Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Значение токсинообразующих грибов 12
1.2. Мониторинг токсинообразующих грибов зерновых злаков 16
1.2.1. В мире 16
1.2.2. В России 23
1.3. Фузариоз колоса 36
1.3.1. Симптомы заболевания 36
1.3.2. Источники инфекции, условия заражения и развитие болезни 39
1.4. Методы и средства защиты от фузариоза колоса 40
1.4.1. Химические средства защиты растений 40
1.4.2. Биологические средства защиты растений 40
1.5. Трихотеценовые фузариотоксины, зеараленои и фумонизины 44
1.5.1, Дезоксиниваленол, диацетоксискирпенол иТ-2 токсин 44
1.5.1.1. Физико-химические свойства трихотеценовых микотоксинов 44
1.5.1.2.Токсическое действие трихотеценовых микотоксинов 47
1.5.2. Микотоксин зеараленои 50
1.5.3. Фумонизины 51
1.6. Защита хранящегося зерна от поражения токсинообразующими грибами 55
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 58
2.1. Объекты исследования 58
2.2. Реактивы, материалы и приборы, используемые в работе 58
2.3. Методика лабораторных исследований 59
2.4. Методы количественного определения дезоксиниваленола (ДОН), диацетоксискирпенола (ДАС) и зеараленона (Ф-2) с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) 61
2.4.1. Количественное определение дезоксиниваленола, диацетоксискирпенола и зеараленона с помощью спектрофлюориметра фирмы «Хитачи» 63
2.4.2. Количественное определение дезоксиниваленола, диацетоксискирпенола и зеараленона с помощью денситометра «Сорбфил» 64
2.4.3. Количественное определение дезоксиниваленола, диацетоксискирпенола и зеараленона визуал ьно 65
2.5. Методика полевых опытов 65
2.6, Статистическая обработка 66
ГЛАВА 3. Годовые ритмы токсинообразования fusarium gram1nearum и fusarium verticilli01des 66
3.1. Изменчивость токсинообразования Fusarium graminearum и Fusarium verticillioides на автоклавированном зерне в зависимости от сорта, сезона года и вида фузария 66
3.2. Изменчивость токсинообразования Fusarium graminearum и Fusarium verticillioides на жизнеспособном стерильном зерне в зависимости от сорта, сезона года и вида фузария 76
3.3. Сравнительный анализ накопления токсинов ДОН, ДАС и Ф-2 в автоклавированном и жизнеспособном зерне, при заражении Fusarium graminearum и Fusarium verticillioides 83
3.4. Сравнительный анализ методов количественного определения концентрации,токсинов ДОН, ДАСи Ф-2 в зерне озимой пшеницы 89
ГЛАВА 4. Изучение способности к токсинонакоплению зерна основных с/х злаковых культур, возделываемых в краснодарском крае 92
4.1. Изучение способности зериактоксиноиакоплеиию 12 сортов ячменя при искусственном заражении грибом F.grammearum 92
4.2. Способность зерна кукурузы к токсинонакоплению при искусственном заражении грибами F.grammearum и F.verticillioides .94
4.3. Способность зерна районированных сортов озимой пшеницы к токсинонакоплению при искусственном заражении грибом F.grammearum 97
ГЛАВА 5 Эффективность биопрепаратов в защите хранящегося зерна и вегетирующих растений пшеницы от токсинообразующих грибов и накопления в нем микотоксинов 98
ГЛАВА 6. Фитопатологическое действие дон и ф-2 на вегетирующие растения и зерно злаковых культур 105
6.1. Влияние обработки растворами дезоксиниваленола и зеараленона зерна районированных высокопродуктивных сортов пшеницы на развитие проростков 105
6.2. Влияние растворов микотоксинов ДОН и Ф-2 на хранящееся зерно 110
Выводы 119
Практические рекомендации 123
Список использованной литературы
- Мониторинг токсинообразующих грибов зерновых злаков
- Методика лабораторных исследований
- Изменчивость токсинообразования Fusarium graminearum и Fusarium verticillioides на жизнеспособном стерильном зерне в зависимости от сорта, сезона года и вида фузария
- Способность зерна кукурузы к токсинонакоплению при искусственном заражении грибами F.grammearum и F.verticillioides
Введение к работе
Последнее столетие XX века характеризуется быстрым распространением в посевах сельскохозяйственных культур токсинообразующих грибов и повышением их вредоносности. Заражая продуктивные растения, эти грибы не только снижают урожайность на 30-50 %, но и загрязняют продукты урожая токсинами, опасными для теплокровных. Это резко ухудшает потребительские качества сельскохозяйственного пищевого сырья: биологическую полноценность и безопасность. По данным ФАО, более 30 % мирового сбора урожая продовольственных и кормовых культур загрязнено микотоксинами. В результате этого пищевая полноценность рационов снижается для человека на 20-25 %, а для сельскохозяйственных животных на 30-50 %. Хроническое поступление отдельных микотоксинов, и особенно их комплекса, в организм теплокровных, в т.ч. человека, даже в концентрации в 2-3 раза ниже ПДК, нарушает иммунный статус организма, резко отрицательно действует на кроветворные органы, органы пищеварения и центральную нервную систему [39,40,41,42,72,93,109,138,139 ].
