Содержание к диссертации
Введение
1. Предпосылки использования эитомопатогенов и микробов-антагонистов в защите растений
2. Объекты ж методы исследований
3. Биологический потенциал звтошшатогенньк грибов для контроля числениостм вредных насекомых и клещей в теплицах
Факторы вирулентности энтомопатогенных грибов
- Предпосылки использования эитомопатогенов и микробов-антагонистов в защите растений
- Объекты ж методы исследований
- Биологический потенциал звтошшатогенньк грибов для контроля числениостм вредных насекомых и клещей в теплицах
- Факторы вирулентности энтомопатогенных грибов
Предпосылки использования эитомопатогенов и микробов-антагонистов в защите растений
По опубликованным данным (Евлахова, 1974; Кандыбин, 1989; Рудаков, 1981; Тулемисова, 1990; Bochow, 1992; Воронин, 1998; Lipa, Smits, 1998) к настоящему времени известно более 8 тысяч видов микроорганизмов, играющих роль в биоценотической регуляции, часть из которых составляет основу микробиологической защдаы растений и хорошо вписываются в фитосанитарную оптимизацию агроэкосистем (рис.1) (Павлюшин, 1997). К 80-м годам сложшшсь основные научные направления микробиологической защиты расте РОСЄЛЙСКАЯ против вредных насекомых, - использование биопрепаратов клещей и грызунов; - подавление возбудителей болезней растений антибиотиками, биопрепаратами на основе микробов-антагонистов, бактериофагов и гиперпаразитов, вирусной вакцинацией и микробными препаратами-инду юрами задетых реакций растений; - учет и прогаоз природных массовых заболеваний (эпизоотии) насекомых в целях регламентации истребительных мероприятий (Павлюшкн, Долженко, 1982; Исси и др., 1980); - использование генов инсектицидности при создании трансгенных растений и ассоциативных ризосферных микробных культур. Факторы стабилизации биотических ре гуляторных ме хани ов:" массовоТазводи мыхэнтомофагов Использование биопрепаратов Активизация иеї в эпизоотии Индукция защи Е
Схема фитосанитарной ошгимшации ахроэкосистем На важнейшую роль естественных популяций энтомопатоген-ных микроорганизмов, энтомофагов и микробов-антагонистов в фи-тосанитарной оптимизации агробиоценозов и агроэкосистем указывают современные фитосанитарные процессы, гфоисходящие на фоне резкого спада объема защитных мероприятий на сельскохозяйственных угодьях России. Так, по данным ВИЗР и ВНИИБЗР (Воронин, 1997; Соколов, Павлюшин, 1997), начиная с 1993 года довольно отчетливо прослеживается локальное восстановление систем биоце-нотической саморегуляции. На посевах кукурузы в Краснодарсксм крае (1994 г.) выявлена высотая активность природных видов трихограмм и хищных краснотелковых клещей в отношении кукурузного мотылька. Зарегистрирована высокая (до 89%) зараженность яиц вредной черепашки теленоминами. Массовое размножение итальянского пруса в Волгоградской области (1993-1994 гг.) было полностью приостановлено возникшей эпизоотией энтомофтороза (возбудитель гриб Е.дгуШ). Обследование садов Псковской области показало наличие значительного естественного фона энтомопатоген-ных нематод, существенно контролирующих численность почвенных стадий развития вредных насекомых (яблонный цветоед, плодожорки и др.). Энтомофторовые грибы (табл. 1) в условиях Северо-западного региона РФ в отдельные годы поражают гороховую тлю, капустную белянку, капустную моль до 70-80% (Воронина, 1985, 1989). Лабораторией микробиометода ВИЗР разработана полная прогностическая корреляционно-регрессионная модель энтомоа то-роза гороховой тли, которая позволяет прогнозировать численность вредителя.
