Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Экспериментальные модели ишемических повреждений головного мозга. 14
1.2. Глутамат-кальциевый каскад патобиохимических реакций ишемического поражения головного мозга 18
1.3. Активные формы кислорода (АФК), их роль в патогенезе ишемии мозга 27
1.3.1. Источники продукции АФК 27
1.3.2. Антиоксидантная система защиты головного мозга 34
1.3.3.Антиоксиданты как нейропротекторы при ишемическом инсульте 38
1.3.4.Фенил-1-бутилнитроны - новый перспективный класс антиоксидантов 46
1.3.5. Взаимосвязь реакций окислительного стресса и глутаматной «эксайтотоксичности»; дисбаланс возбуждающих и тормозных аминокислот; ГАМК-ергическая система, её роль в нейропротекции . 51
Глава II. Материалы и методы исследования. 58
2.1. Объект исследования 58
2.2. Методы исследования 58
2.2.1. Метод дистальной окклюзии средней мозговой артерии(ОСМА) у крыс 58
2.2.2. Метод окраски головного мозга метаболическим красителем 2,3,5-трифенилтетразолий хлоридом 61
2.2.3. Количественный анализ зоны ишемии головного мозга крыс после дистальной ОСМА 61
2.2.4. Метод экстракции коэнзима Q и витамина Е из ткани головного мозга крыс 62
2.2.5. Количественный анализ содержания коэнзима Q и витамина Е в экстракте гомогената ткани головного мозга крыс 62
2.2.6. Метод микродиализа головного мозга крысы 63
2.2.7. Конструкция микродиализной пробы 64
2.2.8. Метод ЭПР-диагностики содержания а-фенил-бутилнитрона (PBN) в ткани головного мозга, печени, почек 65
2.3. Протоколы исследования 67
2.4. Статистическая обработка результатов 70
Глава III. Полученные результаты и их обсуждение 72
3.1.Характеристика ишемического поражения головного мозга крыс при необратимой дистальной ОСМА у крыс. 72
3.1.1.Размер зоны ишемии головного мозга при дистальной окклюзии средней мозговой артерии 72
3.1.2.Уровень дофамина и его метаболитов в стриатуме ипсилатерального полушария у крыс с необратимой ОСМА 75
3.1.3. Уровень коэнзимов Q9, Q10 и а-токоферола в ткани головного мозга крыс с необратимой ОСМА 79
3.2.Фармакологическая коррекция ишемического повреждения головного мозга крыс при необратимой ОСМА. 89
3.2.1.Размер зоны ишемии головного мозга крыс с ОСМА, получавших PBN, мексидол, комплексный препарат пирролидона-2 и пироглутаминовой кислоты, нооглютил. 89
3.2.2. Уровень коэнзимов Q9, Q10 и а-токоферола в ткани ипси- и контралатерального полушарий головного мозга крыс, получавших PBN 102
3.2.3. Уровень экстрацеллюлярного и тканевого содержания PBN в ипсилатеральном полушарии головного мозга, образцах ткани контралатерального полушария, печени, почек крыс 109
Заключение 112
Выводы 115
Список литературы 117
- Источники продукции АФК
- Взаимосвязь реакций окислительного стресса и глутаматной «эксайтотоксичности»; дисбаланс возбуждающих и тормозных аминокислот; ГАМК-ергическая система, её роль в нейропротекции
- Уровень коэнзимов Q9, Q10 и а-токоферола в ткани головного мозга крыс с необратимой ОСМА
- Уровень коэнзимов Q9, Q10 и а-токоферола в ткани ипси- и контралатерального полушарий головного мозга крыс, получавших PBN
Введение к работе
Актуальность проблемы. Ежегодно в России переносят инсульт более 450000— 500000 человек (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Верещагин Н.В., Варакин Ю.Я., 2001). Сосудистые заболевания головного мозга занимают второе место в структуре общей смертности и являются основной причиной инвалидизации трудоспособного населения (Dorman P.J., Sandercock P.A.G., 1995; Brott Т., Bogousslavsky J., 2000; Kidwell C.S., et al., 2001). Все это позволяет считать инсульт проблемой медицинской и социальной значимости. В связи с этим, актуален поиск новых эффективных препаратов, оказывающих нейропротекторное действие (Топчян А.В., 1999; Оковитый СВ., Смирнов А.В., 2001; Фишер М., Шебитц В., 2001; Воронина Т.А., 2002; 2002; 2003; Мирзоян Р.С., 2003; Островская Р.У., 2003; Dorman P.J., Sandercock P.A.G., 1995; STAIR 1999; Brott Т., Bogousslavsky J., 2000; Kidwell C.S., et al., 2001). Несмотря на большое количество лекарственных средств (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Фишер М., Шебитц В., 2001), использующихся в настоящее время в практической неврологии, проводимая терапия не всегда оказывается эффективной. Одной из причин этого является неадекватность большинства экспериментальных моделей истинной клинической картине ишемического инсульта, на которых проводится тестирование новых соединений (Hunter A.J., et al.,1995; Фишер М., Шебитц В., 2001). Использованная в работе модель локальной ишемии головного мозга у крыс путем окклюзии средней мозговой артерии (ОСМА) является одной из наиболее адекватных моделей (Hunter A.J., et al., 1995), тем более что она воспроизводит типичную локализацию ишемического инсульта у людей -бассейн средней мозговой артерии (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001).
