограда;
- провести идентификацию возбудителей заболеваний на основании изучения морфологических, биохимических и патогенных свойств;
- разработать методы борьбы с бактериальными болезнями винограда.
Научная новизна результатов исследований:
- впервые в СССР описаны симптомы и изучена этиология возбудителей бактериальных заболеваний винограда: листовых пятнистостей и бактериального некроза;
- установлено широкое распространение на виноградниках
республики: бактериального рака до 58 %, листовых пятнистостей до 37,6 %;
- на основании изучения морфологических, биохимических и патогенных признаков возбудителей бактериального рака и бактериального некроза разработан микробиологический метод диагностики заболеваний винограда;
- усовершенствован метод диагностики бактериального рака на основании применения диагностических сывороток;
- проведено испытание бордоской жидкости в борьбе с листовыми пятнистостями.
Практическая ценность:
Применение в практике фитосанитарного отбора позволило получить 199 безбактериальных маточных кустов 22 европейских сортов и 77 кустов 4 подвоев• В совхозе "Валены" НПО "Виерул" этим материалом посажен маточник безбактериальных клонов винограда на площади 1,5 га.
Материалы исследований вошли в Методические указания по диагностике бактериального рака винограда,изданные ВАСХНИЛ в 1981 году.
Работа выполнена в течение 1977-1982 годов в отделе защиты растений Молдавского ордена Трудового Красного Знамени НИИ виноградарства и виноделия НПО "Виерул".
Бактериальные листовые пятнистости
При четких проявлениях симптомов заболевания, определение его проводится по внешним признакам. Однако при наличии латентной инфекции возникает необходимость в проведении более детальных исследований, основанных на выделении возбудителя и установлении его видовой принадлежности. Это необходимо также и при появлении сходных симптомов, вызванных различными возбудителями (пятнистости и антракноз). методов выделения бактерий из растительных тканей (Методы фитопатологии, 1974): выделение возбудителя из листьев (с симптомами листовых пятнистостей) путем их растирания и посева кашицы на питательную среду; при поражении стебля и проводящих сосудов пораженные части растения режут на части, расщепляют в длину и сосудистые пучки мацерируют в капле стерильной воды. Суспензию мацерированной ткани сеют штрихами на питательную среду. Выделение патогена из опухолевой ткани осуществляют путем растирания свежих опухолей до кашицы, которую петлей наносят в чашки Петри на поверхность твердой питательной среды (Соловей Е.Ф., 1973; Нагапетян Ж.А., 1974).
Серологический метод благодаря высокой чувствительности и специфичности может быть использован для идентификации бактерий. В серологических исследованиях с целью диагностики фитопатоген-ных бактерий используются главным образом реакции агглютинации и преципитации в геле.
Первое сообщение об использовании серологии для определения фитопатогенных бактерий сделал в 1918 году Иенсен ( Yensen, 1918). Применяя реакцию агглютинации,автор установил, что штаммы A.tumefaciens , выделенные в Дании и США оказались серологически разнородными ( Schaad , 1979). В нашей стране реакция агглютинации была применена для диагностики возбудителя бактериального рака плодовых (Израильский В Л., 1928а), позднее для идентификации бактериозов абрикоса (Мирзабекян P.O., Карапетян АД., 1946), плодовых деревьев (Шкляр С Л., Израильский В.П., 1968), картофеля (Боярский Б.Г., 1966), сои (Матвеева EJJ., Острогская HJUf 1968).
Разработанный Оухтерлони метод двойной диффузии в агаре позволил широко проводить опыты по преципитации в медицинской микробиологии, но не для идентификации фитопатогенных бактерий ( Oyxterionj , 1948), Впервые метод Оухтерлони был использован в 1965 году для определения псевдомонад. На основании этих опытов обнаружены специфичные антигены Pseudomonas tabaci (Lavxin-kovitz, Element , 1965). С помощью двойной диффузии в агаре штаммы A.tumefaoiens были сгруппированы в две серологические группы ( Schaad , 1979), которые соответствовали двум биотипам ( Keane et al» , 1870).
Весьма перспективным оказался серологический метод для определения бактериальной этиологии заболевания без выделения возбудителя в чистую культуру. Метод, основанный на взаимодействии экстрактов из пораженных растений с иммунной сывороткой, был использован для изучения бактериальной зараженности семян хлопчатника, пшеницы, фасоли на контрольно-семеноводческих станциях (Гвоздяк Р.И., 1981).
Для определения возбудителей кольцевой гнили картофеля М.С, Луниным (Лунин М.С., 1961) был предложен капельный метод, разработанный Беленьким Д.Э. и Поповой Н.Н. для диагностики черного бактериоза пшеницы. Этим же методом проводилась идентификация возбудителей бактериозов картофеля (Боярский БД1, и др., 1966), а также для диагностикиPs. solanacearum (Fucikov-sky , 1979).
