Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Берёза - источник лекарственного сырья 13
1.2. Биологически активные вещества берёзы, определяющие её лечебные свойства 16
1.3. Биологические свойства бетулина 22
Глава 2. Материалы и методы исследований 32
2.1. Объект исследования и изучаемые вещества 32
2.2. Объём выполненных исследований 32
2.3. Моделирование экспериментального гепатита 33
2.4. Методы и показатели биохимических исследований 34
2.5. Изучение функционального состояния печени 35
2.6. Морфогистохимические исследования 35
2.7. Исследование желчегонной активности 36
2.8. Изучение микросомальных ферментов печени 37
2.9. Статистическая обработка полученных данных 37
Глава 3. Результаты исследований 38
3.1. Влияние бетулина на течение острого гепатита при токсическом повреждении печени парацетамолом 38
3.1.1. Влияние бетулина на биохимические показатели 38
3.1.2. Влияние бетулина на морфофункционалыюе состояние печени 43
3.2. Влияние бетулина на течение острого гепатита при токсическом повреждении печени четыреххлористым углеродом 48
3.2.1. Влияние бетулина на биохимические показатели 48
3.2.2. Влияние бетулина на активность антиоксидантной системы 50
3.2.3. Влияние бетулина на экскреторную функцию печени 54
3.2.4. Влияние бетулина на состояние микросомальных ферментов печени при интоксикации ССЦ 55
3.3. Влияние бетулина на течение острого гепатита при токсическом повреждении печени этиловым спиртом 57
3.3.1. Влияние бетулина на биохимические показатели 58
3.3.2. Влияние бетулина на течение мезенхимально-воспалительного синдрома 59
3.3.3. Влияние бетулина на развитие холестатического синдрома при экспериментальном этаноловом гепатите 59
3.3.4. Влияние бетулина на морфофункциональное состояние печени 60
3.4. Влияние бетулина на течение гепатита, вызванного D-галактозамином 62
3.5. Влияние бетулина на процессы желчеобразования при токсическом поражении печени 65
3.6. Изучение безвредности и безопасности 70
3.6.1. Острая токсичность бетулина 71
3.6.2. Хроническая токсичность бетулина 72
Глава 4. Обсуждение результатов 74
Выводы 84
Практические рекомендации 85
Список литературы 86
Приложения 103
- Биологически активные вещества берёзы, определяющие её лечебные свойства
- Влияние бетулина на морфофункционалыюе состояние печени
- Влияние бетулина на течение острого гепатита при токсическом повреждении печени этиловым спиртом
- Влияние бетулина на процессы желчеобразования при токсическом поражении печени
Введение к работе
Актуальность исследования
В последнее время хронические заболевания печени занимают существенное место среди причин смертности и нетрудоспособности (Соринсон С.Н., 1998). Более того, отмечается тенденция роста числа больных с хроническими поражениями печени, которые распространены преимущественно у лиц работоспособного возраста (Подымова С.Д., 1993). Это обусловлено тем, что условия существования современного человека характеризуются наличием в окружающей среде большого числа химических соединений, вызывающих изменения биологических процессов в печени и приводящих к её токсическому поражению.
Круг веществ, проявляющих гепатозащитные свойства, достаточно велик, однако, в соответствии с современной классификацией лекарственных веществ, из их числа выделяют небольшую группу гепатопротекторов, оказывающих избирательное терапевтическое действие на печень. К ним относятся растительные полифенольные антиоксиданты (легалон, силибор, катерген, валилив), фосфолипидный препарат эссенциале, который проявляет иммуномоделирующие эффекты в условиях острой гепатопатии (Конопля Н.А., 2000). Терапевтическая активность названных препаратов не всегда оказывается достаточной. Большинство из применяемых гепатопротекторов являются импортными, что побуждает к поиску новых эффективных отечественных гепатозащитных средств. Особенно велика потребность в гепатозащитных средствах при терапии заболеваний печени токсической этиологии. Гепатотропные токсиканты широко используются в промышленности, сельском хозяйстве, в быту (алкоголь, лекарственные средства и др.) (Bonkovsky H.L. et al., 1996). По данным комитета
здравоохранения С-Петербурга (2003) болезни печени с 1997г. возросли в 2,1 раза.
