Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 10
1.1 Обзор существующих препаратов на основе березового гриба чаги и области их применения 10
1.2 Технология получения водных извлечений чаги в промышленных и бытовых условиях 14
1.3 Влияние технологии получения на физико-химические свойства водных экстрактов чаги 18
1.3.1 Теоретические основы экстрагирования 18
1.3.2 Основные факторы, влияющие на процесс экстрагирования 24
1.3.3 Влияние способа получения водного извлечения чаги на состояние его коллоидной системы, проявление антиоксидантных и терапевтических свойств 28
1.4 Химический состав чаги, её водных извлечений и меланина 30
1.5 Применение микроволнового воздействия для интенсификации физико-химических процессов 35
1.5.1 Характеристика микроволн и особенности их воздействия 36
1.5.2 Области применения и исследования микроволнового воздействия на биологические объекты 40
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 49
2.1 Выбор объектов и материалов исследований 49
2.2. Методы получения водных извлечений из чаги 50
2.2.1. Получение водных извлечений чаги методом ремацерации 50
2.2.2 Получение водных извлечений чаги с применением микроволновой обработки 50
2.3 Способы выделения меланина из водного извлечения чаги 61
2.3.1 Осаждение хлористоводородной кислотой 61
2.3.2 Осаждение меланина 1% раствором гидроксида калия в этаноле 61
2.3.3 Осаждение водных извлечений чаги хлоридом кальция 61
2.3.4 Осаждение водного извлечения чаги трихлоруксусной кислотой 65
2.4 Протеолиз водных извлечений чаги ферментами желудочно-кишечного тракта 67
2.4.1 Исследование условий протекания протеолиза 67
2.4.2 Протеолиз водных извлечений чаги, полученных мацерацией с СВЧ обработкой ферментами желудочно-кишечного тракта 77
2.5 Общие методы анализа 80
2.5.1 Хроматография 80
2.5.2 Тонкослойная хроматография 81
2.5.3. Определение белка 81
2.5.4 Определение количества аминокислот 82
2.5.5 Проведение горизонтального электрофореза меланина 82
2.5.6 Определение антиоксидантной активности 83
2.5.7 Определение размера частиц методом фотонно-корреляционной спектроскопии (ФКС) 83
2.5.8 Определение острой токсичности 83
2.5.9 Рентгенофлуоресцентный анализ 84
2.5.10 Рентгеноструктурный анализ 85
2.5.11 Методы статистической обработки результатов экспериментов 86
ГЛАВА 3. Обсуждение результатов 87
3.1 Установление оптимальных условий проведения экстракции чаги с СВЧ обработкой 87
3.2 Выделение меланина различными осаждающими агентами 97
3.3 Протеолиз водных извлечений чаги ферментами желудочно- кишечного тракта 115
Выводы 128
Список использованных источников 130
Приложение 151
- Технология получения водных извлечений чаги в промышленных и бытовых условиях
- Области применения и исследования микроволнового воздействия на биологические объекты
- Протеолиз водных извлечений чаги, полученных мацерацией с СВЧ обработкой ферментами желудочно-кишечного тракта
- Протеолиз водных извлечений чаги ферментами желудочно- кишечного тракта
Введение к работе
Актуальность работы. Водные извлечения (ВИ) гриба чаги широко применяются в косметике и медицине, в том числе для профилактики и лечения онкологических заболеваний различной этиологии. ВИ чаги представляют собой коллоидную систему, дисперсной фазой которой, а так же и основным компонентом, обеспечивающим их терапевтическую эффективность, является хромогенный комплекс или меланин чаги. ВИ чаги получают с использованием различных методов экстракции: мацерацией, ремацерацией, реперколяцией, - однако все эти процессы длительны и энергоёмки. Интенсификация процессов экстракции при производстве галеновых препаратов является актуальной задачей, так как позволяет усовершенствовать технологический процесс этой стадии производства, рационально использовать ценное лекарственное сырьё, повысить эффективность извлечения экстрактивных веществ, а также во многих случаях повысить активность получаемых препаратов. Для интенсификации экстракции чаги в работе использованы СВЧ (сверхвысокие частоты), ранее не применявшиеся в технологиях получения извлечений из этого сырья.
Цель работы. Разработать способ получения ВИ чаги с использованием СВЧ, определить их физико-химические свойства и безопасность применения.
