Введение к работе
В последние годы все большее внимание уделяется транспорту ионов через биологические мембраны. Причем внимание исследователей уделяется не только трансмембранному переносу ионов в клетку, но и переносу ионов и воды по межклеточным соединениям, особенно в тканях, направленно транспортирующих натрий от одной своей поверхности к другой. Такие процессы происходят в стенке нефрона почки. Изменение межклеточной проницаемости может существенно изменить перенос ионов и молекул воды через стенку почечного канальца. Расширение межклеточных соединений приводит к уменьшению количества реарсорбированного клубочкового фильтрата. Некоторые фармакологические вещества как, например, диуретики, могут расширять межклеточные соединения и изменять тем самым функцию нефрона (А.А.Лебедев, 1989).
Процесс изучения межклеточного переноса в стенке канальца затруднен вследствие малого размера объекта, и поэтому ряд исследований предусматривает изучение на биологические моделях процесса межклеточного переноса ионов и воды. Биологическими моле\ямн стенки почечного крыльца могут быть стенка мочевого пузыря лягушки, кожа \яг\інкн. стенка желчного пузыря млекопитающих. Эти тки пи активно транспортируют ион натрия от одной своей поверхности к другой, ионы могут двигаться и через клеточные мембраны и парацеллюлярно.
Многолетние исследования кафедры фармакологии Самарского государственного медицинского университета, проведенные под руководством профессора А.А.Лебедева, были посвящены . изучению действия диуретиков на транспорт ионов через стенку почечного канальца, осуществляющих направленный транспорт ионов и воды, а также исследованию этого транспорта через стенку мочевого пузыря лягушки и кожу лягушки. Эти ткани могут считаться биологическими моделями стенки почечного канальца, т.к. процессы, протекающие во всех трех тканях идентичны, они заключаются в переносе ионов и воды не только через мембраны, но и межклеточным путем. В результате этих исследований были получены данные о влиянии диуретиков на проницаемость межклеточных соединений в тканях, осуществляющих направленный перенос ионов, к.оторые легли в основу нового представления о механизме действия диуретиков на межклеточные соединения.
Постепенно оформилась и научная гипотеза, которая последующем переросла в теорию о фиксированных воротных зарядах і межклеточных соединениях, определяющих внеклеточный транспор' ионов и селективное отношение к ионам различного заряда. Согласн< теории, межклеточные соединения проницаемы для движения ИОНОВ, НІ они не являются простыми механическими щелями, через которы< анионы и катионы проходят в одинаковом количестве. Селективності определяется фиксированными зарядами отрицательного знака находящимися на мукозной стороне стенки мочевого пузыря или ні люменальной стороне почечного канальца. Положительные зарядь находятся при входе в межклеточное соединение на базальной стороні (серозной для мочевого пузыря лягушки). Эти заряды расположены прг входе в канал межклеточного соединения, отсюда и их название -воротные заряды, которые фиксированы по всей вероятности і мембранам межклеточного соединения, возможно они представляю: собой молекулы белка, группы которого имеют или положительный ил* отрицательный заряд. Молекулы расположены при входе в канал. Рол] фиксированных воротных зарядов в канальцах почек сводится у селективной реарсорбции одних ионов в канальцах почек, наприме;: катионов, и препятствию к реарсорбции анионов. Очевидно, в почечныэ канальцах обработка фильтрата происходит, не только благодар* активному транспорту, но и селективной реарсорбции по межклеточным соединениям.
Поэтому цель нашего исследования — изучить парацеллюлярнык
транспорт ионов и роль фиксированных зарядов в воротах межклеточньн
каналов более совершенными методами исследования — представляется
актуальной. Разработанная нами методика определение
электрофоретической подвижности базальной и люменальной мембран почки является актуальной, т.к. позволяет привести доказательства существования базальных и люменальных фиксированных зарядов в везикулах мембран, выделенных из почечных канальцев.
Актуальна и задача исследования изучить влияние диуретиков на перенос ионов флуоресцеина через стенку мочевого пузыря лягушки, так как позволяет получить представление о влиянии диуретиков на межклеточный транспорт при помощи новой методики изучения проницаемости. Задача эта позволяет получить представление о механизмах действия диуретиков и подтвердить или корректировать экспериментальные данные, полученные ранее А.А.Лебедевым и В.П. Посоховым (1981), В.А.Шелеповым (1968), Т.И.Бочкаревой (1992).
Важно и актуально было изучить влияние на функцию фиксированных воротных зарядов и веществ, блокирующих отрицательные или положительно заряженные группы белковых молекул, а также веществ, связывающих ионы кальция, который играет большую роль в цементировании межклеточных соединений.