Известно, что в окружающей среде присутствует около 80 000 гепатотоксических ксенобиотиков с которыми человек контактирует в течение своей жизни. В 30% случаев острых отравлений возникают клинические проявления химического поражения печени, у 7% людей, получивших лекарственные препараты, развивается медикаментозное поражение этого органа (Арчаков А.И., Корузина Н.И., 1988).
Общим для всех форм токсических поражений печени является усиление свободно радикальных процессов и перекисного окисления липидов (ПОЛ), нарушение структуры мембран гспатоцитов и повышение их проницаемости (Костин СВ., 2000).
Поэтому изучение и выявление биологически активных веществ, способных блокировать патологические процессы в печени, является весьма актуальной проблемой.
Исторически в народной медицине широко используются экстракты (как водные, так и спиртовые) различных частей березы (почки, листья, кора), в том числе и для лечения заболеваний органов пищеварения, мочевыделительной системы. Настои и отвары почек и листьев березы известны своими противовоспалительными и ранозоживляющими свойствами при хронических формах экземы, лечении ран, эрозий, пролежней. Эффективными они считаются и при желтухах. Рекомендации по их применению дают не только народные травники, но и официальные медицинские издания («Русская медицинская газета», 1834г.). Береста наряду с листом подорожника использовалась в качестве раневых пластырей. В годы Великой Отечественной войны березовая кора использовалась в пищу как в виде отваров, так и в виде добавок бересты в хлеб.
В задачу нашего исследования входило изучение гепатозащитного действия бетулина - это тривиальное название (Мэзон, 1831) непредельного
пентациклического тритерпенового спирта лупанового ряда бетулина -С30Н50О2 или луп-20(29)-ен-3 Р, 28-диола. Бетулин получают экстракцией органическим растворителем наружного слоя коры - бересты наиболее распространенных в России видов берёзы (Betula pubescens, Betula pendula). В бересте бетулин является основным экстрактивным веществом (около 70% по массе) и обеспечивает ее белый цвет.
Цель исследования
Экспериментальное изучение гепатопротекторных и желчегонных свойств бетулина.
Задачи исследования:
Изучить защитное действие бетулина при токсическом поражении печени четырёххлористым углеродом.
Изучить гепатопротекторное действие бетулина при токсическом поражении печени парацетамолом.
Изучить гепатопротекторное действие бетулина при токсическом поражении печени этанолом.
Изучить гепатозащитное действие бетулина при D-галактозаминовом гепатите.
Изучить репаративные свойства печени, её функциональное состояние и биохимические показатели крови в условиях воздействия бетулина при токсическом поражении печени.
Изучить влияние бетулина на процессы желчеобразования и желчевыделения при токсическом поражении печени.
Научная новизна работы
В работе получены новые данные о гепатопротекторном действии бетулина в условиях экспериментальной модели гепатита, вызванного ССЦ, парацетамолом, этанолом и галактозамином.
Показано, что гепатозащитное действие бетулина связано с нормализующим влиянием на индикаторные ферменты печени (АлАТ, АсАТ), предупреждением выраженности воспалительных процессов в печени, уменьшением показателей холестатического синдрома.
Установлено дозозависимое влияние бетулина на процессы регенерации в печени в условиях токсического ее поражения. Выявлена роль бетулина в реализации антиоксидантных и гепатопротекторных эффектов.
Бетулин восстанавливал секрецию желчи и концентрацию в ней желчных кислот, холестерина, билирубинов и фосфолипидов, восстанавливал процессы гидроксилирования желчных кислот и нормализовывал соотношение три- и дигидроксихолановых кислот.
Научно-практическая значимость
Полученные данные имеют важное научно-практическое значение, поскольку выявленные и изученные гепатозащитные свойства бетулина, представляют его перспективную значимость в качестве нового гепатопротекторного средства.