Для достижения цели решались следующие задачи:
разработать способ экстракции чаги с применением СВЧ;
определить устойчивость дисперсных фаз ВИ чаги, полученных различными способами экстракции, по отношению к различным осаждающим агентам и исследовать физико-химические свойства полученных меланинов;
для определения безопасности ВИ, полученных с применением в экстракции СВЧ:
разработать методику проведения гидролиза ВИ чаги ферментами желудочно-кишечного тракта, по аналогии с процессами, происходящими с ними in vivo;
определить наиболее безопасный режим СВЧ при получении ВИ чаги.
Научная новизна работы. Впервые для интенсификации процесса экстракции чаги применены СВЧ.
Для выделения меланинов из ВИ чаги впервые в качестве осаждающих агентов использованы хлорид кальция и трихлоруксусная кислота, определен их минеральный состав и размер частиц.
Впервые для оценки безопасности ВИ и меланинов чаги разработана и применена методика получения гидролизатов ВИ чаги - модели гидролизатов этих извлечений, получающихся in vivo, исследование которых подтвердило безопасность ВИ чаги, полученных мацерацией с СВЧ обработкой.
Практическая ценность работы. Предложенные способы получения ВИ чаги – мацерацией с СВЧ обработкой позволили более чем в три раза сократить как длительность процесса, так и его энергоёмкость. Меланин из ВИ чаги выделен с помощью хлорида кальция, это позволило повысить его выход, изменить его структурную организацию, а также компонентный состав по сравнению с меланином, осаждённым хлористоводородной кислотой. Разработанные подходы позволяют повысить эффективность извлечения биологически активных компонентов из сырья чаги, обеспечить безвредность получаемых продуктов и поэтому могут быть рекомендованы для применения на фармацевтическом производстве.
Внедрение результатов исследования. По способу получения ВИ чаги с применением в экстракции СВЧ получен патент на изобретение. Результаты исследований внедрены в учебный процесс Казанского государственного технологического университета в дисциплине «Физиолого-биохимические основы разработки продуктов детского питания».
На защиту выносятся:
способы экстракции чаги с применением СВЧ и результаты исследования ВИ чаги и меланинов;
способы выделения меланина с применением хлористого кальция и трихлоруксусной кислоты;
экспериментальные данные по разделению хромогенов и белковых фракций ВИ чаги с применением зонального электрофореза;
экспериментальные данные исследований протеолиза ВИ чаги, полученных с применением СВЧ обработки, in vitro ферментами желудочно-кишечного тракта;
результаты исследования гидролизатов ВИ чаги, полученных с применением СВЧ обработки, и выделенного из них меланина.
Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на: Межрегиональной конференции молодых ученых «Пищевые технологии» (Казань, 2004 г.); III Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2007 г.); 2-ой международной научно-практической конференции (Тамбов, 2009 г.); ХI Международной конференции молодых учёных «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2010 г.); VI Всероссийской конференции «Химия растительных веществ» (Санкт-Петербург, 14-18 июня 2010 г.).
Публикации. Основные результаты работы изложены в 2 статьях, рекомендованных ВАК, 7 публикациях по материалам конференций, 1 патенте на изобретение.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трёх глав, выводов, библиографического списка. В тексте приведены ссылки на 191 литературных источника. Работа изложена на 157 страницах машинописного текста, содержит 17 рисунков, 33 таблицы.
Технология получения водных извлечений чаги в промышленных и бытовых условиях
Первой лекарственной формой препарата из чаги являются водные экстракты, которые получены способом противоточной экстракции.
Экстракция измельченного сырья водой осуществлялась по принципу противотока в диффузионной батарее, состоящей из шести диффузоров, при последовательно повышающейся температуре от 45С до 80С. Продолжительность настаивания в каждом диффузоре составляла 1 час, соотношение сырья и экстрагента 1:2 или 1:2,5. Этот способ позволяет получить экстракты с концентрацией 6-9% сухих веществ [15,16].
Внедренный еще в 50-х годах двадцатого столетия способ противоточной экстракции и на сегодняшний день остается основным при промышленном производстве водных экстрактов чаги. Позднее разработанные лекарственные препараты на основе чаги представляли собой сгущенный, осажденный, высушенный или иным способом преобразованный водный экстракт, полученный именно этим методом.