Следует подчеркнуть, что из 800 выявленных энтомопатогеных видов грибов, характеризующихся различным уровнем паразитизма (Boberts, 1981) используется в борьбе с вредными насекомыми и клещами всего лишь 12 видов, преимущественно из порядков Mortiliales и Entomophtorales, а на уровне биопрепаратов было зарегистрировано 15 (Твердюков и др., 1993; Lipa, Smits, 1998). Примерно такой же небольшой Ъовень промышленного освоения и других групп энтомопатогеноа, Так, зарегистрировано 16 бактериальных препаратов, 20 вирусной природы и 22 на основе энтомопатогенных нематод. Из нескольких тысяч видов микробов-антагонистов, препаративные формы созданы на основе rрибов Trchoderma lignorum. T.harzianum, diocladium roseum, СопіоШгіит minitans; бактерий Bacillus subtuis и представителей рода Pseudomcmas. Расширение промышленного освоения и производственного использования МСЗР сдерживается рядом причин. Прежде всего сказывается отсутствие опытно-промьшхленных цехов по наработке опытных партий новых биопрепаратов для широкой производственной апробации и отработки отггно-промьшшентк регламентов получениГИз-за отсутствия оптимальных препаративных форм не решены некоторые вопросы экологии и технологии применения биопрепаратов по культурам.
Эффективность природных популяций энтомопатогенов в снижении численности вредных насекомых на сельскохозяйственных культурах (ВИЗР, ла-боратория микробиологической защиты растений) 70-99 90 ле: ГТК P/(E(t - tnopor). где Р - среднегодовое количество осадков, E(t-Wor.) - сумма эффективных температур за год. Существует ряд проблем научного плана .Центральным вопросом остается изучение хозяино-паразитных взаимоотношений в системах "Энтомопатогены-насекомые" на популяционном, организмек-ном и молекулярном уровнях. Это необходимо для ясного понимания механизмов патогенеза, выявления факторов вирулентности как основы направленной селекции активных штаммов-продуцентов и анализа экологических особенностей применения биопрепаратов. Именно на таких сведениях должна базироваться генетико-селекционная работа по созданию стабильных штаммов-продуцентов. В этой связи продвинуты исследования в отношении, таких видов энтомопатогенных грибов, как Beauveria basskma (Палюшин, Ев-лахова 1978; Павлюшин 1983; Grula et al 1982) Metarrhizium anisapUm (Zacharuk 1970) Entammktara thmtjirm (Воронина 1989) и Vertitillium tecarm (Hall 1981 1982; Павлюшин Аванесов 1985 Особое значение в ограничении численности быстроразмно-жающихся видов насекомых каковыми являются тли белокрылки трипсьГприобретают токсин,ные метаболиты энтомопатогеноТи ак ТИНГт/nXTTPTOR ттпскппыго их биологическая аКТШШПГТТ- в МРНМТТРЙ степени зависит от Яловий шшюклимата а достижение легальною эффекта возможш Гболееко к сро! легальною
Важнейшей предпосылкой рационального использования полезных микроорганизмов в закрьтэм грунте является разработка системы защитных мероприятий, когда против основных экологически значимых вредоносных видов будет в наличии блок биопрепаратов или же разработан режим интеграции МСЗР с энтомофагами и другими средствами контроля. Это обстоятельство указывает на целесообразность привлечения другах групп энтомопатогенов, например нематод а также активно использовать виды микробов-антагонистов и более углубленно изучать действие МСЗР на популяции энтомофагов.
В связи с вышеизложенным, начиная с 1975 г., нами были начаты исследования патогенности энтомопатогенных грибов из сем.Мопйшсеае в отношении насекомых, в основном вредящих овощным культурам в теплицах; были развернуты работы по селекции высоковирулентных штаммов-продуцентов и созданию биопрепаратов двух типов - на основе конидий и энтомоцмдных токсинов. Кроме грибов в исследования были включены энтомопатогенные нематоды и микробы-антагонисты с целью создания блока микробиологической защиты овощных КУЛЬТУТЭ в теплицах Одновременно изучалась воз-можшсть комплексною использования МСЗР и энтомшкарифаюв для оегтаяшш численности вредных видов посредством создания шкус твенногопаразитоценоза
Объекты ж методы исследований
Основные работы проводились на основе коллекций микроорганизмов ВИЗР, ВШ1ТИАФ (впоследствии ГНЙТИАФ), лаборатории радиационной генетики ЛИЯФ (ПИЯФ), ВНИИ биотехнологии (Москва).