Ишемическое поражение головного мозга сопровождается последовательным развитием патобиохимических реакций глутамат-кальциевого каскада, на протяжении всех этапов которого наблюдается активизация свободнорадикальных процессов (Love S., 1999; Gigun-Suerrki Y., et al., 2002). Развивается состояние «окислительного» стресса, проявляющегося в гиперпродукции активных форм кислорода (АФК) (Медведев Ю.В., Толстой А.Д., 2000; Ланкин В.З., и соавт., 2001, 2002; Castagne V., et al., 1999; Cadenas E., et al., 2000) на фоне недостаточной работы антиоксидантной защиты, одним из компонентов которой является убихинон. С одной стороны, данное соединение является важным компонентом дыхательной митохондриалыюй цепи, с другой стороны - антиоксидант, участвующий в регенерации а-токоферола, а также способного напрямую реагировать с АФК (Медведев Ю.В., Толстой А.Д., 2000; Dallner G., Sindelar P.J., 2000; Ernster L., Dallner G., 1995; Nohl H., Gille L., 2002). Достаточно мало данных литературы, посвященных исследованию влияния ишемии на тканевое содержание убихинона(КіпШа Y., et al.,1989; Maulik N., et al., 2000), тем более локальной ишемии головного мозга.
Одним из направлений терапии ишемического инсульта является использование лекарственных препаратов, обладающих антиоксидантным действием (Дюмаев К.М., и соавт., 1995; Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001).
Учитывая имеющиеся на данный момент сведения о тесной патогенетическое взаимосвязи глутаматной эксайтотоксичности и гиперпродукции свободны* радикалов (Викторов И.В., и соавт., 1996; Yang C.-S., et al., 1995, 1996; Lanceloi E., et al., 1997; Gigun-Suerrki Y., et al., 2001; Kontos H.A., 2001; Hayashi Y., et al.. 2002) представляло интерес оценить нейропротекторное действие препаратов, влияющих на эти звенья патогенеза ишемического инсульта на модели локальной ишемии головного мозга у крыс путем окклюзии средней мозговой артерии (ОСМА).
Одним из исследуемых препаратов с преимущественно антиоксидантной активностью явился а-фенил-г-бутилнитрон (PBN), широко использующийся в аналитической и биоорганической химии в качестве «ловушки» свободных радикалов. В последние годы появились сведения о положительном нейропротекторном действии PBN (Folberqrova J., et al., 1995; Kuroda S.,. et al. 1996; 1999; Floyd R.A., et al., 2002; Yoshimoto Т., et al., 2001; Zhao Z., et al. 2001). В литературе имеются сведения о стабилизирующим влиянием PBN на митохондриальную дисфункцию (Folberqrova J., et al., 1995; Kuroda S.,. et al. 1996), ингибировании синтеза NO и провоспалительных факторов (Kotake Y.et al., 1998), блокаде кальциевых каналов (Anderson D.E., et al., 1993), обратимом ингибировании ацетилхолинэстеразы (Milatovic D., et al., 2000).
Вторым препаратом с преимущественно антиоксидантным механизмом действия, явился мексидол, производное 3-оксипиридина, синтезированный в ГУ НИИ фармакологии РАМН. Мексидол, оказывая позитивное влияние на экзогенную антиоксидантную систему защиты головного мозга (повышает активность супероксидисмутазы, глутатионзависимых ферментов, увеличивает концентрацию восстановленной формы глутатиона) и противодействуя гиперпродукции свободных радикалов (напрямую взаимодействуя с АФК), ослабляет проявление оксидативного стресса в ишемизированной ткани. В реализации ненропротективного действия мексидола играет роль его мембраностабилизирующий эффект (Дюмаев К.М., и соавт., 1995). Кроме того, вызывая репарацию структурно-функциональных нарушений в мембране и одновременно являясь модулятором ГАМК-бензодиазепинового комплекса, препарат оказывает ГАМК - позитивный эффект, тем самым, устраняя дисбаланс между тормозными и возбуждающими аминокислотами, вызванный ишемическим поражением головного мозга (Воронина Т.А.,, 2001; 2002; 2003).
Следующим препаратом, влияюшим на ГАМК-ергическую систему и восстанавливающим баланс между тормозными и возбуждающими процессами в головном мозге при ишемии (Мирзоян Р.С., 2003) явилась лекарственная композиция пирролидона- 2 и пироглутаминовой кислоты, синтезированных в ГУ НИИ фармакологии РАМН и предствляющих собой циклические аналоги глутаминовой и у-аминомасляной кислот. Пирролидон за счет взаимодействия с ГАМКА-рецепторами сосудов головного мозга улучшает мозговое кровообращение, пироглутаминовая кислота в большей степени влияет на метаболизм головного мозга, стимулируя процесс захвата и утилизации глюкозы (Топчян А.В., 1999; Мирзоян Р.С., 2003).
Исследовали нейропротекторное действие нооглютила (N-(5-оксиникотнноил)-Ь-глутаминовая кислота) - ноотропного препарата, синтезированного в ГУ НИИ фармакологии РАМН, являющегося модулятором АМРА рецепторов и оказывающим позитивное влияние на ГАМК-ергическую систему( Воронина Т.А., 2003; Гарибова Т.Л., и соавт., 2003).
Экспериментальные исследования взаимосвязи между
свободнорадикальными процессами и глутамагной эксайтотоксичностью, являющейся отражением дисбаланса между тормозными и возбуждающими системами головного мозга при ишемии головного мозга, недостаточны (Викторов И.В., 1996; Yang C.-S., et al., 1995, 1996; Skaper S.D., et al., 1999; Avshalumov M.V., Rice M.E., 2001; Gigun-Suerrki Y., et al., 2002; Hayashi Y., et al., 2002). Это явилось основой для сравнительного исследования нейропротекторного действия перечисленных препаратов на модели локальной ишемии головного мозга у крыс.