Стоимость ежегодных потерь урожая от заражения культурных растений токсинообразующими грибами, от загрязнения продуктов урожая микотоксинами, снижения продуктивности и падежа сельскохозяйственных животных, потребляющих загрязненные корма, составляла только в США более 2,5 млрд. долл. в год [37].
По данным 30 наиболее развитых стран наибольшую опасность представляют фузариотоксины, афлатоксипы и токсины пенициллов. Начиная с 70-х годов проблема микотоксинов интенсивно разрабатывается в рамках программ: ФАО (ЮНЕЛ) ВОЗ: «Борьба с загрязнением пищевых продуктов. Микотоксины»; и ФАО/ВОЗ: «Ухудшение биологических свойств (полноценности и безопасности) продуктов питания и кормов», «Международная кооперация по технологиям послеуборочной переработки зерна и исследованию его качества». Фитопатологические, ветеринарные, медицинские и об-
щегигиенические аспекты этой проблемы, включая обеспечение безопасности продуктов питания и кормов, активно разрабатываются в Германии, Дании, Израиле, Италии, Канаде, Китае, США, Франции и Японии. В последние 10 лет эта проблема приобрела серьезное генетическое и военное значение в связи с тем, что основные наиболее распространенные фузарио- и афлатоксины являются сильными мутагенами и канцерогенами, а также веществами, нарушающими психическую деятельность и поведение человека [39,40,41,91,109], Они могут быть серьезной причиной генетического вырождения сортов.
Наиболее опасными фитопатогенными токсинообразующими грибами являются виды рода Fusarium. Эти виды повсеместно распространены в аг-роценозах всех зерносеющих стран мира. Они обитают в почве, являясь источником экономически очень вредоносных корневых гнилей злаковых культур и инокулюма для заражения вегетативных и генеративных органов растений. Виды фузариума, поражающие генеративные органы злаковых культур, не только заражают зерно и загрязняют его микотоксинами в период вегетации, но и продолжают развитие на зерне при хранении, многократно увеличивая содержание в нем фузариотоксинов (ФТ). Виды рода фузариум, поражающие соцветия злаковых культур, загрязняют зерно более чем 20 опасными микотоксинами (МТ), из которых в России санитарные нормы установлены только для дезоксиниваленола, зеараленона и Т-2 токсина.
На посевах злаковых культур наиболее широко распространены следующие вида фузариев: F. graminearum Schw., F. culmorum (W.G.Su.) Sacc, F.sporotrichioides (Sherb.), F.verticihioides (F. moniliforme Sheldon), F. nivale (Fr.) Ces., F. poae (Peck) Wollenberg, F. avenaceum (Fr.) Sacc, F. tricinctum (Corda) Sacc, F. equiseti (Corda) Sacc, F. oxysporum Schlecht Каждый из перечисленных видов фузариев при колонизации растений злаковых культур способен синтезировать и загрязнять зерно одновременно ДОН, Ф-2 или Т-2 и Ф-2. За последние 20 лет во всех зерносеющих странах в злаковых агроце-нозах наблюдается нарастание в популяциях фузариев частоты высокотокси-
ногенных штаммов - штаммов-суперпродуцентов ФТ, т.е. штаммов, способных при благоприятных условиях накапливать в зерне на растениях в поле, или при хранении более 3 мг/кг зерна одного или нескольких ФТ.
Необходимо отметить, что загрязнение продовольствия и фуража фу-зариотоксинами имеет выраженную тенденцию к нарастанию по степени риска для здоровья человека и сельскохозяйственных животных, вырождению зародышевой плазмы злаковых культур. Это определяется отсутствием устойчивых сортов зерновых культур к поражению грибами рода Fusarium, отсутствием перспектив создания таких сортов и отсутствием в настоящее время достаточно эффективных в отношении грибов Fusarium фунгицидов [1,28,39].
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы было изучение закономерностей изменчивости токсинообразования Fusarium graminearum Schwabe и Fusarium verticillioides (Sacc) Nirenberg (sin. F.moniliforme J. Sheld) на автоклавированном и жизнеспособном хранящемся зерне пшеницы в зависимости от сорта, сезона года и обработки биопрепаратами, а также в определении фитопатологического действия микотоксинов на вегетирующие растения и хранящееся зерно.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
-изучить влияние сортов пшеницы и времени года заражения их зерна аттестованными по токсиногенности штаммами видов F.graminearum и F.verticillioides на накопление в нем дезоксиниваленола (ДОН), диацетокси-скирпенола (ДАС) и зеараленона (Ф-2);
-изучить влияние сроков хранения в контролируемых условиях среды зараженного видами F.graminearum и F.verticillioides зерна исследуемых сортов пшеницы на динамику содержания в нем ДОН, ДАС и Ф-2;
-провести сравнительное изучение методов количественного определения концентрации токсинов в зерне исследуемых сортов пшеницы;
-изучить способность к токсинонакоплению сортов основных злаковых культур, возделываемых в Краснодарском крае;
- изучить сравнительную эффективность защитного действия биопрепаратов при использовании предпосевной обработки семян и обработки веге-тирующих растений бактофитом, псевдобактерином и дизофунгином на по-раженность токсиногенными грибами и накопление микотоксинов ДОН и Ф-2 в зерне.