Подробно исследовалось 44 штамма энтомопатогенных грибов Beauvma bassiana (Bals.)VuilL, Verticillium kcanii Zimmerman и PaecOcmyces fumoso rosms (Wize)Brown et Smith. Из нематод, паразитирующих на насекомых, использовались 6 штаммов (популяций) видов Steinerwma carpocapsae, Stfeltia (Nematoda: Steinernemati-dm), содержащиеся в толлекции ВИЗР.
Скриниг актиномицетов pStreptmnyces по признаку инсекти-цидности проводился на 1289 штаммах; детальному изучению подвергалось 5 штаммов: Streptomyces mrantiazus ВИЗР-IQ, Str.crmmis 0729; Str.dnerwruber 11-55, Str.Mden$is ЇІ-56; Str.herbaricdkxr S-100.
В качестве модельных тест-насекомых, традиционно используемых в исследованиях по патологии насекомых с целью сравнительного анализа получаемых данных, мы применяли лабораторные популяции большой вощинной моли (Шкгш. melkmeUa L. и гороховой тли Acyrthosipium pirnrn Kalt).
Из хозяйственно важных вредоносных объектов овощных культур закрытого фунта в работе были северо-западные популяции 7 видов вредных насекомых и клещей: бахчевой (Aphis gossypii Glov.), картофельной (Macrosiphtum mferbiae Thorn.) и персиковой (Myzodes persfcae Suz.) тлей, оранжерейной белокрылки (TrkHmrodes vaporariomm Westm.), табачнога трипса (Thrips tabaci Lind), цветочного трщіса (FrmiklinMla ocddeatalis Perg.) и обыкновенного паутинного клеща (Tetranichus urticae Koch.). Разведение тест-насекомых осуществлялось согласно известным методикам (Бондаренко, Деякин, 1975; Бондаренко, 1980, 1984; Бегляров, 1978; Бегляров и др., 1977, 1978, 1982; Воронина, Чумакова, 1984; Ермолаев, 1984; Шува-хина, 1984; Красавина, 1989). Состав энтомоакарифагов, в основном для закрытого грунта, включал популяции, отселектарованные и разводимые лабораторией биологической защиты растений ВИЗР: галлица афидимиза - Aphidotetes арЬШтуга Rond. (Diptera, Cecidamyiidae); энкарзия формоза Encarsia farmma Gahan (Hymermptera, Aphelintdae); златоглазка обыкновенная - Chrysopu cornea Steph., златоглазка китайская - Chrysopa sinica Tjeder. (Neuroptera, Chrysopidae); циклонеда лимбифер (Cycbneda limbifer (Cokoptera, СоссішїШае): фитосейуліос перснмшгае - Phytomulus persirnmstAca PhytoJidm}.
В целях выявления факторов вирулеттности и установления механизма патогенеза применяли методы, принятые в патологии членистоногих, а также использовали приемы физиолого-биохими-ческого анализа микроорганизмов. Определение уровня вирулентности энтомопатогенов осуществляли на разных стадиях развития тест-насекомых по биопробе при перкутанном заражении, используя показатели ЛКдо, ЖТ и др. (Paviyushin, 1978; Айзава, 1976). В качестве инокулюма применялись споровые водные суспензии с тиграми от 106 до 4х10s спор/мл и со следовыми добавками детергентов. Оценку токсигенности штаммов грибов производили по показателям паралича и смертности личиночных стадий насекомых пси инъек-ции культуральной жидкости в полость тела (West, Brgs, 1968; Пашіюіпин 1976) Крометого у гриба Vlecami и некоторых стреп-томицетов вдентифищровал сь энгомоцидньш метаяиты (to-на Митина Павл 1990). Предполагая роль гидролитическш ферментов при ЩЮНШЙОВЄНЇШ горбов через кутикЗ насекомых-хозяев определялГлипазную , х инолит ес Ги протеолитиче-скую активность штаммов методами количественного и галз оличе-ственного анализа при культивировании грибов на индикаторных питательных средах по зонам просветления вокруг растущих колоний (Ерохина и др., 1976; Scerman, 1967; Рубан, 1977; Швлюшин, 1977) Для доказательства роли ферментативной активности в теле насекомого-хозяина была сформована коллекция биохимических мутантов (аукеотрофы, морфологические мутанты и мутанты с измененной протеолишческойЛ хитинолитической активностью). Индуцированный мутагенез v Bbassiana и Vtecanii осуществлялся с помЗцью УФ-с&ения (Павлюшин Левитан 1977; лщмїїкмй Павлкшин ШяГзахаров 1978; Левитин Кирсанова Юрченко 1971; Усенш, Кир санова,Левитин, 1973). Изучение эффективности клеточной защиты в полости тела инфицированных насекомых осуществляли с помощью модифициро-ванных гематологических методик (Логинов, Павлюшин, 1990; 1998).