Цель работы
Оценка модели локальной ишемии головного мозга, вызванной дистальной окклюзией средней мозговой артерии, и коррекция ишемических повреждений с помощью фармакологических веществ.
Задачи исследования
1. Оценка зоны ишемического поражения головного мозга крыс при
окклюзии дистального отдела средней мозговой артерии.
Исследование состояния дофаминергической системы при ишемическом поражении головного мозга.
Изучение влияния локальной ишемии головного мозга на состояние антиоксидантной системы защиты (коэнзимов Q9 и Q10, а-токоферола).
4. Исследование нейропротекторного действия а-фенил-/-бутилнитрона,
мексидола, нооглютила, комплекса пирролидона-2 и пироглутаминовой
кислотой при окклюзии средней мозговой артерии у крыс.
5. Исследование защитного действия а-фенил-/-бутилнитрона в
отношении антиоксидантной системы(коэгоимов Q9 и Q10, а-токоферола)
головного мозга при окклюзии средней мозговой артерии у крыс.
6. Исследование фармакокинетических свойств а-фенил-г-бутилнитрона
(распределение а-фенил-Г-бутилнитрона в организме животного), установление
взаимосвязи с его ненропротекторным действием.
Научная новизна
Впервые методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием было выявлено влияние локальной ишемии головного мозга на состояние одного из компонентов антиоксидантной системы защиты- коэнзимов Q9 и Q10, а-токоферола. При этом установлено,
что в первую очередь страдает система коэнзимов при минимальных изменениях тканевого содержания а-токоферола.
Примененная нами модель локальной ишемии головного мозга путем дистальной окклюзии средней мозговой артерии у крыс, при хорошей переносимости животными позволяет целенаправленно исследовать нейропротекторное действие препаратов в отношении поврежденных корковых структур головного мозга. Выявлены высокие нейропротекторные свойства у сс-фенил-г-бутилнитрона, который на фоне достоверного ограничения зоны ишемии также препятствовал изменениям антиоксидантной системы защиты головного мозга в виде уменьшения падения тканевого содержания коэнзимов Q9, Q9+Q10. Мексидол, нооглютил, комплексный препарат пирролидона-2 и пироглутаминовой кислоты при сходном протоколе введения также достоверно ограничивали зону ишемического поражения.
Несмотря на незначительные изменения подкорковых структур при данной модели локальной ишемии, в области стриатума ипсилатерального полушария методом микродиализа было выявлено достоверное повышение экстрацеллюлярного уровня диоксифенилуксусной кислоты (метаболита дофамина) на 40 мин послеоперационного периода, что может являться отражением реакции окружающей ткани, в частности дофаминергической системы, на патологические процессы, протекающие в зоне ишемии.
Впервые методом электронного парамагнитного резонанса было подтверждено внутриклеточное накопление а-фенил-Ьбутилнитрона, что в дальнейшем, по-видимому, определяет основное защитное действие данного соединения при ишемии головного мозга.
Научно-практическое значение
Полученные данные о способности PBN, комплекса пирролидона-2 и пироглутаминовой кислоты, нооглютила ограничивать зону ишемического поражения головного мозга позволяют рассматривать указанные препараты в качестве потенциальных средств для лечения больных с ишемическими поражениями головного мозга.
Полученные данные по влиянию локальной ишемии головного мозга на тканевое содержания коэнзимов Q могут быть в дальнейшем использованы для рекомендации включения препаратов, содержащих убихинон, в терапию больных с ишемическим инсультом.
Положения, выносимые на защиту
1. Использованная в работе модель локальной ишемии головного мозга путем окклюзии дистального отдела средней мозговой артерии у крыс, приводит к формированию локального некроза лобно-теменной области коры, что позволяет использовать данную модель для оценки защитного действия различных соединений в отношении данных структур головного мозга.
Локальная ишемия вызывает нарушения антиоксидантной системы защиты ипсилатерального полушария головного мозга, проявляющееся в снижении уровня восстановленной формы коэнзимов Q9 и Q10 при минимальных изменениях содержания а-токоферола. Уменьшение общего пула убихинонов связано с некротическими изменениями нервных клеток зоны ишемии.
Экстрацеллюлярное содержание дофамина в области стриатума ипсилатерального полушария при дистальной ОСМА минимально на фоне повышеного уровня его метаболита - диоксифенилуксусной кислоты, что является отражением реакции дофаминергической системы на патологические процессы, протекающие в зоне ишемии.
сс-фенил-/-бутилнитрон, мексидол, комплексный препарат пирролидона-2 и пироглутаминой кислоты, нооглютил достоверно ограничивают зону ишемического поражения.
сс-фенил-Г-бутилнитрон у крыс после дистальной ОСМА оказывает защитное действие на общий пул коэнзимов в ипсилатеральном полушарии головного мозга у крыс.
Отсутствие сигнала спин-аддукта сс-фенил-Г-бутилнитрона во всех микродиализных пробах может быть связано с низким его содержанием (на момент забора проб) в интерстиции ткани головного мозга и возможным депонированием данного соединения в нервных клетках, что, по-видимому, в дальнейшем определяет защитное действие соединения.
