Введение к работе
Актуальность проблемы. Работы'по созданию устойчивых сортов тре-/ют иммунологически обоснованного подхода к выбору источников и до-эров устойчивости. В связи с этим наиболее важным в теоретическом и рикладном отношении является вскрытие закономерностей параэитирова-ия возбудителей болезней на растениях и познание факторов, влияющих а исход взаимоотношений патоген - растение-хозяин. Решение этой роблемы требует многогранного освещения вопросов, находящихся на тыке таких дисциплин, как фитопатология, иммунология, иммунохимия, изиология, биохимия, цитология.
Большинство исследований этого, направления посвящено атакующей истеме патогенов, а свойство устойчивости одних сортов растений и осприимчивости других связывается с уровнем детоксикации, инактива-ии гормонов и выработкой фитоалексинов.
Значительная'часть исследований освещает изменения в метаболизме астений, возникающие при внедрении патогена и включающие синтез как ысокоспецифических, так и неспоцифических веществ. Характер ответ-ых реакций растений', как известно, предопределяется свойственным . ля них обменом веществ', закодированным в генетической структуре. В той связи не меньший интерес представляет сравнительное изучение пецифических особенностей устойчивых и восприимчивых к заболеванию ортов.
При всей многогранности проявления обмена веществ у любого орга-изма центральным звеном является синтез белка - ключевого элемента иологических, транспортных и энергетических систем. Среди методов зучения качественных особенностей белков перспективны методы иммуно-:имки, с непревзойденной специфичностью и высокой разрешающей опособ-;остью.
Иммунохишчоские методы основаны на использовании сывороток жи-10ТНЫХ - биологического теста, позволяющего безошибочно оп- делить ;тепень сходства и хиг.отческую индивидуальность белков, полисахаридов і нуклеопротеидов, а исходя из этого - иммунохимическое сходство и эазличио между близкими и эволюционно отдаленными видами живых орга-іизмов и, в частности, подойти к пониманию проявления паразитизма у іатогенов растений.
Наши исследования, связанные с изучением механизма взаимодействия патогена и растения на молекулярном и клеточном, уровнях, с опре-іелением природы устойчивости последнего, проводимые на ряде систем эастение-патоген /кормовые-злаковые, пасленовые; технические-мальво-зые в отношении биотрофов и некротрофов/, основывались на изучении
биохимической характеристики структур, обесиечиваюцих ато взаимодей ствие. Поэтому особое значение приобретают исследования, посвященны роли сходных антигенов патогена и растения, участвущих в перекрест них реакциях, а также не обнаруживающих этого свойства, установлени их природы, локализации, функции.
Полагаем, что такие исследования моленулярно-биологических оснс паразитизма позволяют определить роль биополимеров различной природ и их комплекса не только в постиндуекщюнный, но и в преинфекционны} период. Это очень важно, поскольку позволит определить генотшшчес-кие свойства растения по признаку устойчивости к тем или иным фито-патогенам независимо от развития инфекции в природе, так как не всі да и не в каждой. sone испытания сорта есть условия, благоприятствуї щие развитию отдельных рао возбудителя, так необходимые для характі ристики сортов на болезнеустойчивость.
Цель и задачи исследований. Цель работы - изучить взаимоотноше ния между возбудителями заболеваний и растениями-хозяевами на моле кулярном и субклеточном уровнях на основании выявления иммунохимич ких и биохимических свойств их биополимеров с целью разработки над них методов,определения свойства устойчивости растений.
Подходя к изучению природы устойчивости с позиций того, что па зитизм фитопатогенов обусловлен сходством белков патогена и растен нами были получены новые данные о том, что сходство обусловлено не только белками, как считалась ранее, что и выдвинуло для изучения вые вопросы. Таким образом, задачи исследования механизма паразиті вания заключались в следующем: установить природу иммунохимически сходных, или перекрестно реагирующих,' антигенов и природу рецепто] "распознавдюс" биополимеры патогена и растения; выявить структури* подобие белков патогена и растения-хозяина, перекрестно реагирую* в иммунохишческих реакциях; выявить локализацию перекрестно.реаи рующих антигенов .пат.огена и растения; выяснить, на-какие системы' внутриклеточного метаболизма действуют сходные и несходные с раст ем антигены патогена и в чем состоит это действие; определить, ка физиологическую реакцию клеток растения обуславливает взаимодейст "партнеров"; установить роль структурных и функциональноактивных' ков^ а также гликопротеидов и лектинов в проявлении свойства усто вости/восприимчивости растений; определить качественное разнообра белков в проявлении паразитизма у .фитопатогенов в пределах вида. Вое пересичленные вопросы в разной степени решались на разных системах патоген-хозяин во взаимосвязи, поскольку они являются ді сторонами одного процесса в бинарной системе, и в соответствии с-
іиожностью количественного получения того или иного биополимера для исследования.