Суммарную оценку патогенного воздействия микробиологических средств защиты на популяции вредных насекомых оценивали по первичному летальному эффекту и последействию. Были разработаны оригинальные методы определения последействия на системах "мускардинные грибы - бахчевая тля" и "мускардинные грибы -златоглазки" в ряду генераций при размножении выживших насекомых, по показателям плодовитости, прожорливости, вылету имаго и появлению уродливых форм (Павлюшин, 1983, 1984; Палюшин, Красавина, 1984, 1986; Paviyushin, 1996).
Для решения вопросов по ограничению вредоносности возбудителей болезней овощных культур (Fusarium oxysporum, F.cuhrwmm, CUwtbacter michigmensis subsp. miehiganensis, Erwinia carotovara sbsp. carotovara, Pseudommas con-ugata) использовались высокоактивные штаммы микробов-антагонистов ВшМш шЬШз-ІО-ВИЗР, B.mbtMis М-22-ВИЗР, Streptomyces felleus-8-ВИЗР. Биологическую активность микробов-антагонистов оценивали методами блоков, лунок, бумажных дисков и серийных разведений (Егоров, 1986; Нови-шва, Литвиненмо, Калько, 1995). В качестве тест-ку тур использо-вали набор штаммов фузариевых грибов и других выше указанных возбудителей, полученньтх из ВГОШФ и лаборатории микологии и фитогГтологии ВИЗР. Антагонистическую и фігорегуляторную активность опытных образцов новых биопрепаратов (алирш-Б, али-рин-С, гамаир) оценивали в условиях лаборатории на проростках огурца искусственно зараженных Foxusoorum {Быкова1992) в BeSkoSS oSSL иПслЇЇиУ г Бадственн теплиц Се-Sp sSa ОзТ Ш , S a TS
Наработка опытных партий и образцов новых биопрепаратов осуществлялась в ВИЗР на основе научно-технической документации (регламенты получения, ТУ, паспорта) и оригинальных отселек-рванных шташшв-продуцентов. Кроме того, часть образцов грибные биопрепаратов боверина и вертициллина нарабатывались на Калининской СТАЗР, Краснодарской биофабрике и опытной технологической линии ВНИИФ. Биопрепарат на основе энтомопатоген-ных нематод "немабакт" производили на опытной технологической линии ВИЗР. Актиномицетный метаболитный препарат "алейцид" получали на Вьшшеволоцком заводе медпрепаратов. Опытная нара-ботаГновых биопрепаратов на основе мХюбЬв-антаюнистов (али-рин-Б алирин-С гамаир) осущестшшла нГ Щелковском биокомбинате (Ековекая обл) Колпинском экспериментальном биотех-нологическом предприятии (С-Петфбург) и Краснодарской биофаб Испытания штаммов-продуцентов, лабораторных образцов и опытных партий новых биопрепаратов в условиях пленочных и зимних теплиц осуществлялись на Северо-Западе РФ (АОЗТ "ЛЕТО", АОЗТ "Детскосельский, АОЗТ "Колпинский Ленинградской обл.), Краснодарском крае (теплицы Лазаревской ОС ВИЗР, совхозы "Победа", "Черноморец" и Приморском крае (Владивосток, совхоз "Тепличные). Кромітого, лабор орные образцы препаратов на основе штаммов П-55, П-56, шшрин-С, алирин-Б и дрі тестироваал! на скрининговых системах фирмы Байер в Германии (IHraaJ, 1993).