Апробация работы
Результаты работы докладывались и обсуждались на научно-практической конференции «Медицина будущего», Краснодар-Сочи, 2002; XII Международном форуме « Медико-экологическая безопасность, реабилитация и социальная защита населения», Турция, Кемер, 2002; X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2003; семинарах кафедры фармакологии факультета фундаментальной медицины МГУ; II Съезде Российского научного общества фармакологов, Москва, 2003; 3rd International Symposium "Neuroprotection and Neurorepair", Magdeburg, Germany, 2003; национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека», Смоленск, 2003.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, I статья находится в печати.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, 2 глав с результатами экспериментов и их обсуждением, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 149 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы, 23 рисунка. Список литературы включает 284 наименования.
Источники продукции АФК
Исследования последних лет убедительно доказали участие свободных радикалов в патогенезе ишемического поражения головного мозга, что также подтверждает эффективность проводимой антиоксидантной терапии (Миронов Н.В., и др., 2001; Solenski N.J., et al., 1997; Takamatsu H., et al„ 1998; Young I.S., Woodside J.V.1999; Kontos H.A., 2001; Gigun-Suerrki Y., et ah, 2002).
Свободные радикалы представляют собой атомарные или молекулярные частицы, имеющие на одной или более электронных орбиталей один неспаренный электрон (Величковский Б.Т., 2001; Droge W., 2002), благодаря чему легко вступают в реакции со структурными элементами клетки, образуя в свою очередь новые радикалы. При взаимодействии двух свободных радикалов, имеющих на внешней орбите по неспаренному электрону, образуется стойкое соединение. В зависимости от активности и способности отщепления атома Н от соседних молекул выделяют активные и стабильные свободные радикалы. Причем именно первый вид является наиболее агрессивным, короткоживущим, т.к. легко реагирует с близлежащими молекулами, образуя при этом новые радикалы, в последующем вступающими в реакцию со структурными компонентами клетки: фосфолипидами, белками, ДНК (Величковский Б.Т., 2001; Butterfild D.A., et al., 1998). Одной из мишеней действия АФК являются сульфгидрильные группы белков-ферментов: глутатион-редуктазы, глутатион-пероксидазы, АТФ-азы, НАДФН-оксидазы, НАДФН-редуктазы, сукцинатдегидрогеназы, цитохром С-оксидазы (Cadenas Е., Davies К.J.А. 2000). Происходит дезактивация ферментов и, как следствие, нарушаются клеточные функции, такие как дыхательная, транспортная, антиоксидантная защита, синтез АТФ (Anderson M.F., Sims N.R., 1999). Воздействие на ДНК приводит к нарушению её целостности, что в дальнейшем может стать причиной мутации, канцерогенеза (Дюмаев К.М., Воронина Т.А., Смирнов Л.Д., 1995). АФК запускают цепные реакции окисления липидов с образованием пероксильных и алкоксильных радикалов(На11 E.D., Andrus Р.К., Althaus Р.К., Voigtlander V., 1993; Ланкин ВЗ, Тихазе А.К., Беленков Ю.Н., 2001; 2002), запускаются реакции деэстерификации фосфолипидов с последующим накоплением полиненасыщенных жирных кислот (Kinuta Y., et al., 1989; Pamplona R., et al., 1998; Narita K., et al., 2000).
К активным формам кислорода (АФК) помимо свободных радикалов относятся вещества нерадикальной природы: синглетный кислород — Ог, гипохлорная кислота — НОСІ, перекись водорода — Н2О2, пероксинитритный анион - ONOO".
В физиологических условиях АФК вырабатываются во всех клетках и являются неотъемлемыми продуктами аэробного метаболизма(Біч е W., 2002). До 60% всей продукции радикалов приходится на митохондрии, около 20% - на микросомы, 20% - на остальные структуры. Выделяют неферментативные и ферментативные пути продукции АФК (Медведев Ю.В., Толстой А.Д., 2000).
К неферментативным источникам генерации АФК относится реакция аутоокисления оксигемоглобина(уап Dyke B.R., Saltman P. 1996), в результате которой содержащееся в геме двухвалентное железо окисляется до трехвалетного, а кислород восстанавливается до супероксидного анион-радикала.
Дополнительными источниками генерации супероксидного анион-радикала является окисление аскорбиновой кислоты и НАДФН в присутствии кислорода. Скорость окисления витамина С резко возрастает при наличии в биологической среде свободных ионов железа или меди. В норме в тканях концентрация супероксидного радикала не превышает 10"2-10"пМ. Отмечается способность самопроизвольного взаимодействия радикалов между собой с образованием более стабильного соединения — перекиси водорода, концентрация которого на 3-4 порядка выше, чем супероксидного радикала. Присутствие в биологической среде свободных ионов железа или меди способствует запуску реакций Хабера-Вейса, в ходе которых образуется высокореакционный гидроксильный радикал, при взаимодействии которого с фосфолипидами запускается каскад свободно-радикальных реакций в клеточных мембранах.
Вторым источником образования свободных радикалов являются ферментативные процессы, протекающие в организме. Выделяют две группы ферментов, участвующих в образовании свободных радикалов. Если для одной группы (НАДФН-и НАДН-оксидазы клеточных мембран фагоцитов) синтез радикалов является основной функцией, то для другой - радикалы являются побочным продуктом их деятельности. Примером могут послужить ферменты дыхательной цепи митохондрий, участвующих в 4-х электронном восстановлении бирадикала кислорода (Дюмаев К.М., и соавт., 1995; Виноградов А.Д., 1999; Величковский Б.Т., 2001; Nicholls D.G., Budd S.I., 2000). При этом возможен путь моноэлектронного восстановления, приводящий к образованию реакционноспособных супероксидных и гидроксильных радикалов. При физиологических условиях около 3-5 % всего потребляемого кислорода восстанавливается до супероксидного радикала, в дальнейшем преобразующегося в более стабильное и менее реакционноспособное соединение - перекись водорода (Дюмаев К.М., и соавт., 1995; Величковский Б.Т., 2001).