Ввиду неустойчивости при хранении и неудобстве при транспортировке, водные экстракты увариваются под вакуумом при температуре не выше 50С и остаточном давлении не более 50 мм рт. ст. до получения густого экстракта с содержанием 30-32% сухого вещества. Эта форма препарата после всесторонней клинической проверки начинает выпускаться фармацевтическими заводами под названием «Экстракт из березового гриба чаги (густой)». Содержание зольных веществ в препарате составляет 25-29% [17].
С целью получения препаратов со сниженным содержанием зольных элементов создаются новые лекарственные формы препаратов чаги: «осажденный» или «обеззоленный» препарат, который получают путем выделения высокополимерного полифенолоксикарбонового комплекса (в дальнейшем, отнесенного к классу меланинов) из чаги различными электролитами, а также осаждением его совместно с белками при соответствующих значениях рН среды [18]. Другая форма - «БИН-чага» [19], оба препарата выпускались в таблетированной форме.
Сухой препарат из чаги, выпускаемый в виде таблеток или капсул, получали в распылительных или вакуум-вальцовых сушках из уваренного под вакуумом концентрата, содержащего около 20% сухих веществ [16].
С 1960 года и до настоящего времени на многих химико-фармацевтических заводах налажен выпуск препарата «Бефунгин». «Бефунгин» - полугустой экстракт, получаемый увариванием водных извлечений чаги до содержания сухих веществ 20%, с последующим введением в препарат солей кобальта и спирта. Водные извлечения получают по принципу противотока в диффузионной батарее, состоящей из 3-6 диффузоров, с общей продолжительностью экстракции от 6 до 12 часов [4,5,6].
С развитием новых технологий появилось большое количество способов изготовления сухих экстрактов и порошков чаги.
В Томском государственном университете разработан сухой экстракт Inonotus obliquus, который рекомендуется в виде водорастворимого порошка без добавок. Предлагаемая технология получения — ультразвуковая экстракция. Сырье предварительно замачивают в дистиллированной воде при температуре 30С, экстракцию проводят в две стадии с помощью ультразвука частотой 20-55 кГц, интенсивностью 0.1-2.3 Вт/см" в течение 50-60 минут при соотношении сырье: экстрагент, равном 1: 10 - 1: 15 на каждой стадии, затем экстракты объединяют и сушат на тонкой пленке. Этот метод позволяет увеличить выход целевого продукта до 92-95%. Новый препарат прошел клинические испытания на животных и показал противоязвенную и адаптогенную активность [20,21].
В 1997 году разработан способ получения порошка чаги, включающий криопомол, то есть измельчение чаги в кавитационном диспергаторе в среде охлаждающего реагента. Полученный тонкодисперсный порошок с размером частиц менее 60 мкм является биологически активным и может использоваться для приготовления и последующего приема в виде настоя [22].
В 2001 по прототипу криопомола предложен способ, в котором сырье предварительно обрабатывают инертным сжиженным газом - азотом и/или гелием. После чего осуществляют сушку путем вакуумной сублимации до остаточной влажности чаги 1-8%. Предварительную обработку свежезаготовленного сырья инертным сжиженным газом ведут в течение 30-60 минут, причем соотношение сырья и инертного сжиженного газа в процессе предварительной обработки и измельчения составляет (1:1) — (1:3). Полученный порошок с размерами частиц 15-20 мкм показал хорошие результаты при проведении испытаний на крысах на радиопротекторную активность и способность коррекции аминокислотного состава кроветворной ткани костного мозга при внешнем облучении [23,24].