Научная новизна работы.
Впервые установлены сезонные ритмы максимумов накопления токсинов ДОН, ДАС и Ф-2 в зараженном F.graminearum и F.verticillioides жизнеспособном и автокдавированном зерне 6 сортов озимой пшеницы.
Сравнительные исследования защитного действия биопрепаратов бак-тофита, псевдобактерина и нового биопрепарата дизофунгина против фуза-риоза колоса и накопления фузариотоксииов в хранящемся зерне, позволили установить высокую защитную активность дизофунгина.
Установлены различия определяемого методом тонкослойной хроматографии уровня концентрации токсинов ДОН, ДАС и Ф-2 в зерне в зависимости от метода сканирования хроматограмм: визуального, денситометрическо-го и спектрофлюорометрического.
Выявлено влияние сроков хранения в контролируемых условиях среды зараженного разными по токсиногенносги штаммами F. graminearum зерна исследуемых сортов пшеницы на динамику содержания в нем ДОН и Ф-2.
Выявлено влияние обработки зерна растворами чистых микотоксинов ДОН и Ф-2 на развитие проростков, а также на показатели жизнеспособности обработанного зерна при хранении. Установлено, что наибольшее фитоток-сическое действие на вегетирующие растения районированных высокопродуктивных сортов пшеницы оказывал токсин ДОН.
Изучены и выявлены сортовые различия зерна пшеницы, ячменя и кукурузы по способности при хранении накапливать фузариотоксины - дезокси-ниваленол, зеараленон и диацетоксискирпенол.
Научно - практическая значимость работы. Исследования по изучению годового ритма токсинообразования F.graminearum и F.verticillioides на хранящемся зерне разных сортов озимой пшеницы позволили выявить сезоны и месяцы максимумов снижения и повышения концентрации токсинов ДОН, ДАС и Ф-2, а также различный уровень устойчивости к токсинонакоп-лению сортов озимой пшеницы, что может использоваться для разработки рекомендаций для технологии закладки зерна на хранение, а также его защиты от поражения токсинообразующими грибами.
Выделены различные уровни способности к токсинонакошгению зерном 59 районированных сортов и гибридов озимой пшеницы, ячменя и кукурузы, при искусственном поражении их F.graminearum и F.verticillioides.
Проверена способность биопрепаратов бактофита, псевдобактерина и дизофунгииа защищать вегетирующие растения озимой пшеницы, а также зерно при хранении, от поражения токсинообразующими грибами и накопления в нем микотоксинов ДОН, ДАС и Ф-2.
При исследованиях уровня концентрации микотоксинов в зерне был апробирован и предложен для использования в научных исследованиях новый, разработанный с участием лаборатории и зарегистрированный как государственное средство измерения денситометр «Сорбфил», позволяющий достоверно определять концентрацию микотоксинов в зерне и зернопродуктах. В качестве арбитражного метода определения концентрации токсинов в зерне можно использовать спектрофлюориметр «Хитачи», Япония. Основные положения выносимые на защиту:
- накопление фузариотоксинов ДОН, ДАС и Ф-2 в автоклавированном
и жизнеспособном хранящемся зерне интенсивных сортов пшеницы, зара
женном F.graminearum и F.verticillioides имеет определенную сезонную ди
намику;
- уровни токсинообразования ДОН, ДАС и Ф-2 у F.graminearum и
F.verticillioides при заражении лшзнеспо со бного и автоклавированного зерна
разных сортов озимой пшеницы различны;
- существуют четкие сортовые различия зерна пшеницы, ячменя и кукурузы по способности накапливать фузариотоксины дезоксиниваленол, зеара-ленон.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на региональных конференциях: «5-я Региональная научно-практическая конференция молодых ученых Кубани» (Краснодар, 2003); «Совершенствование систем земледелия в различных агроландшафтах Краснодарского края», (Краснодар, 2004): на Российских конференциях: Всероссийская научно-практическая конференция, посвященная 100-летию со дня рождения Е.М. Степанова (Краснодар, 2002); Всероссийское совещание «Современные системы защиты растений от болезней и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии» (Голицино, 2003); «Современное состояние и приоритеты развития фундаментальных наук в регионах» (Анапа, 2004); на международных конференциях: «Хранение зерна-2003»( Москва, 2003); «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэко-стем» (Краснодар, 2004); международном симпозиуме «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасиости» (Москва, 2004).
Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 12 научных работах, общим объемом 32 печатных листа.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (1 глава), описания основных материалов и методов исследования (2 глава), обсуждения результатов экспериментальных исследований изложены в главах 3-6, выводов, практических рекомендаций, списка литературы (212 источников, в том числе 110 зарубежных авторов). Работа изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы и 14 рисунков.
(0
Благодарность. Автор приносит глубокую благодарность научному руководителю диссертационной работы к.б.н. О.А. Монастырскому; к.б.н. Е.В. Кузнецовой; к.б.н. Л.К. Анпилоговой и к.б.н. В.Я. Исмаилову за помощь, оказанную при выполнении исследований и оформлении работы.
'
Мониторинг токсинообразующих грибов зерновых злаков
Накопленный за последние десятилетия фактический материал позволяет сделать вывод о повсеместном распространении как продуцентов трихо-теценовых микотоксинов (ТТМТ), так и самих токсинов [159,184]. Наиболее часто грибы рода Fusarium поражают злаковые сельскохозяйственные культуры в регионах с влажным и умеренно теплым климатом, как в-нашей стране, так и за рубежом. Вспышки фузариоза зерновых культур неоднократно отмечались в разных странах мира, в частности в Канаде, США, Японии, Китае,Индии, странах центральной Европы. [158,183,184].
Основным микотоксином, загрязняющим зерно, в России, США, Канаде, Австрии, Италии, Великобритании, Северной Африке и ряде других стран является ДОН [130,131,187,197].
В определенных географических зонах возделывания злаковых культур доминирует преимущественно один вид фузариев. В разных зонах могут доминировать F.graminearum, F. verticillioides, F.sporotnchioides, F.culmorum [44,51,52,145]. Однако F.graminearum преобладает в посевах всех основных зерносеющих странах мира и является основным возбудителем эпифитотий фузариоза колоса (ФК) [120].
Особенно следует отметить, что большие экономические потери от эпифитотий ФК определяются тем, что в настоящее время в мире не существует сортов, устойчивых к поражению фузариями, эффективных биологических и химических средств борьбы с болезнью, а также надежных и экономически приемлемых способов детоксикации зерна, загрязненного ФТ. Поэтому значительные потери от ФК несут все страны независимо от уровня развития сельского хозяйства, и растениеводства в частности. Площади посе BOB, поражаемых ФК, постоянно увеличиваются, Примером являются страны с высоко технологичным сельскохозяйственным производством.
В США эпифитотий ФК на пшенице, ячмене и кукурузе наблюдаются в среднем раз в 3 года. Наиболее опасные эпифитотий отмечены в 1971, 1975, 1982, 1985, 1990, 1991 и 1993 гг. Основными возбудителями заболевания были виды F. graminearum (75 % от всех изученных изолятов), F.poae -17 %, F.cuimorum и F.verlicillioides -5 %, другие виды фузариев - менее 2 % [27,66]. В годы эпифитотий в отдельных штатах кукурузного пояса более 50 % посевов ячменя и кукурузы были поражены ФК. В 1972 г проанализированные образцы кукурузы, взятые с элеваторов, содержали Ф-2 в концентрации до 5 мг/кг. В 31 из 33 образцов пшеницы урожая 1982 г., отобранных в штатах Канзас и Небраска, обнаружен дезоксиниваленол в концентрации 120-5550 мкг/кг [184,185,205]. В 23 из исследованных 31 образца найдены и афлоток-сины В 1, в ряде случаев в пшенице наряду с другими токсинами выявлен и зеараленон. Авторы подчеркивают высокую частоту контаминации пшеницы [129]. В 1995 г на юго-западе США штам мы-суп ер продуценты фузариоток-синов составляли 30 % от всех изученных и были способны накапливаться до 10 мг/кг, а Ф-2 - до 15 мг/кг в зерне пшеницы и кукурузы [187]. Сильная эпифитотжя ФК на яровой пшенице отмечена в 1993 г. В штатах Северная Дакота и Миннесота было поражено до 75 % всего урожая и были обнаружены партии зерна, содержащего Д(Ж до 43 мг/кг. С 1980 по 1985 гг. быстро нарастало поражение ФК кукурузы в кукурузном поясе. Основным возбудителем болезни являлся F.graminearum, штаммы которого были способны образовывать ДОН и Ф-2 до 40 мг/кг зерна [188]. С 1993 по 1997 гг. токсино-генность штаммов не снижалась.
В последние 5 лет нарастает поражение посевов злаковых культур видами фузариев, образующих фумонизииы. В среднем, ежегодно США несут потери в размере 1 млрд. долл. в результате поражения злаковых культур ФК и загрязнения зерна фузариотоксинами (ФТ) [39,41,44]. Важно отметить, что США экспортирует зерно, зараженное ФТ. Фузариотоксины часто обнару живаются в зерне, импортируемом из США. Так фумонизины в концентрации выше 1 мг/кг зерна постоянно обнаруживаются в импортируемой из США в страны ЕС пищевой кукурузе [49].