Установлены выраженные дозозависимые эффекты бетулина на процессы перекисного окисления липидов и физиологической регенерации гепатоцитов в условиях токсического поражения печени.
Экспериментально обоснована возможность использования в практике гепатологии нового гепатопротектора. Материалы по препарату представлены в ФК МЗ РФ с целью получения разрешения на его клинические испытания в качестве гепатопротектора в комплексной терапии гепатитов и гепатозов.
Полученные в работе результаты значительно расширяют представления о спектре биологической активности и возможных механизмах действия бетулина, что позволяет дать теоретическое обоснование его использования в клинической практике.
Получены Регистрационные удостоверения:
№ 004726.Р.643.09.2002. «Берёзовый экстракт сухой - С» - сырье для производства биологически активных добавок к пище (16.09.2002г.).
№ 004820.Р.643.09.2002. «Биологически активная добавка к пище «Бетула - Дэ-токс»».( 16.09.2002г.).
№004823.Р.643.09.2002. «Биологически активная добавка к пище «Берёзовый экстракт сухой»». (16.09.2002г.).
Санитарно-гигиеническое заключение МЗ РФ № 77.99.20.937.Б. 000542.04.04. от 13.04.2004г. на биологически активную добавку к пище «Алкощит».
Основные положения, выносимые на защиту
1. Бетулин в дозах 1-10 мг/кг оказывает выраженное
гепатопротекторное действие на моделях токсического поражения печени
ССЦ, парацетамолом, этанолом и при D-галактозаминовом гепатите.
2. Бетулин оказывает нормализующее влияние на биохимические
показатели крови, отражающие метаболизм и функцию печени.
Бетулин предупреждает выраженность воспалительных процессов в печени и показатели холестатического синдрома при экспериментальном гепатите.
Наиболее выраженный гепатопротекторный эффект по результатам гистоморфологического исследования бетулин проявляет в дозе 1 мг/кг.
Бетулин устраняет депрессию желчеобразования и восстанавливает секрецию желчи до уровня нормальных величин при введении парацетамола.
Внедрение в практику результатов исследования
Полученные результаты исследований используются в учебном процессе при преподавании физиологии, фармакологии и терапии для студентов, интернов, клинических ординаторов в СПбГМА им. И.И. Мечникова. Биологически активная пищевая добавка «Берёзовый экстракт сухой», содержащая бетулин, проходит апробацию на отделениях гастроэнтерологии, гепатологии клинической больницы Петра Великого, Св. преподобномученницы Елизаветы, городской инфекционной больницы им. П.И.Боткина, городском противотуберкулёзном диспансере. Результаты исследования специфической активности бетулина, его безвредности и безопасности легли в основу документов, - направленных в Фармакологический Комитет МЗ России для получения разрешения на клинические испытания.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены на 2'м Всероссийском съезде фармакологов (Москва, 2003), X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003), научно-практической конференции аспирантов и молодых учёных СПбГМА (СПб, 2004).
Основные положения диссертации изложены в 7 научных работах местной и центральной печати, в т.ч. 4 статьях.
Структура и объём диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, включающих 5 разделов, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы.
Работа изложена на 107 страницах машинописного текста (в т.ч. приложения на 6 листах), иллюстрирована 6 рисунками и 16 таблицами.
Библиографический указатель содержит 154 наименования, в том числе - 53 иностранных.
Биологически активные вещества берёзы, определяющие её лечебные свойства
Береза — источник получения активированного березового угля, незаменимого средства при метеоризме, колитах, повышенной кислотности желудочного сока.
Большой интерес для современной медицины представляет собой и берёзовый гриб чага - крупные округлой формы наросты на берёзах. Препараты чаги (настой и густой экстракт) используют в качестве симптоматического средства при опухолях различной локализации, как общеукрепляющее средство и при анацидных гастритах (Булатов Н.И., Березина М.Н., 1959; Пашинский В.Г. и др., 1996, Галаненко Е.В., Рыжова Г.Л. и др., 1997; Пашинский В.Г, и др., 1998; Айнабекова Б.А., 2001).