На базе Казанского государственного технологического университета разработан способ .получения водных экстрактов чаги способом ремацерации. Полученные водные извлечения по показателям выхода меланина и физико-химическим свойствам значительно превышают промышленно получаемые аналоги. Процесс экстракции проводят в две стадии настаивания при температуре 70С при соотношении сырья и экстрагента 1:10 и общем времени настаивания 10 ч [25]. В народной медицине известно много рецептов приготовления настоев из плодовых тел чаги в домашних условиях. Получение настоя из чаги в бытовых условиях возможно только в форме разбавленных, мало стойких водных экстракций, требующих использования их в течение 6-7 дней после изготовления. Для приготовления Тамгымъяка (лекарственный настой) гриб заливают горячей водой (1:4) и оставляют на некоторое время, затем измельчают. К измельченной массе добавляют 5 частей горячей воды и настаивают в течение 2 дней. Верхний слой воды сливают, а осадок отжимают. Принимают по 50-100 мл 3-4 раза в день. Чай из чаги готовят следующим образом: кусок чаги размером с грецкий орех положить в чайник, залить некрутым кипятком и настаивать 10 минут [16]. Существует еще немало народных рецептов приготовления целебных напитков на основе чаги. Ниже приведены некоторые из них. Свежий гриб промыть и натереть на терке, сушеный предварительно замочить на 15 минут в холодной воде. На 1 часть грибного порошка взять 5 частей кипяченой воды с температурой не выше 50С. Смесь настаивать двое суток, затем процедить и отжать осадок в настой. Принимать по три стакана в день, за полчаса до еды. Настой хранить в холодном месте не более 4 суток. На 1 стакан измельченной в порошок чаги взять 5 стаканов горячей, но не кипяченой воды. Смесь прогреть в водяной бане 4 часа, так чтобы вода в бане кипела, а смесь нет. Пить перед едой по 1 ст. ложки 3 раза в день. Залить гриб водой, настаивать 4 часа, затем натереть на мелкой терке или пропустить через мясорубку. Воду, в которой размачивали гриб, сохранить. Взять на 1 часть гриба 5 частей теплой кипяченой воды и настаивать двое суток. Жидкость слить, отжать туда осадок. Добавить воду, оставшуюся после размачивания гриба. Принимать по 1 ст. ложки 3 раза в день перед едой. Хранить в холодном месте не более 5 дней.
Области применения и исследования микроволнового воздействия на биологические объекты
Микроволновое излучение способно в десятки и сотни раз ускорять многие химические реакции, вызывать быстрый объемный нагрев жидких и твердых образцов, эффективно (быстро и полностью) удалять влагу из твердых, в том числе и высокопористых препаратов, модифицировать свойства различных сорбентов.
В настоящее время интенсификация под воздействием микроволнового излучения применяется во многих промышленных процессах: обработки пищевых продуктов, сушки и склеивания древесины, производстве фарфоровых и фаянсовых изделий, в строительстве, при разработке нефтяных месторождений [59].
Если в фармацевтической индустрии, отчасти из-за неполной изученности оказываемых эффектов, микроволновая обработка только начинает находить своё применение, то в смежных областях она исследуется и используется уже давно.
Ещё в 30-х годах двадцатого века, в связи с активными исследованиями в области изучения влияния волн микроволнового диапазона на человека и животных [65-68], в научной и медицинской литературе появились первые работы, посвященные применению микроволнового излучения (СВЧ) в медицине [69-72]. Для применения теплового эффекта микроволн проводились диагностические исследования воздействия электромагнитного излучения на различные ткани человека. Были измерены такие характеристики тканей, как: коэффициенты поглощения, коэффициенты отражения на границах между различными тканями, величина нагрева тканей, суммарное количество энергии, поглощаемой телом, характеристики рассеяния [73].
Действие микроволн на организм разделяют на непосредственное влияние микроволн на ткани организма и возникновение нейрорефлекторных и нейрогуморальных реакций целостного организма. Первичное влияние возникает в зоне непосредственного воздействия и состоит из теплового и нетеплового компонентов.
Преимущественное нагревание мышц и кожи связано с наличием в них большого количества жидкости, в особенности воды. Существенный вклад вносит также дисперсия и поглощение в протоплазме и ядре биологической клетки, имеющих ионную проводимость [74].
Нетепловой компонент возникает в сложных биоколлоидных системах (изменение осмотического давления, поверхностного напряжения, проницаемости клеточных мембран, коллоидного состояния цитоплазмы и межклеточной жидкости, ориентирование элементов крови и поляризованных ветвей белковых макромолекул в направлении силовых линий электромагнитного поля, резонансное поглощение энергии колебаний отдельными макромолекулами, аминокислотами и др.) и приводит к различным внутримолекулярным физико-химическим и электрохимическим изменениям, а также к структурным перестройкам. При малой мощности преобладает нетепловой компонент воздействия, а при большой мощности -тепловой компонент [75-80].