Сходная с США фитосанитарыая обстановка наблюдается в Канаде. Здесь ФК регулярно отмечается с 1927 г. Особенно значительными были в 1940, 1942, 1945, 1957, 1967 и 1980 гг. На посевах пшеницы доминируют виды F.grarainearam, F.culra.orum, F.avenaceum, F.nivale; на кукурузе -F.verticiilioides и F.tricinctum [109,188]. В годы эпифитотий до 60 % зерна поражается фузариозом. В образцах товарного зерна обнаруживался ДОН в концентрации до 30 мг/кг в пшенице и до 40 мг/кг Ф-2 в зерне кукурузы [109]. Анализ 1593 образцов в период с 1985 г. по 1986 г. кормов выявил в 7% образцов зеараленон в концентрации от 1 до 20 мг/кг. Исследование в этот же период 1125 образцов зерновых на содержание ДОН выявило в 80% образцов содержание ДОН в количестве от 0,5 до 64 мг/кг (средний уровень загрязнения - 6 мг/кг). Кукуруза составляла 56% всех изученных образцов зерновых [132]. Проверка токсиногенности штаммов F.graminearam, F.verticiilioides и др., изолированных с растений в поле, при искусственном заражении зерна пшеницы и риса обнаружили способность образовывать ДОН до 125 мг/кг, а Ф-2 до 2050 мг/кг [187]. Высокая степень пораженности посевов злаковых культур ФК и загрязненности зерна ФТ регулярно отмечаются в странах Латинской Америки, в Индии и многих тропических странах [49,166].
Сильно поражаются ФК посевы злаковых культур в европейских странах. Преобладающими видами являются F.graminearam, F.culmorum, F.verticiilioides, F.avenaceum и F.poae. В годы эпифитотий поражаются болезнью: в Германии - 20% посевов зерновых культур, В Италии - 14 % пшеницы и 100 % кукурузы, в Югославии - 28 % пшеницы, во Франции - 16 % пшеницы и 95 % кукурузы, в Югославии - до 50 % посевов кукурузы [109]. В годы эпифитотий - 1974/1975 и 1978/1979 гг. в хранящемся зерне во многих районах Югославии содержание Ф-2 достигало 276 мг/кг [71,90].
Методика лабораторных исследований
Для искусственного заражения зерна изучаемых сортов и гибридов с/х культур штаммы F.graminearum и F.verticillioides культивировали на агари-зованной среде Чапека. Затем кусочки агара (1см ) с 7-дневным хорошо развитым мицелием каждого отдельного штамма вносили в колбы со стерильным автоклавированным или продезинфицированным раствором марганца жизнеспособным зерном (по 0,5 кг каждого сорта) и инкубировали в течение 28 суток при температуре 27 С. В период всего времени проведения опыта -один календарный год, ежемесячно образцы зерна каждого сорта одновре менно заражали каждым из данных видов грибов. В конце инкубации (28 дней) зарастание мицелием зерна каждого сорта было не менее 95%. По истечении периода инкубации зерно подсушивали до постоянного веса и анализировали содержание в нем дезоксияиваленола (ДОН), диацетоксискирпе-нола (ДАС) и зеараленона (Ф-2) юстированными методами [8,30]. Каждый опыт проводился в 4-кратной повторности в период 2003-2005 гг.
При изучении влияния обработки растворами дезоксинивалеиола и зеараленона зерна районированных высокопродуктивных сортов пшеницы на развитие проростков использовали следующую методику. На зерне районированных сортов пшеницы Даха, Дельта, Краснодарская 99, Купава, Ника Кубани, Победа 50, Уманка испытывали следующие концентрации токсинов в питательном растворе Кнопа: ДОН - 1 и 5 ПДК (0,7 и 3,5 мг/л); зеараленон- 1 и 0,5 ПДК (1 и 0.5 мг/л). В каждом варианте было по 100 зерен каждого сорта. Зерно в чашках Петри замачивали в растворе исследуемой концентрации токсина до четко проявляющегося наклевывания и высевали в вазоны, наполненные простерилизованным песком. В одном варианте проростки поливали обычным раствором Кнопа, в другом - раствором Кнопа с токсином. В контроле зерно замачивали до наклевывания, и при проращивании в вазонах поливали только обычным раствором Кнопа. Проращивание в вазонах вели в течение 7 сут. Затем проростки, не повреждая, вынимали из вазонов, отмывали водопроводной водой и измеряли длину самого длинного корешка и стебля. Полученные результаты математически обработаны методом дисперсионного анализа
При изучении влияния растворов микотоксинов ДОН и Ф-2 на хранящееся зерно пользовались следующим методом. Были отобраны два сорта яровой пшеницы: Саратовская 6 и Безенчукская 87 и четыре сорта озимой пшеницы: Купава, Батько, Мироновская 808 и Заря. Здоровое зерно в количестве 500 г каждого сорта замачивали на 40 мин в водном растворе ДОН или Ф-2 в концентрации ШДК (1 и 0,7 мг/л) соответственно. Затем зерно быстро высушивали при интенсивном воздухообмене и t +20 С, ссыпали в бумажные пакеты, которые складывали в металлические ящики для защиты от вредителей и грызунов. Ящики помещали в специальную темную комнату и хранили при температуре +(20+2) С. Зерно сортов яровой пшеницы хранили два месяца, а зерно сортов озимой пшеницы хранили шесть месяцев.