Экстракт чаги применяют в комплексном лечении язвенной болезни желудка (Перегонцева С.А., 2000). На основе березового гриба чаги получен препарат бефунпш, широко применяемый в гастроэнтерологии при хронических гастритах, дискинезиях желудочно-кишечного тракта с явлениями атонии и язвенной болезни желудка (Рычагов Г.П., Федотов А.А., 1973).
Интересно, что в чаге ни алкалоидов, ни гликозидов не выявлено. Предполагают, что активностью обладает водорастворимая пигментная фракция, где установлено наличие хромогенного полифенолкарбонового комплекса. Кроме того, чага богата марганцем, который участвует в лечебном действии за счёт активации энзимов. В чаге имеется также смола, агарициновая кислота, гуминоподобная чаговая кислота (60%), щавелевая кислота, полисахариды, стероидные и птериновые соединения. Предполагают, что положительное действие препаратов берёзового гриба при опухолевом процессе связано с содержанием в нём птеринов (Булатов Н.И., Березина М.К., 1959 г.).
В настоящее время в медицине активизировалась работа по изучению биологической активности веществ, выделенных из коры березы. На Руси пользовались корой березы в быту для изготовления обуви (лаптей), туесов для хранения скоропортящихся ягод и др. продуктов; оберегов, которым придавали магическое значение, связанное со здоровьем.
Кору березы в народной медицине (отвары и настои) используют в качестве ранозаживляющего и дезинфицирующего средства для лечения гнойных ран и грибковых заболеваний. Она широко применяется в Якутии для лечения абсцессов, водянки, подагре, а нанайцы применяют внутрь при туберкулезе и болезнях желудка. Известно также применение коры березы в китайской и тибетской медицине в качестве жаропонижающего и антисептического средства. Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о широком применении различных частей берёзы в народной медицине.
Широкое применение в народной медицине различных частей берёзы и извлечений из них послужило предпосылкой для научного обоснования клинического применения этого сырья при различных заболеваниях. (Беньдюкова В.А. и соавт., 1997).
Интерес к применению препаратов, полученных из лекарственных растений для лечения и профилактических целей, обосновывается высокой эффективностыо и возможностью использования их в течение продолжительного времени без возникновения осложнений и побочных явлений. Фармакологическая активность извлечений из различных частей берёзы указывает на наличие в них биологически активных соединений. Наибольший интерес для медицины в настоящее время вызывает кора березы.
Березовая кора - многотоннажный отход процесса переработки березы. Содержание коры составляет примерно 12,5% от массы древесины (Мутовкина М.Г. и др., 1980, Веселое А.А., 1987). На долю наружного слоя коры бересты приходится около 20% от ее массы (Павлова Т.А. и др., 1977). Береста имеет необычный состав, она содержит до 50% «экстрактивных» веществ, извлекаемых органическими растворителями и щелочами и представляет большой потенциальный интерес для химической переработки не только для получения новых, (например - поверхностно активных, пленкообразующих, полимерных и др.) продуктов, но и биологически активных лекарственных веществ. Поэтому, учитывая доступность и потенциальную ценность бересты для химической переработки, целесообразно проанализировать имеющиеся многочисленные литературные данные о некоторых химических продуктах, получаемых из нее, их составе, свойствах и возможности применения в медицине.
Началом исследований биологически активных соединений из коры березы, послужило исследование ЛовицаТ.Е., который в 1788 г. из березовой коры путем сублимации выделил соединение, названное Мэзоном в 1831 г. бетулином (от лат. Betula - береза). В дальнейшем бетулин стали выделять экстракцией органическими растворителями и последующей перекристаллизацией экстрактивных веществ, называя бетулином как экстрактивные вещества, так и индивидуальный тритерпеновый спирт. Что касается тритерпенового спирта, то в литературе употребляются названия «бетулин», «бетуленол», «бетулинол», «березовая камфора».