Цель работы
Изучение трансцеллюлярного переноса ионов в стенке нефрона и его фармакологическая регуляция с точки зрения теории фиксированных воротных зарядов межклеточных соединений.
Задачи исследования:
1. Изучение электрофоретической активности базальных и
люменальных мембран, выделенных из эпителия почечных канальцев с
тем, чтобы получить доказательство реальности теории воротных зарядов.
2. Выяснить роль кальция в функции межклеточных соединений
путем изучения влияния этилендиаминтетрауксусной кислоты . на
асимметрию потоков органического аниона флуоресцеина через стенку
мочевого пузыря лягушки.
3. Апробировать новую методику изучения переноса аниона
флуоресцеина в динамике по межклеточным соединениям стенки
мочевого пузыря лягушки. Выяснить возможность наблюдения
асимметрии потоков аниона флуоресцеина при помощи этой методики,
сравнит*, преимущества методики с рутинным способом изучения
функции фиксированных воротных зарядов.
4. Изучить феномен асимметрии потоков и их величину путем
динамической регистрации при действии диуретиков: фуросемида,
этакриновой кислоты, гипотиазида и нового активного в диуретическом
плане соединения под условным названием "алвизид".
5. Оценить влияние блокирования фиксированных воротных
зарядов стенки мочевого пузыря путем введения в растворы, омывающие
серозу и мукозу, отрицательно заряженных молекул гепарина и
положительно заряженных молекул протамина сульфата.
і Научная новизна и практическая значимость
Исследован механизм действия диуретиков: фуросемида этакриновой кислоты, гипотиазида на фиксированные воротные заряды межклеточных соединений, а также на проницаемость межклеточных соединений к аниону флуоресцеина при помощи оригинальной методики динамической регистрации движения флуоресцеина по градиенту концентрации через стенку мочевого пузыря лягушки. Применение этой методики позволило не только подтвердить данные ранних работ, но и
получить новые результаты, которые показали, что не только отдельные диуретики, но все исследованные соединения, правда, в различной степени, способны повышать проницаемость межклеточных контактов. Наиболее слабо, но статистически достоверно повышает проницаемость фуросемид. Наиболее значительно увеличивает проницаемость межклеточных соединений и устраняет асимметрию потоков флуоресцеина этакриновая кислота и гипотиазид, в отношении последнего способность влиять на проницаемость является новым фактом, показывающим его высокую активность, и на проницаемость межклеточных соединений и на фиксированные воротные заряды. Наконец, алвизид, новое химическое соединение, по структуре близкое к буметаниду, и обладающее значительным диуретическим эффектом, способно увеличивать проницаемость межклеточных соединений и влиять на функцию фиксированных воротных зарядов.
' В то же время, были получены новые результаты по изучению фиксированных воротных зарядов в клетках, осуществля:о"іих направленный перенос ионов. На специально сконструированной установке было изучено движение базальних и люменальных везикул мембран почечного эпителия в электрическом поле. Было показано разнонаправленное движение обоих видов мембран, что и свидетельствует о наличии фиксированных зарядов.
у Было показано, что фиксированные заряды можно блокировать гепарином на серозной поверхности стенки мочевого пузыря, а также протамином сульфатом на мукозной поверхности. Таким образом, фиксированные воротные заряды являются фактором, модулирующим межклеточную проницаемость для ионов. Удаление ионов кальция из межклеточных соединений ЭДТА способствует резкому расширению межклеточных соединений, что проявляется увеличением проницаемости, но асимметрия потоков флуоресцеина сохраняется.
Внедрение
Результаты исследования внедрены в педагогический процесс и используются на кафедре фармакологии Самарского государственного медицинского университета при изучении раздела «Мочегонные средства».
Апробация работы
Результаты работы доложены на студенческих научных конференциях в Самарском медицинском университете (1991), в Красноярском медицинском институте (1992), на конференции по фармакологии почек и водно — солевого обмена в г.Чебоксары (1993), на юбилейной конференции фармацевтического факультета СМГУ (1996), на заседании Самарского общества фармакологов.
Публикации и структура диссертации
По материалам диссертационной работы опубликовано 5 печатных научных работ. Диссертация состоит из 130 страниц машинописи и включает в себя: введение, обзор литературы, описание методов исследования, результаты исследования, обсуждение, выводы и библиографический указатель. Иллюстративный материал представлен 16 таблицами и 24 рисунками.
Работа выполнена по плану НИР Самарского медицинского университета в рамках проблемы «Механизм действия диуретиков и поиск новых диуретических средств», номер госрегистрации 01960002087.