Отобранную пробу измельчают в течение 1-2 мин в лабораторной мельнице или кофемолке. Навеску 25 г измельченного зерна или муки помещают в плоскодонную колбу на 250 мл, добавляют 20 мл воды и затем 105 мл ацетонитрила. Встряхивают на аппарате в течение 30 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный фильтр в мерный цилиндр. Далее необходимо отобрать 25 мл фильтрата на ДОН, ДАС и 50 мл на Ф-2.
Дезоксиниваленол и диацетоксискирпенол
В стеклянную хроматографическую колонку на дно помещают кусочек ваты, насыпают 0,75 г оксида алюминия, сверху - 0,75 г порошка активированного угля, затем - кусочек ваты. Помещают в колонку 25 мл экстракта. Когда экстракт пройдет через колонку и не давая ваткам просохнуть, добавить 10 мл смеси ацетонитрил-вода (84:16). Фильтр (можно использовать вату) промывают 5-10 мл изопропилового спирта и выпаривают на ротационном испарителе при t-80C до объема 5-7 мл, затем снова добавляют 20 мл изопропилового спирта и выпаривают досуха (не должно быть капелек воды). Остаток растворить в 500 мкл смеси бензол-ацетонитрил (5:1) - рабочий раствор. Пластинку размечают тонкими карандашными линиями, не повреждая слоя силикагеля. В правом нижнем углу на расстоянии 1,5 см от краев пластинки наносят с помощью микрошприца 10 мкл рабочего раствора. В правом верхнем и нижнем левом углах пластинки наносят 10 и 5,10,15 мкл стандартного раствора дезоксиниваленола или диацетоксискирпенола соот ветственно. Затем пластинки помещают в камеру для ТСХ и развивают в первом направлении в системе бензол-ацетон (1:1) не доходя до верхней карандашной линии, пластинку извлекают, сушат на воздухе 1-2 минуты, (1 направление), после помещают в другую камеру для ТСХ и развивают во втором направлении в системе хлороформ:ацетон:изопропиловый спирт (78:22:10) также не доходя до линии, затем сушат на воздухе в течение 3-4 минут, опрыскивают раствором А12С13 и помещают в сушильный шкаф на 7 минут при температуре ПО С. После пластинки просматривают в длинноволновом УФ-свете (при длине волны 254 нм). Пятна стандартов дезоксини-валенола и диацетоксискирпенола флуоресцируют в этих условиях синим цветом. Обнаружение на пластинке пятна, соответствующего по цвету флуоресценции и хроматографической подвижности (Rj) 0,4-0,5 пятнам стандартов дезоксиниваленола и диацетоксискирпенола фирмы «Сигма», подтверждает наличие зеараленона в образцах.
Изменчивость токсинообразования Fusarium graminearum и Fusarium verticillioides на жизнеспособном стерильном зерне в зависимости от сорта, сезона года и вида фузария
В этих исследованиях использовали аттестованные по токсиногенности чистые культуры грибов F.graminearum и F.verticillioides, выделенных с зерна пшеницы и кукурузы. Для опыта было взято 4 сорта озимой пшеницы: Зимородок, Победа 50, Краснодарская 99, Уманка. Заражение проводили на неав-токлавированном зерне, но продезинфицированном раствором марганца и промытым дистиллированной водой. Результаты опыта приведены в таблицах 6 и 7. Специальные проверочные опыты показали, что у такого зерна не обнаруживалось поверхностное и внутрисемейное заражение.
Установлено, что при заражении зерна пшеницы исследуемых сортов F.graminearum накопление у них токсина ДОН было различно. Для всех сортов существуют месяцы пиков накопления токсина и месяцы, когда концентрация ДОН падает. Пики накопления токсина: июнь-июль (кроме сорта Победа 50), а таюке ноябрь. В эти месяцы концентрация ДОН увеличивается у всех сортов. Месяцы, когда происходит наименьшее накопление токсинов: май (кроме сорта Зимородок), октябрь и декабрь (кроме сорта Победа 50).