Выделение бетулина и бетулиновой кислоты описаны многими исследователями (см. табл. 1.). Следует заметить, что выделением бетулина и бетулиновой кислоты занимаются учёные многих стран и, по-видимому, мы будем в будущем иметь новую группу фармакологических препаратов с широким спектром биологической активности.
Влияние бетулина на морфофункционалыюе состояние печени
Таким образом, накопленные данные к настоящему времени позволили идентифицировать бетулин, бетулиновую кислоту и, возможно, другие его производные как новый класс потенциально селективных ингибиторов ВИЧ-1 (Evcrs М., Poujade С, 1996).
При изучении экстракта коры березы было выявлено и его противовоспалительное действие. Так, Рапп О.А. и Пашинский В.Г.(1994), на модели каррагепипового воспаления и «ватной гранулемы» в экспериментах на животных показали противовоспалительный эффект экстракта березы в сочетании с антиэксудативным эффектом и угнетением пролиферации. Recio М.С. et al., (1995) показали, что бетулин и бетулиновая кислота проявили противовоспалительную активность на модели каррагепипового и серотонинового отёка лапки и уха животных. Причем, при сочетанием применении с глюкокортикоидами бетулиновая кислота была более эффективна, чем бетулин.
Manez S. et al.(1997) показали высокую эффективность природных тритерпенов при хроническом воспалении кожи. Изучая механизм противовоспалительного действия бетулиновой кислоты, выделенной из коры Alphitonia zizyphoides Dungtan С. et al.(1998) доказали, что бетулиновая кислота угнетает синтез простогландинов подобно ацетилсалициловой кислоте. Позже Ко Н.Н. et al.(1999), Bernard P. et al.(2001) установили, что бетулин и бетулиновая кислота проявляют противовоспалительное действие через угнетение фосфолипазы Аг.
Рядом авторов (Карачурина Л.Т. и соавт., 2002) были выявлены не только противовоспалительные, но и противоязвенные свойства производного бетулина — бисгемифталата бетулина. Установлено, что бисгемифталат бетулина оказывает защитное действие (уменьшал число деструкции слизистой оболочки желудка) на модели язв, вызванных ацетилсалициловой кислотой, эффективно предотвращает образование геморрагии на этаноловой модели поражения желудка, хотя на индометациновой модели это соединение оказалось неэффективным. На моделях хронических язв, вызванных этанолом или криогенным воздействием, многократное введение бисгемифталата бетулина приводило к достоверному уменьшению площади язвенного дефекта. Показано также, что это соединение оказывало противовоспалительное действие на моделях воспаления, вызванных субплантрным введением каррагенина и формалина.
Исследованиями Барнаулова О.Д.(1986) было выявлено сочетанное гастропротекторное н гепатопротекторное действие бетулина, подтвержденное позже Семенченко В.Ф.(1992). Vidya L., Varalakshi Р.(2000) указывают на антилитогенный эффект бетулина. Подробно гастропротекторный эффект березового экстракта изучен Рапп О.А.(1993) при острых повреждениях желудка (на моделях резерпиновых, гистаминовых, субхронических бутадиеновых, ацетилсалициловых и хронических ацетатных язвах). По результатам их работы был показан высокий гастропротекторный эффект экстракта березы, сравнимый с препаратами бефунгин и плантаглюцид. Положительное действие экстракта березы на поврежденный желудок, по мнению авторов, связан, как с воздействием на факторы защиты (повышение секреции слизи, изменение соотношения ее углеводных компонентов), так и ослаблением кислотно-пептического потенциала желудочного сока (сдвиг реакции среды в щелочную сторону при повышении рН желудочного сока и снижение уровня соляной кислоты). Было выяснено, что основной механизм гастропротекторного действия экстракта связан с сохранением содержания и умеренной стимуляцией синтеза РНК, кислых и нейтральных мукополисахаридов в цитоплазме покровно-ямочного эпителия желудка. Одновременно экстракт проявил спазмолитическое и анальгезирующее действия.