Данные, получаемые в ходе исследований, статистически обрабатывались, при этом в зависимости от характера распределения величин использовались параметрические (критерий Стыодента) и непараметрические (критерий Вилкинсона-Манна-Уитш) критерии различЕй. Применялидисперсионный и корреляционньш анализ. Так, планирование экспериментов по огшш щюГсоставов пита-тельных сред проводили на основе симплексного метода (Грачев, 1979). Математико-статистический анализ взаимного влияния признаков штаммов знтомопатогенных грибов осуществляли с помоіДью пакета гдаикладных программ "Microstat" для ХВМ-компькетеров и Stat для ЭВМ СМ-4, разработанном в ВИЗРЛЬ основе множествен
Биологический потенциал звтошшатогенньк грибов для контроля числениостм вредных насекомых и клещей в теплицах
Таким образом, изучение штаммового разнообразия у актомопа-тогенных грибов-возбудителей мускардиндаов позволило нам выявить отчетливую дифференциацию штаммов по признаку вирулентности и отобрать высокоактивные штаммы в отношении сосущих вредных насекомых закрытого грунта. Отмечен факт, когда высоковирулентные штаммы были активными на большинстве видов тест-насекомых. Детальный анализ протекания инфекционного процесса позволил получить оригинальные данные по паразитическим циклам развития патогенов и симптоматике мускардинозов насекомых. Так, применительно к новым видам, поражаемых B.bassiana Vlecan и Pfrnnoso rosms к ксж рьТашо4гся вУшеназванныё виды тлей и оранжерейная белокрылкГ зкеп еетаТно подавер-жден основной путь внедренияТрибной инфекции через половы тела насекомых І азитїеский Ьикл развитяувеех тоехвдд» грибов сходен характеризуется бшттюфным типом ш гйия Гсо-стоит из следу щих стадий: - набухание конидий И образование проростков гриба, иногда сопровождаемое появлением аппрессориевидных структур на кутикуле насекомых-хозяев; - внедрение инфекционных проростков в тело насекомого; - гибель тлей и белокрылок за счет выделения токсичных метаболитов и разрастания гриба в теле насекомых-хозяев; - в условиях повышенной влажности воздуха и температуры в ггоепелах 20-30 С на пораженных тлях и белокрылке итеягжгвко раз-вдается мицелий и формируется спороношение гриба.
Симптоматика мускардинозов тлей имеет ряд особенностей. При поражении грибом B.bassiana гороховой тли A.pisum через 30-40 часов после инокуляции водной споровой суспензией тля впадает в состояние паралича, происходит потеря координации движения и прекращается питание. В течение 3-4 суток происходит отмирание насекомых. Штаммовая специфичность проявляется в вариациях окраски трупов от бурого до сиреневого, и часть штаммов осуществляет быстротечный тип патогенеза с отчетливым токсикозом (Пав-люшин, 1983 б, г). Вертициллез оранжерейной белокрылки характеризовался появлением коричневатых пятен на пораженных личинках и выделением экссудата. У зараженных имаго отмечалось изменение в поведенческих реакциях и регистрировался паралич (Пав-люшин, АванесоБ, 1986).
Более полная картина развития симптомов микоза насекомых была получека нами при поражении грибом B.bassiana гусениц большой вощинной моли СЫШа rmllandla L (Павлюшин 1979) Тлиз уГсІоІешс пато ау галодэии при заражении 16 штаммами было установлено чгГгриб гфоникаетчерез дыхальца основание ложноножки сегмент Ложку Впервые была даказана штаммовая специфичность в симпгомаТике белого мускардиноза. Так по способности вызывать меланизацию тела хозяша обусловленную ашсумуляцией меланиновых пигментов (Gabriel 1968) штаммы BbLtana шзделяются йа три ГРУППЫ Выявлены пггаммы к и ттїгьящуплаmS не вь шїїг мелЇЇ а ней wr S w bi a r l теле SSLSS iS T S TSro ea гоТмїскар-доноїTSTSSS к пеїедаи нию алХ гїїеїие турюра тела гусемівадіют на коне ап атогеніа и тшшш VT pTxacrSnop Т фТдостагаїї 2Ш млн/мли Гшташс повьшенной РШ Ь ИТОТО Таким образом, анализируя размах изменчивости вирулентности штаммов B.bassiana, V ІРСОЛІІІ выявляя основные элементы пара-зитических циклов развития нам удалось отобрать вирулентные штаммы в омниивредоноскіх видов тлей, тригкюв и оранжерейной белокрылки. Рашшрено представление о симптоматике мускар динозов насекомых, показана корреляция их развития с накоплени-ем биомассы гриба в теле насекомого-хозяина с одной стороны и специфичносгь симптомов в зависимости от штамма возбудителя - с другой. Модельные тест-объекты гороховая тля и большая вощинная моль удобные для разведения и тестирования, позволяют получать углубленную информацию о микозах, и в то же время, целесообразны для первичного отбора вирулентных штаммов. Вышеизложенные особенности микозов насекомых указывают на сложность признака вирулентности у энтомопатогенных грибов и подчеркивают необходимость анализа ее факторов или фшиолого-биохимических составляющих.