При заражении зерна пшеницы исследуемых сортов F.verticillioides концентрация ДАС в зерне также была различна. Здесь также можно выделить месяцы понижения концентрации ДАС и месяцы, когда концентрация токсина увеличивается у всех сортов. Пики накопления токсина: июнь-июль, август-сентябрь (кроме сорта Краснодарская 99) и ноябрь. Стоит отметить, что июнь и ноябрь, являются общими пиками накопления токсина ДОН и ДАС в зерне, как при заражении его F.graminearum так и при заражении его F.verticillioides. Что касается периода, когда концентрация токсина в зерне исследуемых сортов падает, то это происходит в апреле, мае, октябре (кроме сорта Краснодарская 99) и декабре. Уменьшение концентрации токсина ДАС в зерне, зараженного F.verticillioides, в месяцы май, октябрь и декабрь совпа дают с уменьшением концентрации токсина ДОН, при заражении F.graminearum.
Анализируя выше сказанное, можно сделать выводы: существуют общие месяцы пиков накопления токсина ДОН и ДАС и месяцы уменьшения концентрации токсинов у этих двух видов грибов. Определяя, каким видом фу-зария заражено зерно озимой пшеницы, мы можем прогнозировать сезоны накопления токсинов ДОН и ДАС и понижения их концентрации, что имеет важное значение в планировании потребительского использования зерна.
Анализируя данные при заражении зерна разных сортов F.graminearum, мы также выявили различия содержания токсина Ф-2 в исследуемых сортах в зависимости от сезона заражения. С февраля по июль у всех сортов концентрация токсина не превышает 1 ПДК. Надо отметить, что в марте, сентябре и в ноябре (кроме сорта Победа 50) концентрация токсина в зерне падает у всех исследуемых сортов. Август, октябрь и декабрь (кроме сорта Победа 50) - это месяцы, когда происходит накопление токсина. Наглядно это демонстрируется на рисунке 7.
При инокуляции F.verticiUioides зерна пшеницы разных сортов, накопление в нем Ф-2 было также различным. В мае (кроме сорта Краснодарская 99), июле (кроме сорта Уманка) и в сентябре концентрация токсина уменьшалась в зерне всех сортов. Сентябрь является общим месяцем понижения концентрации токсина в зерне, зараженного как F.graminearura, так и F.verticiUioides. На июнь (кроме сорта Краснодарская 99) и август приходятся общие пики увеличения концентрации токсина в зерне, как при заражении F.graminearum, так и F.verticiUioides.
Результаты анализа представлены в сравнительных таблицах 8,9,10,11. Обнаружены общие тенденции у всех сортов, кроме сорта Победа 50, который оказался более устойчивым.
При заражении зерна F.graminearum накопление токсина ДОН по месяцем было следующим. В жизнеспособном зерне в декабре, январе, феврале, апреле, мае, июне токсина накапливалось меньше по сравнению с автоклави-рованным зерном исследованных сортов озимой пшеницы. В августе и ноябре больше, а в остальные месяцы примерно одинаково.
При заражении зерна F.verticiUioides накопление токсина ДАС по месяцам было следующим. В жизнеспособном зерне, в период с января по май, токсина накапливалось меньше по сравнению с автоклавированным зерном. Остальные месяцы в жизнеспособном зерне пшеницы токсина ДАС накапливалось больше или одинаково. Из анализа полученных данных можно сделать следующие выводы:
1. Жизнеспособное зерно ингибирует накопление токсинов ДОС и ДАС при заражении обоими видами фузариев с декабря по май, т.е. в этот период зерно сохраняет свои посевные качества, зерно к этому времени дос певает и механизмы защиты от поражения токсинообразующими грибами и накопления в зерне микотоксинов находятся в активном состоянии. Именно в этот период жизнеспособное зерно наиболее сильно сопротивляется инфекции.
2. С июля по ноябрь зерно еще не достигло стадии полной спелости и механизмы борьбы полностью не сформированы. В этот период зерно находится в наиболее уязвимом состоянии для поражения его патогенном.
3. Автоклавированное зерно не проявляет эти закономерности, но позволяет выявить пики токсинообразования для изучаемых видов грибов -это месяцы декабрь, январь и февраль.
При заражении зерна F.graminearum накопление токсина Ф-2 по месяцам было следующим. В жизнеспособном зерне с декабря по март, мае, июне, августе, октябре токсина накапливалось больше, чем в автоклавирован-ном зерне. Здесь мы не наблюдаем четко выраженных механизмов защиты жизнеспособного зерна при поражении этим видом гриба, а также от накопления токсина Ф-2. Возможно, это свидетельствует о специфичности воздействия на жизнеспособное зерно зеараленона, подавляющего способность зерна ингибировать накопление токсина.
При заражении зерна пшеницы F.verticillioides накопление токсина Ф-2 по месяцам было следующим. В жизнеспособном зерне с ноября по февраль токсина Ф-2 накапливается меньше, чем в автоклавированном зерне, а в остальные месяцы больше. В зимние месяцы зерно уже дозрело, и сформировались механизмы защиты от заражения Fusarium verticillioides и накопления в зерне Ф-2. Такая разница в накоплении токсина Ф-2 в жизнеспособном зерне, зараженного F.graminearum и F.verticillioides, возможно, связана с вид-специфичностью данного токсина. Защитные механизмы зерна при заражении его F.verticillioides и накопления в нем токсина Ф-2 проявляются активнее.