Возможен также квазиферментативный (полуферментативный) путь инициирования свободнорадикального окисления, когда первоначально АФК образуются в результате действия ферментов-прооксидантов, а в дальнейшем процесс развивается неферментативно (Ланкин В.З и соавт., 2001; 2002).
Мозг человека, составляя лишь 2% от общей массы тела, утилизирует около 20-25% всего потребляемого организмом кислорода. Учитывая высокое содержание в тканях мозга липидов, богатых ненасыщенными связями, аскорбата, проявляющего и антиоксидантные и прооксидантные свойства, ионов железа, низкую активность системы антиоксидантнои защиты по сравнению с другими органами, следует признать высокую вероятность развития оксидативного повреждения клеток мозга (Kinuta Y., et al., 1989; Juurlink B.H., 1997; Castagne V., et al., 1999).
Ранее считалось, что гиперпродукция АФК характерна для таких состояний как гипероксии, аэробно-анаэробный переход, сопровождающий ишемию с реперфузией (Биленко М.В., 1989; Gursoy -Ozdemir У., et al., 2000). Однако, в настоящее время экспериментально доказано, что в условиях нарушения мозгового кровообращения в ткани увеличивается содержание АФК, что является одним из главных патогенетических звеньев ишемического повреждения головного мозга (Takamatsu Н., et al., 1998; Lipton P., 1999). В обзоре литературы, проведенном Lipton Р.(1999), приведены экспериментальные данные различных авторов о начале и продолжительности продукции АФК при локальной ишемии головного мозга. Самым ранним зафиксированным временем начала продукции АФК является 30 мин ишемии, продолжительность генерации составляла все 12 часов эксперимента.
Очень трудно выделить инициирующий агент, который запускает при ишемии реакции окисления. По данным Juurlink B.H.J. (1997) можно выделить 3 ключевых агента, вызывающих сильное повреждение в клетке:
1. супероксидный анион-радикал, производящий синглетный кислород, перекись водорода, восстанавливающий Fe3+ до Fe2+;
2. перекись водорода, участвующая в образовании 4 наиболее реакционноспособных АФК: пероксинитрит, гидроксил-радикал, гипохлорит, синглетный кислород;
3. металлы переходной валентности, такие как Fe, Си, катализирующие реакции образования гидроксил-радикала из перекиси водорода.
При ишемии наблюдается активация нескольких источников продукции АФК(Іліі Y., et al., 2002). Одним из главных источников генерации свободных радикалов при ишемии является дыхательная митохондриальная цепь (Виноградов А.Д., 1999; Cadenas Е., Davies K.J.A., 2000; Liu J., et al., 2002; Nicholls D.G., Budd S.I., 2000; Pamplona R., et al., 2002).
Взаимосвязь реакций окислительного стресса и глутаматной «эксайтотоксичности»; дисбаланс возбуждающих и тормозных аминокислот; ГАМК-ергическая система, её роль в нейропротекции
Наблюдающиеся при ишемии головного мозга реакции окислительного стресса тесным образом связаны с глутаматной «эксайтотоксичностью». Предполагается, что данные процессы имеют прямую двойную связь. Так, накопление экстрацеллюлярного глутамата через активацию агонист-зависимых кальциевых каналов приводит к насыщению ионами Са2+ нейронов, что запускает целый ряд патобиохимических реакций в клетке, в том числе и гиперпродукцию АФК (Викторов А.И. и соавт., 1996; Gigun-Suerrki Y., et al., 2002). В то же время, свободные радикалы, оказывающие повреждающее воздействие на структурные компоненты клетки, в том числе фосфолипиды, изменяют чувствительность клетки к воздействию внешних факторов, в частности, модификации белков мембранных рецепторов усиливают проявления глутаматной «эксайтотоксичности» (Castagne V.,et al., 1999).
В последнее время в литературе большое внимание уделяется не только процессам цитотоксического действия глутамата, но и роли формирующегося при ишемии дисбаланса между возбуждающими и тормозными аминокислотами(8пігоІапі Т., et aL, 1995). Многочисленные экспериментальные данные (Pascual J.M., et al., 1998; Melani A., et al., 1999; Hutschiton P.J., et al. 2002) свидетельствуют о том, что при ишемии параллельно с активацией системы возбуждающих аминокислот (глутамат, аспартат) с некоторым опозданием наблюдается менее выраженная реакция ГАМК-и глицин - ергических систем.
В 1992-1994 г. в Испании проводилось исследование (Castillo J., et al., 1996), в котором участвовало 128 пациентов с впервые установленным диагнозом ишемического инсульта. При исследовании содержания в плазме и цереброспинальной жидкости больных уровеня глутамата, аспартата, глицина, таурина выявлено достоверное повышение уровня глутамата и глицина. Подтверждение этих данных было получено в ходе исследований, проведенных на базе неврологических клиник Российского государственного медицинского университета. У больных с ишемическим инсультом на 1-е и 3-е сутки заболевания определяли. содержание нейротрансмиттерных аминокислот в цереброспинальной жидкости (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001). Было установлено, что тяжесть состояния больного определяет степень и характер изменений содержания возбуждающих (аспартат, глутамат) и тормозных (ГАМК, глицин) аминокислот. Выявлено, что для первых суток характерно повышение уровня возбуждающих аминокислот, причем аспартата в 65 раз, глутамата — в 8 раз по сравнению с контрольной группой. Реакция тормозных аминокислот отсрочена на более поздний период( 18-24 часа) и была в меньшей степени выражена - уровень ГАМК повышался в 1,5 раза, глицина - в 3 раза. Неблагоприятным признаком считалось значительное снижение, вплоть до невозможности определения ГАМК. Похожую картину изменений содержания аминокислот отмечали на 3 сутки заболевания. Причем невозможность определения глутамата и ГАМК в цереброспинальной жидкости предполагало наиболее тяжелое и неблагоприятное течение инсульта.