По современным представлениям паразитологии проявление вирулентных свойств у патогена зависит от наличия оптимальной питательной среды в организме хозяина, преодоления его иммунных реакций, а также от факторов внешней среды. Ю.В.Езепчук (1977) разделяет все известные факторы патогенности бактерий на три группы. К первой группе отнесены ферменты, способные деполиме-ризовать субстрат, препятствующий проникновению и распространению паразита. Факторы второй группы выполняют функцию защиты от фагоцитоза, а в третью включены факторы, определяющие токсигенность. Указанные закономерности были апробированы нами на энтомопатогенных грибах B.bassiana и V.tecami. На модели Bbassiana - GmetomUa с использованием ауксотрофных мутантов гриба были йсследованы пищевые потребности патогена иТценена их роль в реализации признака вирулентности (Павлюшин, Левитин, 1977; Paviyusm 1978). УФ-облучением конидий получены мутанты с нарушенным синтезом аминокислот, витаминов и аденина. Моноауксотрофные мутанты с нарушенным синтезом метаонина при перкутанном заражении гусениц G.mekmella почти не обнаружили снижения вирулентности по сравнению с исходным штаммом. Лей-цинзависимые мутанты оказались средне- и слабовирулентными. Триптофан- и артанинзависймые варианты, как и мутанты с потребностью в аденине, были авирулентными. Сходные ряды активности биохимических мутантов В.Ъашаш были получены Л.И.УСЄНКО и др. (1973) и АЖНиколаевым и ЛЖАхатхиной (1974) при заражении грибом мух Drosophua mtanogaster и Musca domestiea. Восстановление вирулентности мутантов происходит при интрагемоцеллярном введении, когда из паразитического цикла гриба исключается этап проникновения через кутикулу насекомого-хозяина.
На указанной хозяино-паразитной системе наш была проанализирована устойчивость патогена к клеточной и гуморальной защите насекомого-хозяина (Евлажова, Павлюшин, 1983 а; Павлюшин, 1980, 1982). Были выявлены различные стадии взаимодействия бла-стоспор и других элементов гриба с гемоцитами, приводящие к клеточной инкапсуляции. Однако фагоцитарный эффект отличался незавершенным типом и практически не выполнял функции защиты от патогена. Таким образом, гемолимфа G.meloneEa является оптимальной пищевой средой, а гуморальная и клеточная защита индифферентна против гриба B.bassi&a.-. Аналогичные результаты были получены при заражении гусениц Cmekmella грибом VJecanii (Павлюшин, Аванесов, 1985).
Факторы вирулентности энтомопатогенных грибов
Виологическая эффективность биопрепаратов вертициллин-к и боверина против вредных насекомых в теплицах. Eta основе перспективных штаммов-продуцентов B.bassiana и V lecanii нами были созданы биоггоепараты бовешш и веоташиллин-к acbdLrjSbie для шктроля Лиевой тли тХчногГтрипсаи ораХйейной белокрылкТосновой препаратов служат конидии гюлучаємьіе при стационарном культивировании грибов на жидких питательных средах. При этом была разработана на шс-техническая дожигания состоящая из технологических регламентов на произадстюТугаови гшоизводственньїх биолабораторий и биосЬ?брик меХ и П РФ тех2еских условий и технологий гтименения ш каждому биопрепарату. Обобщен опыт наработки и пользования боверина и BepW в теплицах Северо-Запада РФ Нечерноземнойзоне, Красдаского края ршшрьГОпреде-лшощим моментом в технологии применения биопрепаратов, кроме ггрепаративной сЬормы и опрыскивающей аппаратуры, .является строгий учет условий, несводимых для реализации вирулентных свойств г аммами-продуцента Так высокая бтлогиїЙкая эффективность вертицилтна-к на имаго и личинках оранжерейной белокрьшш соответственно до 78% и 94%, а также бахчевой тли, достигалась при относительной влажности воздуха более 80% и температуре в пределах 21-30С. При этом требуются две обработки с интервалом в 7-Ю дней и титром спор в рабочей суспензиям равному 50 млв/мл. Эффективность боверина (штамм-продуцент B.bussiaTW, К2) против табачного трипса в условиях производственных теплиц АОЗТ "ЛБТО" была на уровне 83% (Слободянюк, Ясюк, Павлюшин, 1Уо5; Павлюшин, Аванесов, 1986; акты испытаний от Калининской СТАЗР, Сочинской и Краснодарской биофабрик, биолабораторий совхоза "Рига" (Латвия), АОЗТ "ЛЕТО" Ленинградской области. Киевской Республиканской спецбиолаборатории).