В последние годы появляются данные по противоопухолевой активности бетулина. Многочисленными исследованиями преимущественно зарубежных авторов доказано, что бетулин, частично - лупеол и, особенно, бетулиновая кислота обладают противоопухолевой активностью. Механизм противоопухолевой активности объясняется угнетением пролиферации гладкомышечпых клеток сосудов и апоптозом опухолевой клетки на митохондрии. Основной причиной перехода раковых клеток на аэробный гликолиз является дефицит кофермента НАД+, появляющийся на стадии трансформации клетки. Бетулин способен восстанавливать запасы кофермента НАД+ и обеспечивать образование НАДФ+ (Hata К., Hori К., Known H.J., 1999). Многие ученые исследуют бетулиновую кислоту как цитотоксический агент. Показано, что бетулиновая кислота обладает цитотоксической активностью на клетки нейроэктодермальных опухолей — нейробластому, медуллобластому, глиобластому, саркому Юинга. Она индуцирует апоптоз не зависимый от р-53 и системы cd 95, а прямо действует на митохондрии, вызывая потерю трансмембранного потенциала и продукцию активных форм кислорода. Это приводит к освобождению в цитозоль растворимых апоптогепных факторов и апоптоз индуцирующего фактора (AIF) (Fulda Simon, Jeremias Irmela, Steiner Hane, 1999). Hwang B. et al.(2003) из растений выделили 3-бета-о-(Е)ферулобетулин и показали его цитотоксичность против некоторых опухолей человека. Подобный эффект выявили Sturm S. et al.(1996) у бетулина, выделенного из Loplopetalum wallichini. Lee S.M. et al.(2002) показали, что среди тритерпенов, полученных из растений, бетулиновая кислота может играть важную роль в увеличении цитостатической активности, особенно для высокометастатической мышиной карциномы толстого кишечника 26-L5 (Bauskota А.Н. et al., 2002).
Влияние бетулина на течение острого гепатита при токсическом повреждении печени этиловым спиртом
Об уровне цитолитического синдрома судили по активности АлТ и АсТ в сыворотке крови, а также по содержанию в ткани печени малонового диальдегида, пировиноградной и молочной кислот (Владимиров Ю.А., АрчковА.И., 1972).
Интенсивность холестатического синдрома оценивали по активности щелочной фосфатазы, концентрации непрямого билирубина, холестерина и триглицеридов (Колб В.Б., Камышников B.C., 1982). Влияние бетулина на мезенхимально-воспалительный синдром изучали по уровню тимоловой пробы и весовому коэффициенту печени. Содержание цитохрома Р-450 измеряли в микросомальной фракции печени, содержащей 90-95% белка на двухлучевом спектрофотометре по величине поглощения комплекса восстановленных гемопротеинов с окисью углерода (Котеленвцев СВ. и соавт., 1986). АлТ, АсТ и щелочную фосфатазу определяли с помощью набора реактивов «Реком», «Лахема» (Bergmuer Н.Г., et. al., 1986). Тимоловую пробу определяли фотоэлектроколориметром (Меньшикова В.В., 1987). Уровень холестерина, триглицеридов и билирубина определяли общепринятым методом (Колб В.Б., Камышников B.C., 1982). Содержание в сыворотке крови гамма-глутамилтранспептидазы (у-ГТП), холинэстеразы (ХЭС), щелочной фосфатазы (ЩФ) и холестерина определяли на универсальном биохимическом анализаторе «Cobas Mira+» фирмы Хоффман-Ля Рош Лтд в лаборатории дорожной больницы г. С.Петербурга. Концентрацию гликогена в печени определяли по методике Kemp, Heijningen (1954) в нашей модификации (для экстракции глюкозы из печени использовали не метанол, а этиловый спирт).
На фоне парацетамолового гепатита оценку функционального состояния печени проводили с помощью гексеналовой пробы на мышах. Гексенал вводили в дозе 80 мг/кг внутрибрюшинно. На модели галактозаминового гепатита использовали тиопентал натрия, который вводили в латеральную хвостовую вену крыс в дозе 33 мг/кг. По продолжительности бокового положения оценивали скорость метаболизма барбитуратов, осуществляемой цитохромом Р-450 зависимой монооксигеназной системы гепатоцитов..