В тоже время в клиническом исследовании Serena J.S., et al.(2001) у больных с лакунарным инфарктом в первые сутки заболевания в плазме отмечалось трехкратное снижение содержания ГАМК на фоне подъема глутамата (в 2 раза) и 6-кратное увеличение индекса «эксайтотоксичности» ([глутамат]Х[глицин]/[ГАМК]). Причем наиболее неблагоприятным признаком считалось дальнейшее выраженное падение содержания ГАМК и высокое значение индекса «эксайтотоксичности».
В исследованиях Hutschiton P.J., et al. (2002) у пациентов с геморрагическим инсультом методом микродиализа головного мозга напрямую было подтверждено существование дисбаланса между возбуждающими и тормозными аминокислотами.
Перечисленные клинические исследования в сумме с экспериментальными данными (Shirotani Т., et al., 1995; Melani A., et al., 1999) подтверждают значимость дисбаланса между возбуждающими и тормозными аминокислотами и недостаточность естественных защитных механизмов в патогенезе ишемического инсульта. В связи с этим представляет интерес направление фармакотерапии ишемических поражений головного мозга в виде воздействия на систему тормозных аминокислот, в частности, на ГАМК-ергическую CHCTeMy(Sydserff S.G., et al., 2000). Повышенный интерес к изучению ГАМК появился в середине 60-х годов, когда Мирзояном С.А. и Акопяном В.А. была установлена способность аминокислоты понижать тонус сосудов и, таким образом, увеличивать мозговое кровообращение (Галенко - Ярошевский П.А., 1999). Несколько позже было выявлено, что для головного мозга характерно значительное количество ГАМК и ферментов, участвующих в её метаболизме. Данный факт явился толчком для систематического изучения цереброваскулярного эффекта ГАМК и её производных. Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о стимулирующем влиянии ишемии как глобального, так и локального характера на синтез ГАМК (Pascual J.M., et al., 1998; Melani A. et al. 1999; Hutschiton P.J., et al., 2002). Нейротропные эффекты ГАМК реализуются посредством активации специфических рецепторов. Выделяют ГАМКд И ГАМКв-рецепторы (некоторые авторы дополнительно выделяют ГАМКс и ГАМК0-рецепторы (Семьянов А.В., 2002)), различающиеся по локализации (пресинаптические — ГАМКд, постсинаптические - ГАМКВ ) и по фармакологическим признакам: бикукулин- (ГАМКА ) и баклофенчувсвительные (ГАМКВ ). Считается, что защитный эффект данной аминокислоты определяется воздействием как на пресинаптические ГАМКв-рецепторы, функционально связанные с потенциал-зависимыми кальциевыми каналами, так и постсинаптические ГАМКА-рецепторы, связанные с потенциал-зависимыми хлорными каналами. ГАМК способна оказывать постсинаптическое депримирующее влияние на нейроны за счет открытия хлорных каналов и поступления внутрь клетки СГ , а также модулировать на пресинаптическом уровне высвобождение нейромедиаторов из нервных терминалей, выполняя роль тормозной аминокислоты (Галенко - Ярошевский П.А.,1999; Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001), что является одним из звеньев его нейропротективного эффекта. Дополнительным, но не менее важным в реализации противоишемического действия ГАМК является позитивный цереброваскулярный эффект, обусловленный стимуляцией коллатерального кровотока, увеличением числа функционирующих капилляров; влиянием на энергетический обмен клеток; антиоксидантным действием (Галенко - Ярошевский П.А., 1999). В исследованиях Saxena N.C. (2000) выявлено ингибирующее влияние арахидоновой кислоты на синтез ГАМК, что может служить одной из причин "запаздывающего" ответа системы тормозных аминокислот на ишемию.
Важная роль ГАМКА-рецепторов в регуляции мозгового кровообращения, активация тормозных ГАМК-ергических механизмов, устраняющих дисбаланс между тормозными и возбуждающими аминокислотами, способствовали созданию нейропротекторов с ГАМК-миметическими свойствами. Одним из таких препаратов явилась лекарственная композиция, включающая в себя пирролидон и пироглутаминовую кислоту, циклических производных у-аминомасляной и глутаминовой кислот(Топчян А.В., 1999, Мирзоян Р.С, 2003)(см. «рис.4»). В исследованиях Топчян А.В.(1999) было установлено , что данная композиция у интактных животных, но в большей степени у крыс с ОСМА вызывают улучшение мозгового кровоснабжения.