Начиная с 1975 года и по настоящее время нами осуществляется поставка штаммов-продуцентов и научно-технической документации для получения вертициллина более чем 20 биолабораториям и биофабрикам РФ.
Экономическая эффективность использования указанных биопрепаратов достаточно высока. Например, по ценам 1985 года, окупаемость затрат на защиту овощных культур в теплицах с применением вертициллина была 8-кратная, а годовой экономический эффект с 1 м площади составлял 2.58 рубля. По уровню эффективности разработанные нами биопрепараты аналогичны боверолу и бове-росилу, созданным в Чехословакии для борьбы с колорадским жуком и вредителями запасов, верталеку и микоталу, производящихся в Англии для защиты растений от оранжерейной белокрылки и тлей, а также новому биопрепарату, разработанному в США на основе энтомопатогенного гриба Paecilomyces fumoso-roseus PFR-20 GW для контроля белокрылки (Lindquist, 1996).
Токсины энтомопатогенэых грибов и актинопшцетов, и возможвости их использования против вредных насекомых и клещей на овощных культурах в закрытом грунте Как показывает мировая литература, развитие исследований в области инфекционной патологии членистоногих и создание биопрепаратов, особенно ярко это проявляется применительно к хорошо изученной энтомопатогенной бактерии Bihurinaiensis. тесно связано с энтомоцидными микробными метаболитами (Фалкон, 1976; Лысенко, Кучеш, 1976; Кандыбин, 1989\ Наши исследование микозов на-секоміаи обобщениенакопленных данных по биологически активным вещесттам, щюдуцируємьіе энтомофторовыми грибами (Воронина W89) іеителями родов АхрегЫВш MrtarrLtom Bemlveria ГЕвлЗова Павлюшин 1983; NeineTet al 1973 Hamffiet pcSS хт ш гоксшоп сшдак о ссот тенсивно размножающихся видов насекомых и клещей (белокрылки, тли, трипсы, паутинный клещ) с накладкой поколений. Токсшшые препаративные формы малоопасны для теплокровных, специфично и эффективно снижают угрожающую численность вредителей за короткий срок, а их применение не требует создания особых климатических условий.
Энтомпцидные метаболиты Vatieillium lecanii Как было показано ранее (табл. 6) при заражении V.lecanii личинок оранжерейной белокрылки у большинства штаммов наблюдался опережающий токсикоз, приводящий к гибели насекомых. Причем выделились штаммы с отчетлшьши вирулентными свойствами, значительный вклад в реализацию которых осуществляли зкзотоксины.