Проба с бромсульфалетюм (БСФ) свидетельствует о состоянии экскреторной и антитоксической функции печени. Содержание БСФ в крови крыс определяли спектрофотометрически через 1, 5, 15 и 45 мин после введения красителя (1-5мг/кг) в хвостовую вену крыс. Вычисляли коэффициент ретенции БСФ, элеминируемого в виде конъюгатов с цистеином и глутамином (Тугаринова В.Н., Маклашевский В.Е., 1966).
Данная проба характеризует степень выраженности воспалительных процессов печени. Весовой коэффициент печени рассчитывается, как отношение массы печени в мг к массе тела в граммах и проанализирован у животных с этаноловым гепатитом.
Для морфологического исследования печени крыс материал фиксировали в течение 10 час в 10% растворе формалина. Затем взятые кусочки печени обезжиривали в спиртах нарастающей концентрации, заливали в парафин и изготавливали препараты с использованием стандартного оборудования и реактивов для парафиновой проводки. С целью изучения препараты окрашивали рутинной гистологической окраской гематоксилином и эозином. Применялось гистохимическое окрашивание Суданом III срезов, изготовленных на замораживающем микротоме, что позволяло выявить в ткани печени жир. Исследования проводили светооптическнм микроскопом БИОЛАМ при увеличении х80 в 10 полях зрения (одно поле зрения обычно содержало 4 печёночные дольки). Таким образом, расчёт поражения в процентном отношении производился исходя из этого количества долек.
Сопоставления и гистологическую оценку измерений проводили с интактной группой крыс, содержащихся в лабораторных условиях.
Поскольку гепатотоксичность парацетамола (ПЦ) обусловлена образованием реактивных метаболитов при участии системы цитохрома Р-450, инициацией ПОЛ, снижением синтетических процессов, а также нарушением процессов желчеобразования, то задачей данного исследования было изучение влияния бетулина на состояние желчеобразователыюй функции печени при парацетамоловом гепатите.
Исследования проведены на крысах - самцах массой 170-190 г. Острое лекарственное поражение печени вызывали путём введения внутрь парацетамола в дозе 0,25 на 100 г массы тела животного в виде взвеси на 1% крахмальном клейстере 1 раз в день в течение двух суток (Dixon М, F, et., 1971). Контрольные животные получали соответствующий объём 1% крахмального клейстера. Бетуленол применяли в дозе 1 мг/кг внутрь 1 раз в день профилактически в течение 10 суток до введения парацетамола.
Влияние бетулина на процессы желчеобразования при токсическом поражении печени
Гистологическая картина в группах лабораторных животных была неодинакова и выглядела следующим образом.
В группе интактных крыс печень имела нормальное гистологическое строение (рис.За). В печеночных дольках радиальное расположение балок из гепатоцитов в виде радиалыю отходящих от центральной вены к портальным трактам тяжей, гепатоциты с розовой цитоплазмой и синими ядрами, местами цитоплазма имела различную оптическую плотность, связанную со степенью накопления гликогена. Дистрофические и некротические изменения отсутствовали, наблюдалась лишь незначительная лимфоидная инфильтрация портальных трактов, которые состояли из триад, включавших в себя артерию, вену и желчный проток, окруженные незначительным количеством соединительнотканной стромы. Синусоиды в дольках не расширены, наблюдалось полнокровие центральных вен.
В группе крыс, получавших парацетомол в дозе 1000 мг/кг (рис.Зб), на фоне выраженного нарушения балочного строения на большем протяжении в печени отмечен фокальный колликвационный некроз, локализовавшийся перипорталыю и центролобулярно. Некроз гепатоцитов преобладал вокруг центральной вены, местами он был ступенчатым, в этих зонах имелась разной степени выраженности лимфогистиоцитарная инфильтрация (от умеренной до выраженной), а также слабовыраженная лейкоцитарная инфильтрация, которая локализовалась в дольке и в портальных трактах.