Уровень коэнзимов Q9, Q10 и а-токоферола в ткани головного мозга крыс с необратимой ОСМА
Одним из ключевых моментов ишемического поражения головного мозга является нарушение работы дыхательной митохондриальной цепи, нарушение её электрон- и протон транспортной функции, что ведет к снижению синтеза АТФ, увеличению степени восстановленности компонентов цепи, гиперпродукции АФК (Anderson M.F., Sims N.R., 1999; Cadenas Е., Davies K.J.А., 2000; Forsmark-Andree P., et al., 1997). Коэнзим Q, являясь одним из компонентов дыхательной цепи, в восстановленной (убихинол) и полувосстановленной (убисемихинон) формах представляет собой эндогенный антиоксидант,- способный нейтрализовать свободные радикалы как в результате прямой реакции с ними (Медведев Ю.В., Толстой А.Д., 2000; Dallner G., Sindelar P.J., 2000), так и за счет участия в биорегенерации другого антиоксиданта - а-токоферола (Ernster L., Dallner G., 1995; Nohl H„ Gille L., 2002).
В нашем исследовании определялось содержание убихинола и общего пула убихинона в гомогенате головного мозга, отдельно в ипсилатеральном и контралатеральном полушариях головного мозга крыс.
Было выявлено статистически достоверное (р 0.05) уменьшение содержания убихинола в ипсилатеральном полушарии(см. «рис.10» «рис.12»). Отмечалась тенденция к уменьшению доли восстановленной формы в общем пуле убихинона в полушарии с окклюзией СМА (табл. 2). Однако данные изменения не являлись статистически значимыми (р 0,05).
Выявлено достоверное уменьшение общего пула убихинона в полушарии с окклюзией СМА, что может быть обусловлено деструктивными изменениями нервных клеток в зоне нарушенного кровотока(см. «рис. 11», «рис. 12»). Следует отметить, что при ишемии наблюдается два разнонаправленных процесса, определяющих содержание восстановленной формы убихинона в общем пуле: первый - повышающий - в основном за счет повышения степени восстановленности митохондриального пула коэнзима Q в дыхательной цепи (Ланкин В.З., и соавт., 2001; 2002); второй. - понижающий - в результате использования убихинола и убисемихинона как антиоксидантов для нейтрализации AOK(Ernster L., Dallner G.1995; Медведев Ю.В., Толстой А.Д., 2000; Dallner G., Sindelar P.J., 2000; Nohl Н., Gille L., 2002). Через 24 часа после операции ОСМА у животных отмечается активизация нескольких источников продукции АФК (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Juurlink В.Н., 1997; Love S., 1999), что ведет к повышенной нагрузке на антиоксидантную защиту организма и истощению запасов эндогенных антиоксидантов (Ланкин В.З., и соавт., 2002; Forsmark-Andree.P., et al., 1997; Anderson M.F., Sims N.R., 2002), в том числе и коэнзимов.
С учетом имеющейся прямой корреляционной связи между изменениями общего пула коэнзимов и их восстановленными формами (г=0,95 для Q9; г=0,87 для Q10 и г=0.99 для Q9+Q10) можно предположить, что изменения содержания убихинола в ипсилатеральном полушарии определяются не только повышенной потребностью организма в антиоксидантах, но, прежде всего, имеющимися некротическими изменениями в зоне ишемии, уменьшением жизнеспособных нервных клеток.
Результаты наших исследований согласуются с данными Kinuta Y., et al.(1989). Авторы исследовали содержание эндогенных антиоксидантов - а-токоферола, восстановленных форм коэнзимов Q9 и Q10, аскорбата - взоне ишемии на модели ОСМА у крыс. Через 0,5; 6; 12 часов после операции было выявлено достоверное падение уровня данных соединений. Наши исследования проводились в более поздний период - 24 часа после операции, когда практически заканчивается формирование очага поражения, запущены основные источники продукции АФК(Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Juurlink В.Н:, 1997; Love S., 1999). Именно через данный промежуток времени после ОСМА мы можем с большей вероятностью судить о степени нарушений антиоксидантной защиты головного мозга при ишемии. Если уровень падения восстановленной формы коэнзимов в нашем исследовании соответствует данным Kinuta Y., et al.(1989): для Q9 - 65,1±4.8% против 73% и для Q10 - 63,9 ±4,5% против 66%, то для а-токоферола отмечалось незначительное (р 0,05) уменьшение содержания в ипсилатеральном полушарии - 88,3±8,3% по сравнению с контралатеральным( см. «рис.13»).
Данные литературы о влиянии ишемии на содержание сс-токоферола в ткани головного мозга противоречивы. Имеются сведения о снижении уровня а-токоферола при нарушении мозгового кровообращения (Abe К., et al., 1983; Kinuta Y., et al., 1989). В тоже время исследования, проведенные Yue T.L., et al.(1993) на моделях локальной и глобальной ишемии головного мозга (с. последующей реперфузией и без) у крыс и песчанок, не выявили статистически достоверных, уменьшений содержания витамина Е в зоне поражения. На основании этих данных авторы делают вывод о неправомерности суждения о выраженности свободно-радикальных реакций в зоне поражения по содержанию а-токоферола.