Ввиду того, что многие фитопатогенные бактерии являются серологически разнородными, для их диагностики необходимо применять поливалентные сыворотки, которые используются для определения флуоресцирующих бактерий, вызывающих болезни плодовых культур (Шкляр С.Н., Израильский В Л., 1968), для обнаружения -некоторых видов псевдомонад - возбудителей базального бактериоза пшеницы, бактериозов сорго и суданской травы, заболеваний люпина, табака, плодовых (Пастушенко Л.Г., Симонович И«Д.,1979).
По данным некоторых авторов ( Graham , 1963; Ягудин В.Д., 1968) A.tumefaciens представляет в серологическом отношении гетерогенный вид. Представители этого вида могут отличаться не только количеством антигенов, но и их качеством, чем объясняется существование различных серологических групп этих бактерий. Несмотря на резко выраженную антигенную специфичность штаммов, возбудителя, М.Х. Камилова (Камилова М.Х., I960) высказала мысль о возможности применения серологического метода диагностики бактериального рака с использованием поливалентных сывороток.
Методы определения интенсивности развития и распространения болезни
Содержание пигментов хлорофилла "а", хлорофилла ибп и каротиноидов в листьях, пораженных пятнистостями рассчитывали в I г сырого и абсолютно сухого вещества, а также на I дм2 площади листовой пластинки. Концентрацию пигментов определяли в ацетоновой вытяжке спектрофотометрированием на СФД-2 при длинах волн: хлорофилла - 662, сумму каротиноидов - 440,5. Содержание их рассчитывали по формулам ДЛЗеттштейна (Починок Х.И., 1976).
Обычное измерение концентрации пигментов в ацетоновой вытяжке проводилось в трехкратной повторности.
Выявление бессимптомных (отсутствие опухолей на надземных частях растений) кустов винограда проводили путем покустных обследований виноградников с составлением схемы участка, где отмечали наличие или отсутствие опухолей на кустах. Время обследований - конец сентября, начало октября, когда наблюдается максимальное развитие опухолей и они хорошо видны на фоне штамбов и рукавов.
Выделение агробактерий в период весеннего сокодвижения проводили методом отбора пасоки по Маленину (1974). Пасоку собирали от побегов внешне бессимптомных кустов винограда, соблюдая все правила асептики. Пасоку наносили в чашки Петри с застывшей средой, затем капли ее шпателем Дригальского равномерно распределяли по поверхности среды.
В ранне-весенний, летний и поздне-осенний периоды использовали одревесневшие одно- и двухлетние побеги, из которых проводили выделение A.tumefaciens методом Лехоцки ( Lehoczky , 1971); заготовленную лозу дезинфицировали, мелко нарезали на диски и помещали в стерильные бюксы со стерильной водой. Бюксы выдеркивали в холодильнике при температуре +4С в течение суток. Бактерии, экстрагированные из лозы в воду, высевали на питательные среды таким же образом как и пасоку.
Образцы ризосферной почвы отбирали из-под внешне здоровых кустов, а анализы проводили методом Г.И. Ежова (1974); 10 г почвы из образцов помещали в колбу со стерильной водой, объемом 200 мл? содержимое колбы взбалтывали 45 мин. и после минутного отстаивания делали серию разведений. Посев суспензии производили на среду Лиске, с добавлением спиртового раствора генциан-виолета в концентрации 1:100000.
Выделение патогена из опухолей осуществляли путем растирания их до кашицы, которую затем петлей наносили на поверхность питательной среды (Маленин И., 1971; Соловей Е.Ф., 1973; Нага-петян Ж.А., 1974).
Для выделения A.tumefaciens использовали элективные питательные среды: Лиске ( Lieske , 1928): глицерин - 2 %, ЮГО,-0,5 %% KHgPO - ОД #;MgS04 - 0,1 %% Кларка ( Clark , 1969): лактоза - 0,05 %, KNO, - 0,01 %, MgS04 »4Н20- 0,001 %, NagHPO - 0,0018 %, агар - 0,1 %. После автоклавирования при 1,5 атм., в течение 30 минут в охлажденную до 45-50С среду асептически добавляли по I мл растворов FeEDTA (0,25 %) и MnSO 4Н20 (33,5 %), предварительно простерилизованные через бактериальный фильтр.
Покустные обследования в июне-августе проводили на селекционных участках,которые не обрабатывались бордоской жидкостью, где отбирали листья с симптомами хлоротической, либо некротической пятнистости, крапчатости, выпадения или растрескивания тканей.