Вторичный фактор лечебного действия микроволн определяется влиянием поглощенной энергии на рецепторы тканей, возникновением начального рефлекса хемо-, баро-, термо-рецепторов в зоне воздействия, образованием биологически активных веществ, вызывающих раздражение рецепторов вне зоны воздействия (гуморальный компонент) и обуславливающих общее физиологическое действие через регулирующие механизмы. При воздействии микроволнового излучения на определенные участки тела повышается температура, увеличивается обменная деятельность, расширяются кровеносные сосуды, увеличивая циркуляцию крови. При этом происходит ускорение заживления тканей и усиление защитных реакций организма. Лечение микроволнами показано при ревматизме и других заболеваниях суставов [81-85]. СВЧ терапия обладает противовоспалительным, бактериостатическим, болеутоляющим, спазмалитическим действием, оказывает регулирующее, стимулирующее влияние на нервную, эндокринную систему, обмен веществ. Под действием микроволн отмечается нормализация тонуса магистральных и периферических сосудов, активация процессов микроциркуляции (ускорение тока крови в капиллярах, их расширение), повышение оксигенации крови, регуляция сосудистой проницаемости, улучшение окислительно-восстановительных процессов и трофики тканей. В Центральном институте курортологии и физиотерапии под руководством член-корреспондента АМН СССР профессора А. Н. Обросова проводились обширные исследования применения микроволн для физиотерапии [86]. Ряд обзоров посвящен лечебному действию микроволн [87-88]. В современной литературе описаны методы лечения опухолей лица воздействием СВЧ излучения: СВЧ гипертермия и СВЧ криодеструкция [89-91]. Американские радиологи из Колумбийского центра по исследованию рака обнаружили, что СВЧ излучение уничтожает раковые клетки, при этом не повреждая здоровые ткани. В отличие от других видов воздействия, СВЧ легко фокусируется в заданной точке организма, например в опухоли. Кроме того, благодаря особенностям метаболизма раковые клетки поглощают электромагнитную энергию в несколько раз активнее, чем здоровые ткани. Обнаружено, что при СВЧ воздействии раковые опухоли растут гораздо медленнее, чем без лечения, а кожа вокруг них не повреждается [92].
Микроволновая обработка позволяет значительно интенсифицировать технологические процессы производства пищевых производств, связанные с нагревом и сушкой продукции. Показана эффективность комбинирования микроволнового нагрева с традиционными способами энергоподвода, такими как варка, сушка, стерилизация, пастеризация, размораживание, сублимация и ряд других. Микроволновая обработка позволяет реализовать безотходные и энергосберегающие технологии в пищевой промышленности, значительно увеличить выпуск готовой продукции без больших капитальных затрат на строительство предприятий, улучшить санитарно-гигиенические условия труда.
Тепловая обработка пищи в СВЧ поле обеспечивает очень быстрое приготовление пищи по сравнению с традиционными способами, поэтому не только не снижает пищевой ценности продуктов, но в них более полно сохраняются витамины.
Протеолиз водных извлечений чаги, полученных мацерацией с СВЧ обработкой ферментами желудочно-кишечного тракта
Рентгеноструктурный анализ - это метод исследования структуры вещества по распределению в пространстве и интенсивностям рассеянного на анализируемом объекте рентгеновского излучения, использующий явление дифракции рентгеновских лучей Дифракционная картина зависит от длины волны используемых рентгеновских лучей и строения объекта.
В ходе рентгеноструктурного анализа исследуемый образец помещают на пути рентгеновских лучей и регистрируют дифракционную картину, возникающую в результате взаимодействия лучей с веществом. На следующем этапе исследования анализируют дифракционную картину и расчётным путём устанавливают взаимное расположение частиц в пространстве, вызвавшее появление данной картины [128, 129].
Рентгендифракционные исследования выполнены в Отделении рентге-ноструктурных исследований Центра коллективного пользования ЦКП САЦ на базе Лаборатории дифракционных методов исследования ИОФХ им. А.Е.Арбузова КазНЦ РАН. Порошковые дифрактограммы получены на автоматическом рентгеновском дифрактометре Bruker D8 Advance, оборудованном приставкой Vario и линейным координатным детектором Vantec. Использовано Си Ка излучение, монохроматизированное изогнутым монохроматором Иохансона, режим работы рентгеновской трубки 40 kV, 40 mA. Эксперименты выполнены при комнатной температуре в геометрии Брэгг-Брентано с плоским образцом. Образец в виде порошка наносился на поверхность стеклянной пластинки. Во время проведения эксперимента образец вращался со скоростью 15 об/мин. Дифрактограмма регистрировалась в диапазоне углов рассеяния 20 3 - 70 , инкремент 0.016, время набора спектра в точке 1 сек. Для каждого из образцов было получено несколько дифрактограмм в различных экспериментальных режимах и с различным временем набора данных [130].