Свободнорадикальные реакции являются одним из компонентов ишемического патогенетического каскада (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Lipton Р., 1999). При этом, если в физиологических условиях защитные антиоксидантные системы организма контролируют данные процессы, то в условиях ишемии отмечается нарушение нормальной регуляции. Окислительный стресс является проявлением состояния дисбаланса между гиперпродукцией АФК и сниженной активностью защитных систем клетки, а-токоферол является компонентом второй линии защиты клетки от свободнорадикального повреждения и при ишемии принимает активное участие в нейтрализации образующихся липидных радикалов, что должно привести к уменьшению его содержания в ткани и накоплению ct-токоферильного радикала. Однако, а-токоферол обладает способностью активно регенерировать. Витамин С, восстановленная и полувосстановленная формы убихинона участвуют в регенерации сс-токоферильного радикала в а-токоферол(Ланкин В.З., и соавт., 2001, 2002). При этом восстановление убисемихинона до убихинола происходит либо в митохондриальной цепи переноса электронов, либо при взаимодействии с витамином С (Ланкин В.З., и соавт., 2001, 2002; Arroyo A., et al., 1999). По данным Stoyanovsky D.A., et al. (1995) и Lass A., Sohal R.S.(1998) возможно одно-электронное восстановление убисемихинона за счет его взаимодействия с супероксидным радикалом, что может служить одной из сторон защиты от истощения пула а-токоферола при свободнорадикальных реакциях. Активно протекающие свободнорадикальные процессы сопровождаются не менее активными процессами восстановления пула а-токоферола. При этом, противоречивые данные литературы о влиянии ишемии на тканевое содержание а-токоферола возможно в меньшей степени связаны с особенностями эксперимента ( модель ишемии, вид животного), и в большей степени обусловлены условиями содержания животных, прежде всего кормления. Здесь следует отметить, что а-токоферол не синтезируется в организме, восполнение его содержания происходит алиментарным путем (Ланкин В.З., и соавт., 2001, 2002). Имеются данные литературы, свидетельствующие о влиянии диеты с различным содержанием витамина Е, а также коэнзима Q10 на концентрацию этих соединений в ткани у различных видов животных(Маипе\уз R.T., et al., 1998; Maulik N.. et al., 2000; Ibrahim W.H., et al., 2002). При этом отмечалось ингибирующее влияние высоких доз витамина Е на концентрацию коэнзима Q10 (Ibrahim W.H., et al., 2000), что связывали с возможной единой системой абсорбции, транспорта и возникающей при этом конкуренции.
Уровень коэнзимов Q9, Q10 и а-токоферола в ткани ипси- и контралатерального полушарий головного мозга крыс, получавших PBN
Через 24 часа после дистальной окклюзии левой средней мозговой артерии животные, получавшие PBN (100мг/кг, однократно - в момент операции ОСМА, внутривенно) были декапитированы. Полушария по отдельности подвергались процедуре гомогенизации и экстракции коэнзимов Q9 и Q10, а-токоферола с последующей их количественной оценкой с помощью ВЭЖХ с электрохимическим детектированием (таблица 3).
Было отмечено незначительное падение уровня коэнзимов Q9, Q10, суммы Q9 + Q10 как их восстановленной формы(см. «рис 20»)., так и общего пула(см. «рис 21») в ипсилатеральном полушарии по сравнению с контралатеральным. При этом, если изменения восстановленной формы являлись статистически значимыми (р 0,05), то падение общего пула коэнзимов как в отдельности, так и в сумме не было достоверным (р 0,05)(см. «рис 22»). При сравнении с контрольной группой животных PBN достоверно предотвращал падение общего пула коэнзимов Q9, Q9+Q10 (р 0,05) в ипсилатеральном полушарии (см. «рис.23») при минимальном влиянии на пул восстановленных форм коэнзимов.
Сохранность общего пула коэнзимов является, по-видимому, проявлением протективного действия PBN на зону ишемиии, определяющим сохранность большего количества жизнеспособных клеток, способных синтезировать коэнзимы. Влияние PBN на восстановленную форму коэнзимов, выполняющую основную антиоксидантную функцию, минимальна, что может быть обусловлено большей скоростью взаимодействия образующихся свободных радикалов с убихинолом и убисемихиноном по сравнению с экзогенно введенной «ловушкой» АФК. В литературе имеются данные о влиянии PBN на митохондриальную дисфункцию(Ро1Ьеггоуа J., et al., 1995; Kuroda S., et al.,1996), представляющей собой один из источников генерации АФК. Можно предположить, что нормализация работы дыхательной митохондриальной цепи на фоне приема PBN ведет к повышению регенерации убихинона и увеличению концентрации восстановленной формы. Однако, продолжающаяся при ишемии продукция АФК, требующая для своей нейтрализации дополнительные антиоксиданты, нивелирует данный эффект PBN. В исследовании Barclay L.R.C., Vinqvist M.R.(2000) в опытах in vitro было показано, что PBN эффективен, в отношении первичных АФК, в то время как за нейтрализацию образующихся пероксильных радикалов фосфолипидов несут ответственность эндогенные антиоксиданты: а-токоферол и убихиноны.
Изменения содержания а-токоферола в ипсилатеральном полушарии по сравнению с контралатеральным на фоне приема. PBN не являются статистически значимыми (р 0,05). В тоже время не отмечается достоверной разницы в содержании а-токоферола в ипсилатеральном полушарии между контрольной группой и лечеными PBN животными (р 0,05).
В литературе имеются данные о содержании коэнзимов и о токоферола в организме животных и человека при различных патологических состояниях (Grieb P., et al., 1997; Beal M.F., Matthews R.T., 1997; Battino M., et al., 1998; Maulik N., et al., 2000). Фармакологическая коррекция данных изменений в большинстве работ представлена в виде заместительной терапии, восполняющей существующей дефицит экзогенным введением коэнзимов и витамина Е с пищей (Beal M.F., Matthews R.T., 1997; Matthews R.T., et al., 1998; Maulik N., et al., 2000; Beal M.F.,2002; Ferrante R.J., et al., 2002).
В нашей работе впервые было показано защитное действие экзогенного антиоксиданта - PBN - на уровень коэнзимов Q9, Q10 и а-токоферола в ткани головного мозга при ишемии, проявившееся в большей степени по отношению к общему пулу коэнзимов Q9, Q10.