Особенно выраженная гистиоцитарная инфильтрация была вокруг гепатоцитов, подвергшихся некрозу. Пролиферация Купферовских клеток (гистиоцитов) имелась во всех дольках печени. При изучении срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, дистрофия в виде внутриклеточной белковой - гиалиново-капельной и гидропической (баллонной) поражала все печеночные дольки на 2/3 их площади, местами захватывала дольку тотально, локализовалась и перипортально, и центролобулярно, наблюдалась по ходу печеночных балок от портальных трактов к центру (табл. 5).
В группах крыс, получавших бетулин 5 мг/кг (рис.3в) и силибор в дозе 100 мг/кг (рис.3 г), изменения характеризовались одинаковой гистологической картиной, лишь незначительно отличавшейся по масштабу поражения. Нормальная гистиоархитектоника печени на всем протяжении утрачена. Отмечено распространенное поражение долек с дискомпенсацией их балочного строения. В гепатоцитах перипорталыю зернистая, гиалино-капельная белковая и мелкокапельная жировая дистрофия (последняя выявлялась элективным окрашиванием жира) в случае силибора и бетулина -в 10 дольках из 40 (25%) (табл. 6). Совместное поражение (белковая и жировая дистрофии) по протяженности в дольках, как видно из табл. 5, распределилось приблизительно одинаково.
Гепатоциты в центральных отделах долек с сохранением обычного гистологического строения, некрозы в печени носили характер очагового фокального в 12 дольках из 40 (30%). Воспалительная инфильтрация в портальных трактах слабо - и умерено выраженная, представлена преимущественно лимфоцитами и гистиоцитами, местами проникающими за пограничную пластинку в дольки. Таким образом, обнаруженные изменения соответствовали острому токсическому гепатиту с умеренными проявлениями воспалительных изменений.
Под влиянием бетулина в дозе 1 мг/кг наблюдались дольки , имеющие нормальное гистологическое строение. На этом фоне была выявлена дискомплексация балочного строения, что отражало проявления дистрофических изменений в виде внутриклеточной белковой дистрофии, где отмечена зернистая, гиалиново-капельная и мелкокапельная жировая. Совместные дистрофические поражения гепатоцитов по масштабу в дольках распределились так: нормальные дольки - 85%, пораженные на 1/3 - 5%, на S - 10%. Поражения на 2/3 протяженности балок не встречалось. При окраске на жиропоражение перипорталыю в 5 из 40 дольках (12,5%) в гепатоцитах мелкокапельное ожирение. Некрозы гепатоцитов отсутствовали, лимфоидная инфильтрация портальных трактов слабовыраженная. Эта гистологическая картина соответствовала минимальным воспалительным изменениями (рис. 2).
Таким образом, гистологическое строение печени крыс в экспериментальной группе с введением парацетамола характеризуется признаками наибольшего повреждения, что подтверждает соответствие модели методическим рекомендациям. Выявленные морфологические изменения гепатоцитов в группе крыс, получавших силибор, указывают на признаки острого токсического гепатита с признаками умеренного и слабовыраженного повреждения, что свидетельствует о минимальном его гепатозащитном действии.
Наименьшие проявления острого токсического гепатита отмечены в группе крыс, получавших бетулин в дозе 1 мг/кг, что указывает на его выраженный эффект в качестве гепатопротектора.
Введение четырёххлористого углерода провоцирует некроз гепатоцитов, воспалительный отёк паренхимы, мощную клеточную инфильтрацию, нарушение внутрипечёночной гемодинамики и, как следствие, холестаз. При интоксикации разрушается структура мембран, отмечается их прозрачность и снижается текучесть. Вследствие этого изменяется электрохимический потенциал мембраны, что приводит к нарушению натрийзависимых транспортных систем, таких как транспорт желчных кислот, и определяет развитие опосредованного цитолизом холестаза.