Научная новизна работы. Впервые в фитопатологической практике детально исследованы с позиций иммунохимического сходства антигенов патогена и растения вопроси,паразитизма и природи устойчивости растений. Впервые полученн данные, доназнваицио, что контроль за синтезом иммунохн'»ически сходных полипептидннх цепей фитопатогена и растения осуществляется сходными генами - на примере возбудителя фитофтороза и картофеля. Впервые установлено также на этой патосистеме, что им-мунохимически сходные, или перекрестно реагирущие антигены патогена и растения, т.е. то, которыми обуславливается паразитизм, локализованы в мембранних'структурах клетки: тонопласте, плазмалемме, наружных мембранах хлоропластов, а также в цитозоле клетки листа, а у патогена - в оболочке мицелия и зооспор.
Получены новые данные о том, что антигены патогена и конгениаль
ного растения, наравне с белками, представлены гллкопротеидаш и уг-
леводсвязывающими белками. Биополимеры такой природы выявлены не
только в цитозоле клетки, но и в мембранных структурах, что ранее
отмечалось только для животных тканей. Впервые среди антигенов листь
ев картофеля, иммунохимически сходных с таковыми патогена, были обна
ружены антигены-фитогемагглютининн /лектинц/. Кроме того, обнаружены
лектины растения, которые не проявляют иммунохимического сходства о
биополимерами патогена и характеризуются кнгибиторной активностью.
Впервые обе группы лектинов выделены из листьев картофеля и из лек-
тинов трипсинподобные ингибиторы. Впервые показано наличие гемагглю-
тинирущей /лектшшодобной/ активности для ингибиторов трипсинподоб-
ннх л химотрнпеинподобннх ферментов листьев картофеля.
Новые данные свидетельствуют о наличии лектинов-эритроагглютюш-нов среди антигенов фитопатогена - возбудителя фитофтороза. Обнаружено также на примере возбудителя фитофтороза картофеля и растения-хозяина, что антиген растения, иммунохимическая детерминанта которого построена по типу аминосахара №-ацетил-Д-глюкозамина, является рецептором для биополимеров фитопатогена и локализован в мембранных структурах клетки. Установлено на двух системах патоген-хозяин /картофель-розбудителъ фитофтороза, кукуруза--возбудители головневых/, что имму-юхимически сходные, или перекрестно реагирующие антигены "партнеров" збладгшт множественной ферментативной активностью. Установлено на па-госистемах картофель-возбудитель фитофтороза', хлопчатник-возбудитель зертициллеза, что полипептидные цепи белков патогена, сходные с тако-знми растения, являются индукторатли экспрессии генов последних.
Разработан оригинальный метод определения свойства устойчивости растений различных сельскохозяйственных культур к фитопатогенным микроорганизмам на основании учета таксономии иммунохимически сходных биополимеров. Разработан новый метод определения неспецифической устойчивости картофеля к возбудителю, фитофтора по количественному учету лектинов /эритроагглютининов/ листьев.
Положения, выносимые на защиту. Согласно полученным данным, было сформулировано положение, касающееся познания отдельных сторон механизма паразитирования и устойчивости растений к фитопатогенам.
Паразитизм фитопатогенов возможен при наличии перекрестно реагирующих, или сходных, структур разной природы: гликопротеидов, угле-водсвязывающих белков, лектинов /фитоагглютининов/, структурных и ферментативноактивных белков, локализованных в мембранных структура] клетки растения и патогена.
Формирование связей в фитопатосистеме осуществляется благодаря
подобию протеинов, синтез которых контролируется сходными генами,
гликопротеидов и лектинс-в'с антигенными детерминантами углеводной
природы и, в частности, имеющим структурное подобие, аналогичное ам
носахару Я-ацетил-Д-глюкозамину/для системы возбудитель фитофтороза
картофель-листья/, которыми осуществляется взаимное "распознавание"
Благодаря белкам, обеспечивающим иммунохимическое взаимрдействи
и проявляющим ферментативную активность, с одной стороны, патоген
вмешивается в метаболизм растения-хозяина, с другой - растение обус
лавливает проявление защитной ответной реакции, собтветстиушщаи cBot
ству- устойчивости, связанному"с функцией белков, лектинов, фермен
тов и их ингибиторов. ...
Всеми перечисленными биополимерами, участвующими в перекрестно: реакции, обуславливается как специфическое, так и неспецифическое взаимодействие в фитопатосистеме. В зависимости от специфики сходе реализуется свойство устойчивости или восприимчивости. Изменение м таболизма растения и его влияние на возбудителя болезни - все это вторичные проявления, которые так или иначе зависят от того, наскс ко' сходны перекрестно реагирующие структуры, ""стимулирующие-, экспр рию генов во взаимодействующей системе..
'Обосновывается способ определения .свойства.устойчивости растеї в связи со знанием таксономического уровня отдельных лолипептиднт цепей белков или их комплекса, проявляющих и не обнаруживающих имі нохимического сходства с патогеном.
Обосновывается также способ-определения свойства неспецифйчес: устойчивости растений картофеля к возбудителю фитофтороза на осно
ний использования такого критерия, как титр гемагглютинирующей способности клеточного сока листьев растения.