Материал с симптомами увядания побегов отбирали с больных кустов в очагах проявления болезни. Симптомы описывали, образец нумеровали и проводили выделение возбудителя методом растирания растительной ткани (Методические указания..., 1974). Инокулюм наносили петлей в виде штрихов на поверхность картофельной среды и на питательную среду Кадо ( Kado, Heskett, 1970), элективную для псевдомонад: глицерин - I %, сахароза - I %, гидро-лизат казеина - 0,1 %, NH Ci - 0,5 %, Na2HP0 - 0,2 %, до-децилсульфат натрия - 0,06 %, агар - 0,15 %.
Для выделения возбудителя из увядающих побегов винограда использовали питательные среды, элективные для ксантомонад: дрожжевой экстракт Difco - I %, галактоза - 2 %% ОаОО, - 2 %, агар - 2 % ( Schattost , 1966); среда Кадо ( Kado, Heskett , 1970): целлобиоза - I %, К2НР04 - 0,3 %, NaB. 0 - 0,1 %, NH401 - 0,1 %, MgS04 7 Н20 - 0,03 %9 агар - 1,5 %.
Идентификация возбудителей бактериальных болезней винограда
В связи с существующими данными ( Lehoczky , 1968; Zinka, 1968; Маленин, 1975; Леманова Н.Б., Бербер П.Ф., 1976; Штерен-берг П.М. и др., 1979) о системном характере бактериального рака и о возможности длительного существования бактерий в сосудах зараженного растения в латентном состоянии без внешнего проявления опухоли, необходимо было разработать метод идентификации A. tumefaciens во внешне здоровых кустах, предназначенных для размножения.
Для выяснения причин появления некротических пятнистостей листьев и увядания побегов необходимо было предпринять выделение возбудителей и их идентификацию, которую проводили по совокупности следующих признаков: - морфология колоний; - 56 - культуральные и биохимические свойства; - гатогенность на индикаторных растениях.
Бактериальный рак. Выделение возбудителя из внешне бессимптомных кустов винограда осуществляли в ранне-весенний период из пасоки, в летний, поздне-осенний и зимний периоды из побегов, корней и почвы.
В результате проведенных нами исследований выяснено, что в поздне-осенний период возбудитель находится в лозе в низкой концентрации и при посеве на питательные среды не всегда происходит выделение бактерий. В этом случае необходимо повторное выделение возбудителя весной из пасоки, при этом часто обнаруживается обильный рост патогена. Как видно из таблицы 3.2.1.6., при выделении A. tumefaciens осенью от 21 внешне здорового растения винограда, не было выявлено больных кустов, тогда как при повторном тестировании этих же кустов пасокой, обнаружено 18 больных растений. Это объясняется тем, что осенью происходит отток питательных веществ к корням растений вместе с патогеном, который находится в сосудистой системе винограда.
Другим недостатком этого метода является то, что бактерия лишь экстрагируется в воду, но не размножается в ней и при посеве на питательную среду не удается выделить возбудителя, в том случае, когда он находится в проверяемом растении в низкой концентрации. Наши результаты подтверждаются данными Л.Н. Блон-ской и ЛЗ. Количевой (1980),которые предлагают модификацию этого метода, используя для экстрагирования не дистиллированную воду, а накопительную питательную среду. Полученные результаты говорят о том, что метод Леходки можно применять для выделения агробактерий, но используя при этом побеги от начавших вегети ровать растений.
В исследованиях по диагностике агробактерий ранней весной в пасоке, нами использовался метод Маленина (1974). При изучении возможности применения этего метода было выяснено, что при низкой концентрации бактерий в пасоке, после заражения ею индикаторных растений, образования на них опухолей часто не происходит. Поэтому, для выделения возбудителя бактериального рака, мы используя метод Маленина, проводили посев пасоки на питательную среду Кларка, отбирали колонии, близкие по морфологии с агробактерией (Краткий определитель Берги, 1980) и их патогенные свойства определяли на индикаторных растениях.
Выделение A.tumefaoiens проводили также из опухолей, корней винограда и почвы. Используя вышеописанные методы выделения возбудителя бактериального рака нами было получено 748 изолятов бактерий (табл. 3.2.1.7.).
Выделение бактерий из листовых пятнистостей проводили методом растирания растительного материала. Из поврежденных листьев винограда было выделено 120 изолятов бактерий.
Изоляцию возбудителя, вызывающего увядание побегов винограда, осуществляли следующим образом: с поврежденных побегов стерильным скальпелем удаляли кору и нарезали небольшие участки ткани на границе между здоровой и больной. Их помещали в бюксы со стерильной водой на несколько часов, что позволяло бактерии дифундировать из ткани. Из поврежденных листьев выделение патогена проводили методом растирания, описанным выше. Б результате было выделено 50 изолятов бактерий.