Анализ токсшюобразования методом экстракции метаболитов из мицелия с последующим контактным тестированием на насекомых показал, что все штаммы гриба синтезируют инсектицидные веще ства. Было установлено, что преимущественное накопление токсинов идет внутри мицелия (табл. 11) и только незначительная часть ток синов выделяется в культуральную жидкость. Содержание токсиче ской фракции (%) и инсектицидная активность (%) зависели от штамма гриба и варьировали в пределах 4.8-21.1 и 6.0-81,0%, соот ветственно (Житйна, Павлюшин, 1990; Гиндина, Митина, Павлюшин, 1990). Изучение связи токсинообразования с физиологическими ха рактеристиками роста гриба было проведено в условиях глубинной ферментации на штамме V.lecanii Р-81, Обнаружено появление ин сектицидных метабол1тов после 2-х суток культивирования на сре де Чапека. Максимальный выход токсинсодержащей фракции соста вил 17.1% (на 7-е сутки); ее наибольшая активность - 91.3% смерт ность гороховой тли - на 9-е сутки роста. Очевидно, биосинтез зна чительного количества инсектицидных мегаболитов у V.lecanii не только влияет на характер протекания микоза у насекомых, но и взаимосвязан с основными физиологическими стадиями развития гриба, божественный регрессионный анализ влияния признаков позволил выявить связь выходом экзотоксинов и продуктив ностью штамма по конидиям, бластоспором и биомассе (коэффициент множественной корреляции 0.66). Получено уравнение прогноза вирулентности штаммов в отношении личинок оранжерейной белокрылки следующего вида: Ую = -0.2274Х! - 0,3969x2 - 0.5979х5 + а2032х + Є.181х8 + 0.8277, где ую - преобразованная вирулентность при заражении штаммами in vivo- xi - содержание токсической фракции в бдамассе, %; х2 содержание токсической фракции в натишом растворе, %; Х5 - выход биомассы, мг/мл; х8 - морщинистость колоний, баллы. 35 Указанный набор признаков обнаружил наиболее высокий коэффициент множественной корреляции (0.703) по влиянию на вирулентность штаммов V.lscanii.
Для удобства расчета вирулентности построена номохрамма (Митина, Сергеев, Павлюшин, 1997). Таким образом, впервые для энтомопатогенных грибов показана принцшшальная возможность прогноза вирулентности по физиолого-биохимическим особенностям патогена с обязательным учетом признака токсинообразования.
В ходе выделения, очистки и идентификации действующих веществ токсического комплекса V.lecami было установлето, что энто-моцидные метаболиты гриба содеркатся в липидной фракции (до 4% от общих липидов) и представлены двумя активными компонентами, названных нами токсином-1 (стабильное соединение, вызывающее гибель тест-насекомых в течение 15-20 минут) и токсином-2, характеризующееся нестабильностью и приводящее к гибели тлей в течение нескольких часов Выявлена химическая природа токсина-1 -основного действующего вещества токсического комплекса, которое определено нами как триглицеридный фэефоэфир (Мвес—390 у.е,). Это соединение отличается от уже известных инсектицидных метаболитов VJ&cann - бассианолида и дипиколиновой кислота (Claydon, Grove, 1982; Murakoshi et aL, 1978). Образование аналогичного соединения, обладающего контактной акгивностью, установлено и для грибов рода Entomophthara (Воронина и др., 1987, 1988), что указывает на закономерность биосинтеза биологически активных фосфо-яипидоБ у энтомопатогенных грибов. Учитывая зависимость токсин-нобразования у микроорганизмов от состава питательной среды и условий культивирования были осуществлены исследования по оптимизации среды для VJecanii (шт.Р-81) по указанному признаку. Максимальный выход биомассы гриба (15.1 мг/мл) и липидов (23.5%) с инсектицидной активностью равной 98% был получен при глубинном росте гриба на оптимизированной модифицированной среде с пептоном (табл. 12). Планирование экспериментов по оптимизации среды по пяти параметрам (концентрация азота, углерода, КН2ГО4, MgSQj, рН среды) проводили симплексным методом (Митина, Павлюшин, 1992; Новикова, Митина, Павлюшин, 1995). Было показано, что рост V.lecanii (штР-81) на сбалансированной среде происходит синхронно, при этом процесс соксинообразования связан с слеточной дифференциацией; выход биомассы и токсинсодержащей фракции увеличивался на 15% и 12%, соответственно, по сравнению с неоп-тимизированной средой. С учетом полученных данных была предложена питательная среда для промышленного культивирования V.lscanii следующего состава: БВК - 1%, зетеная патока - 4%, КН2РО4 -0.2%, MgSO i - 0.1%, которая позволяет увеличить выход биомассы и токсинсодержащей фракции гриба в 2-3 раза.
Похожие диссертации на Научные основы использования энтомопатогенов и микробов-антагонистов в фитосанитарной оптимизации тепличных агробиоценозов