Совокупность сформулированных нами научных положений можно квалифицировать как перспективное направление в области фитоиммунитета - иммунобиологические основы паразитизма фитопатогенов и устойчивости растений, позволяющее в кратчайшие сроки решать вопросы практической селекции.
Практическое значения и использование результатов работы. Резуль-таты исследований позволили вскрыть новые закономерности паразитизма, расширить представление о природе и роли перекрестно реагирующих биополимеров . фитопатогена и растения, углубить знания в вопросах специализации фитопатогенов.
Решение части поетавленных задач по изучению молекулярных меха-, низмов взаимодействия фитопатогенных микроорганизмов и растения-хозяина позволило нам решить вопросы практической значимости.
Определить свойство устойчивости таких сельскохозяйственных растений, как картофель, пшеница, кукуруза, к различным по выраженности паразитизма фитопатогенним микроорганизмам /отдельным расам/ на основании учета таксономии их иммунохимически сходных антигенов /с использованием сыворотки к белкам патогена/.
Определить свойство неспецифической устойчивости растений картофеля к возбудителю фитофтороза на основании гемагглютинирующей активности биополимеров листьев.
Для целей селекции на устойчивость к фитопатогенам определить успешность подбора исходных родительских форм картофеля, кукурузы в результате выявления приуроченности патогена, выражающейся в наличии иммунох'имическо'го сходства его белков с протеинами гибридов, характеризующих крупные таксоны растений. Определить характер экспрессии генов родительских форм в гибридах картофеля, пшеницы, кукурузы по признаку устойчивости к фитопатогенам и по-фенотипу, определяемых по им-мунохимическим свойствам белков. Осуществить поиск источников устойчивости к фитопатогенам, произвести отбор устойчивых линий, сортооб-.разцов, сортов на основании анализа и учета белков растения, как про-. являющих иммунохимическое сходство с патогеном, так и не. обнаруживающих его и, кроме того, характеризующихся определенной ферментативной активностью.
Разработанный метод микроиммунофоретического анализа белков растений и фитопатогенов используется в ряде НИУ страны.
Внесено усовершенствование в методы выделения лектинов, в частности, 'предложено сочетать методы ионообменной, а также аффинной" хро-
ыатографии с методом электрофореза и шлмунохишческого тестирования.
Внедрены в прайтику научно-исследовательских институтов методические указания по определению свойства устойчивости растений к фитопато-генам на основании использования различных биохимических критериев /1975, 1980, 19G2, 1990 гг./l
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на 2-м съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова /Ленинград, 1972/, Конференции Европейских и Средиземноморских стран о ржавчине хлебных злаков /Прага, 1972/, У1, УП , УШ Всесоюзних совещаниях по иммунитету с/х растении к болезням и вредителям /Одесса, 1975; Омск, 1981; Рига, 1986/, УШ Международном конгрессе по защите растений /Москва, 1975/, ХП Международном конгрессе по ботанике /Ленинград, 1975/, Ш съезде Украинского общества генетиков и селекционеров /Киев, 1976/, Ш Ыэздународном съезде по ржаьчишшм грибам /Швейцария, 1976/, Всесоюзном совещании по биохимии иммунитета растений к паразитным грибам /Москва, 1977/, Советско-Шведском симпозиуме "Физио-лого-бпохимические и.генетические основи иммунитета с/х растений к болезням" /Киев, 1978/, Всесоюзном семинара "Иммунохимичоские методи в целях определения иммунных свойств растений" /Дотнува, 1981/, Всесоюзной конференцій "Проблемы и пути повышения устойчивости растений к болезням и экстремальным условиям среды и связи с задачами селекции" /Ленинград, 1981/, Всесоюзной конференции по научно-методическим ос- ' новам селекции интенсивных сортов зерновых культур, устойчивых к неблагоприятным факторам климата /їїодино, 1981/, Всесоюзном совещании "Изменчивость фитопатогешшх микроорганизмов" /Рига, 1983/, ХП конференции но споровым растениям Ср.Азии, и Казахстана /Алма-Ата, 1983/, П Всесоюзной 'конференции "Экологическая генетика растений и животных" /Кишинев, 1984/, Всесоюзном совещании "Физиолого-биохимические основы иммунитета к грибным болезням растений" /Уфа, 1933/, Республиканской конференции "Изучение и применение лектиноь" /Тарту-Таллинн, 1983/, XI Международном симпозиуме "Йнтерлек" /Таллинн, 1939/.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 65 научных
работ. . . _
Объем и структура щбот'п. Диссертация состоит из вьедения, пяти глав, зайлючения, выводов,изложенных на 466 стр машинописного текста, включай'» 24 таблицы /26 стр./; приложение - 35 стр., список літератури - 125 стр.- содержит 1276 наименований,- в том числе 048 - на иностранных языках, документы о внедрении результатов исследования - 7-стр., 178 рисунков оформлены самостоятельным томом.