Фитосанитарный отбор микробиологи ческим методом
Проведенные нами исследования показали наличие агробакте-рий в тканях внешне здоровых виноградных растений; свойства выделенных из них изолятов сходны с изолированными из опухолей штаммами-эталонами. Подтвержденный еще раз факт системного заражения представляет большую угрозу современному и будущему виноградарству, поскольку при вегетативном размножении растений, содержащих бактерию в латентном состоянии, происходит размножение больных растений, предназначенных для посадки новых виноградников.
Изучение круга растений-хозяев патогенных и биохимических свойств возбудителя бактериального рака выявило последовательность осуществления микробиологических анализов, позволяющих в короткий срок (одного вегетационного периода) установить наличие или отсутствие патогенных бактерий в растении.
Для фитосанитарного отбора здорового посадочного материала были использованы селекционные клоны европейских и подвойных сортов, новые комплексноустойчивые формы и сорта винограда селекции Молд.НИИ виноградарства и виноделия, а также перспективные для Молдавии сорта винограда из других республик. Схема микробиологической диагностики включала следующие этапы: - визуальный отбор внешне здоровых кустов винограда; - выделение из них бактерий на питательную среду; - биохимический тест на 3-кетолактозу; - заражение индикаторных растений.
Для выявления латентной инфекции бактериального рака, а также бактериального некроза винограда, материал для анализа отбирали весной, с последующим выделением возбудителя из побегов, либо из пасоки в чистую культуру.
Черенки заготавливали от разных побегов одного куста. Выделение бактерий производили из всех черенков, нарезая их дисками и помещая в боксы со стерильной водой при соблюдении всех правил асептики, Бюксы помещали в холодильник на сутки. Пасоку проверяемого куста собирали в стерильные пробирки, которые навешивали на побеги виноградного растения, предварительно обработанные. 0,5 % раствором формалина и промытые стерильной водопроводной водой. Обновляли срез побега, от которого собирали пасоку. Режущие части секатора также обрабатывали формалином. Пробирки привязывали к побегу в вертикальном положении или под небольшим углом и оставляли на кустах в течение 1-2 суток, в зависимости от интенсивности сокодвижения, после чего их снимали, срезая участок побега над пробиркой. Б лаборатории побег удаляли, а пробирку закрывали стерильной пробкой и хранили в холодильнике при +4С.
Посев пасоки или экстракта тканей проводили на элективную среду Кларка в чашки Петри для выделения A.tumef aciens и одновременно на среду Кадо - для x»ampelinae . На поверхность среды наносили 1-2 капли пасоки или экстракта, которые распределяли по поверхности чашки тонким слоем шпателем Дригальского. Чашки помещали в термостат при температуре 28С и выдерживали там 6-7 дней. Выросшие колонии описывали и отвивали на косяки с картофельным агаром и одновременно на среду Бернарса и Де Лея для определения образования 3-кетолактозы.
Кусты, откуда выделены 3-кетолактозоположительные бактерии, принадлежащие к роду Agrobacterium , выбраковывали как непригодные для размножения.
Однако среди представителей этого рода, как показали наши исследования, встречаются 3-кетолактозоотрицательные штаммы, которые требуют дальнейшей проверки и установления их видовой принадлежности. Последняя определяется по опухолеобразугощей способности изучаемых изолятов на растешях-индикаторах, в качестве которых были использованы: - диски моркови; - побеги вегетирующих растений томатов, каланхое; - проростки гороха. Инокулюм 2 - 3-суточной суспензии бактерий в концентрации I млрд/мл вносили в места искусственно нанесенных ранений, которые изолировали пленкой для сохранения влажности. Индикаторные растения помещали в температурные условия, оптимальные для опухолеобразования - 28С.
При отсутствии опухолеобразования на всех индикаторных растениях изучаемый изодят считался непатогенным, а растение, из которого выделена бактерия - свободным от возбудителя бактериального рака. Б случае образования опухоли хотя бы на одном из индикаторных растений, бактерия идентифицировалась как A.tume-faciens , а растение, откуда она была выделена, выбраковывалось как непригодное для размножения. Те растения, из которых выделялись желтые колонии, сходные по морфологии с X.ampelinae, также выбраковывались. Отобранные здоровые кусты винограда являлись маточными и служили суперэлитным материалом, предназначенным для размножения и закладки маточников привойных и ПОДБОЙНЫХ лоз. Их размножение осуществляли 2-глазковыми черенками, укорененными в стерильной почве. Бегетирующие растения с комом стерильной почвы высаживали на постоянное место в маточник.