Обработку экспериментальных данных проводили с использованием программного пакета «Statistica 6.0» [131].
Глава посвящена изучению способов получения водных извлечений чаги и выделяемых из них меланинов. Описаны различные технологии экстракции чаги с применением микроволнового воздействия. Структурная организация и состав образованных коллоидных систем, а также осажденных из них меланинов, могут существенно различаться в исследуемых объектах. Это должно отражаться на их физико-химических и биологических свойствах.
Результаты работы могут быть использованы для выбора метода получения водных извлечений и меланинов со специфическими свойствами.
Процесс извлечения необходимых лекарственных веществ из растительного материала осложняется рядом факторов [132]. Основными, из них являются природа и химический состав этого материала, а также способ проведения экстракции [133]. Наличие в природном сырье клеточной стенки, мембраны, перегородки, ее строение, наличие лигнина и других компонентов значительно сказывается на возможности, скорости и степени извлечения биологически активных веществ [134]. Для повышения эффективности экстракции используются различные методы [135, 136, 137]. Одной из основных задач при этом является ускорение процесса массопереноса. Известно, что микроволновая обработка ускоряет многие химические реакции, позволяет произвести равномерный и быстрый нагрев, кроме того способствует созданию локального давления, появлению механических изменений в структуре биологической ткани [138]. В настоящее время уже существуют разработки и модели проведения экстракции с применением СВЧ облучения [139, 140]. Однако, ввиду различий используемых объектов экстрагирования, а так же особенностей извлекаемых биологически активных веществ, единого, универсального метода не существует.
В зависимости от свойств и состава обрабатываемого сырья, мощности и времени СВЧ обработки, микроволновое поле оказывает различное воздействие. Поэтому для разработки получения экстракта из конкретного вида сырья необходимо подобрать определенные оптимальные условия экстрагирования.
При проведении экстракции чаги этот процесс осложняется тем, что получаемое водное извлечение представляет собой сложную полидисперсную коллоидную систему. Основным действующим компонентом, обеспечивающим терапевтическую активность полученных извлечений, считается меланин [141]. Кроме меланинов водой извлекаются также фенолы, флавоноиды, ароматические и алифатические кислоты, белки, полисахариды, зольные элементы, и другие вещества. Эти соединения находятся как в свободном, так и в связанном с хромогенами состоянии. Кроме высокого содержания меланина в извлечении, необходимо получить его в конформационном состоянии и составе с наиболее высокими биологическими и терапевтическими свойствами. Одним из способов экстракции чаги, удовлетворяющим этим условиям является ремацерация [142], применение которой позволяет получить наилучшие результаты: извлечения с высоким выходом меланина и высокой антиоксидантной активностью извлечений и меланинов. На основании этого при разработке нового способа экстракции чаги в качестве сравнения был выбран именно этот способ. Процесс протекает в две стадии настаивания при температуре 70С и в целом длится десять часов [106].
Для интенсификации существующей технологии была применена микроволновая обработка. Исследованы различные режимы работы СВЧ печи, время и кратность СВЧ обработки, настаивание при различных температурах до и после СВЧ обработки, различное соотношение экстрагента и сырья.
С целью выбора режимов СВЧ обработки были подобраны мощность и время выдержки в СВЧ печи. Согласно литературным данным, для сохранения терапевтической активности водных извлечений чаги, температура при экстракции не должна превышать 70С [31].
Определено, что соответствующий нагрев в СВЧ печи происходит в режиме 90 Вт в течение пяти минут, в режиме 180 Вт в течение двух минут и в режиме 360 Вт в течение 1 минуты (таблица 2.1). При увеличении этого времени при соответствующих мощностях или при увеличении мощности обработки в СВЧ печи образцы перегревались и закипали, что неприемлемо в соответствии с требованиями к технологии проведения экстракции чаги [53] и могло сказаться на структуре, составе и активности меланина.
Исследование температурного нагрева в СВЧ печи первоначально проводилось в расчете на массу обрабатываемого сырья, равную пяти граммам. Впоследствии аналогичное исследование было проведено в расчете на 10 и 20 грамм сырья (таблица 3.1). В результате было установлено, что увеличение массы вдвое увеличивает время нагревания образца до 70С и выход меланина в два раза.