Способность зерна кукурузы к токсинонакоплению при искусственном заражении грибами F.grammearum и F.verticillioides
В настоящее время микотоксины являются основными загрязнителями зерна. Во всех зерносеющих районах страны более 10 % исследованных партий семенного зерна содержит фузариотоксины. У семян пшеницы с внутренней фузариозной инфекцией и содержащих дезоксиниваленол на уровне ПДК всхожесть на 35 % ниже, чем у непораженных, и проростки развиваются значительно медленнее, при этом продуктивность взрослых растений на 20-25 % ниже здоровых. Содержащиеся в зараженной токсиногенными грибами почве фузариотоксины, афлатоксины и рубротоксин ингибируют рост корня и способствуют развитию корневых гнилей. В здоровых на вид зернах, где сразу после уборки обнаружены следы зеараленона, через 10 недель после хранения при 16 С содержание токсина может увеличиваться в 132 раза, а при хранении при 12 С - в 64 раза. При посеве такое зерно резко снижает урожайность продуктивных стеблей. Особую тревогу вызывает то, что высо копродуктивные сорта могут давать хороший урожай с высокой натурой зерна, но накапливать в нем большое количество микотоксинов, в том числе ДОН. Большое количество зерна с внутрисемейной инфекцией и содержащее микотоксины попадает в семенной фонд. Это является одной из причин того, что более 40 % используемых для посева семян пшеницы не соответствует посевному стандарту [Казаков Е.Д., 1987].
Федеральные гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья, устанавливающие предельно допустимые нормы содержания микотоксинов в зерне пшеницы, не учитывают их возможного влияния на посевные качества зерна. Не учитывается содержание микотоксинов в зерне и в ГОСТ 12044-93 [86] и новые технологические регламенты на зерно. Таким образом, решение проблемы имеет и большое селекционно-производственное значение, поскольку микотоксины, обладая высокой общей токсичностью и гентоксичностью, могут разрушать зародышевую плазму высокопродуктивных сортов.
В связи со сказанным нами была поставлена цель исследовать влияние обработки зерна растворами чистых микотоксинов ДОН и Ф-2 на развитие проростков. Растворы чистых микотоксинов позволяют избежать синергити-ческого влияния других метаболитов, что наблюдается при изучении воздействия культуральных жидкостей разных по токсиногенности штаммов грибов на зерно, Раннее проведенные исследования влияния культуральных жидкостей разных по токсиногенности штаммов показали их высокую токсичность при воздействии на зерно пшеницы. Влияние обработки зерна и проростков ДОН отражено в таблице 17.
Наиболее сильное влияние токсин оказывает на рост корней, особенно при поливе проростков растворами токсина. С увеличением концентрации токсина увеличивается его фитотоксическое действие. При обработке растворами ДОН зарегистрировано достоверное уменьшение длины корней но сравнению с контролем (Р 0,95) во всех вариантах обработки зерна и проростков токсином, кроме сортов Купава, Ника Кубани и Даха при замачивание и поливе раствором токсина 5ПДК. Между вариантами обработки растворами токсина в концентрации І и 5 ПДК различия достоверны по всем сортам.
Уменьшение длины проростков при обработке растворами ДОН по сравнению с контролем достоверно зарегистрировано у сортов Купава, Ника Кубани. У сортов Даха и Дельта уменьшение длины проростков по сравнению с контролем отмечалось во всех вариантах обработки, кроме вариантов замачивание зерна в растворе токсина и поливе раствором токсина проростков 5 ПДК. Между вариантами обработки зерна растворами токсина в концентрации 1 и 5 ПДК достоверных различий не выявлено. Наиболее чувствительным к действию токсина был сорт Дельта. При испытании зеараленона получены следующие результаты (таблица 18).
Зеараленон в испытанных концентрациях только при поливе проростков достоверно снижал длину корня по сравнению с контролем. При повышении в растворах концентрации токсина с 0,5 ПДК до 1 ПДК, отмечалось достоверное уменьшение длины корня. Наиболее восприимчивым к обработке токсином был сорт Краснодарская 99. Достоверность разницы в длине проростков не выявлена, как по сравнению с контролем, так и между вариантами [36]. по сравнению с контролем на 22 %, стебля - на 19 %. При концентрации 5 ПДК - соответственно, на 51% и 20 %. ДОН, как наиболее распространенный контаминант зерна злаковых культур, в процессе эволюции видов фузариев в агроценозах стал фактором их патогенности. Воздействуя на многие процессы метаболизма тканей, он обеспечивает более интенсивное развитие и размножение гриба на растении. Фузариотоксин зеараленон обладал слабым фитотоксиче-ским действием, но по сравнению с другим испытанным токсином, он на 50 % сокращал сроки прорастания зерна.