Протеолиз водных извлечений чаги ферментами желудочно- кишечного тракта
Наибольшему изменению в процессе СВЧ обработки могут подвергаться именно белки водного извлечения чаги [63]. Это связывают с воздействием микроволнового поля на структурные параметры белковых молекул и, в частности, на состояние их функциональных групп (сульфгидрильных, дисульфидных, карбоксильных, аминогрупп и других). Кроме того, существуют предположения, что в процессе СВЧ обработки они могут денатурировать [103, 104, 105]. В этом случае, их протеолиз ферментами желудочно-кишечного тракта в организме человека будет приводить к образованию пептидов иной молекулярной массы, которые могут быть токсичными.
Для определения возможности таких изменений разработан метод по проведению протеолиза водных извлечений чаги ферментами желудочно-кишечного тракта в условиях, близких к происходящим в организме человека [109].
Согласно литературным источникам, подобные методики широко используются в промышленности для получения новых форм пищи, биологически активных добавок, гипоаллергенных препаратов [55-57, 174-176].
Полнота ферментативного гидролиза определяется физическим состоянием субстрата. Нативный белок если и подвергается протеолизу, то вероятнее всего, что такой гидролиз будет ограниченным. Однако в случае необходимости получения фрагментов белка, обладающих частичной биологической активностью, этот метод вполне применим. В общем случае для обеспечения полноты гидролиза белок денатурируют с обязательным восстановлением дисульфидных связей [177]. Однако для исследования превращений конкретного объекта в организме человека этот метод неприменим. Подбор оптимальных условий гидролиза осуществляют, варьируя четыре основных параметра: состав буфера, соотношение фермент: субстрат, температуру и время [177]. В случае воссоздания условий, близких к происходящим в организме, регулируются лишь последние три параметра.
Обычно ферментативный гидролиз проводят при соотношении фермент: субстрат равном 1:50-1:100. В некоторых случаях для достижения полноты гидролиза соотношение приходится уменьшать (до 1:10). Чаще всего гидролиз проводят при 37С, в этих условиях большинство ферментов проявляют свою наибольшую активность [177]. Так как именно эта температура поддерживается в пищеварительной системе человека, для проведения протеолиза чаги ферментами желудочно-кишечного тракта была выбрана именно она.
Согласно литературным данным, для полного ферментативного гидролиза инкубацию с ферментом проводят в течение 2-4 ч. Для гидролиза нескольких связей, наиболее чувствительных к действию фермента продолжительность инкубации могут сокращать до 10 минут. В случае некоторых ферментов, или особенно стабильных субстратов, продолжительность гидролиза увеличивают до 16-24 ч.
Ферментативная реакция может быть остановлена различными приемами: изменением рН, кипячением, при получении различных продуктов на основе гидролизатов в промышленности часто используют замораживание с последующим лиофильным высушиванием. В некоторых случаях, в особенности при проведении ограниченного протеолиза, реакцию прерывают с помощью специфических ингибиторов [177].
В данной работе протеолиз проводили в две стадии. На первой стадии использовали препарат «желудочный сок» или препарат «ацидин-пепсин», на второй стадии - препарат «Энзистал», содержащий ферменты поджелудочной железы. В процессе подбора оптимальных условии протеолиза варьировалось время протекания гидролиза, количество вводимых ферментных препаратов и водного извлечения чаги (таблицы 2.12-2.15).
При проведении исследования процесса протекания протеолиза водного извлечения чаги учтена специфика исследуемого объекта. Сложная структура меланина, наличие минеральных и иных компонентов, влияющих на цветность, состояние коллоидной системы делают невозможным применения ряда методик для анализа гидролизата и водного извлечения чаги. Ферменты имеют белковую природу и для получения достоверных результатов по накоплению продуктов протеолиза, отдельно исследовали применяемые препараты.
Массовая доля сырого протеина чаги, определённая по методу Кельдаля [178], составляет 2,772% от сухого остатка. Содержание белка в водном извлечении чаги, определённое по методу Флореса [117], составляет 0,5-0,8% от сухого остатка водного извлечения чаги. Его содержание в фильтрате, после осаждения меланина, составляет около 0,14% от сухого остатка водного извлечения чаги. Следовательно, основная часть белка водного извлечения чаги находится в связанном с меланином состоянии. Поэтому его доступность для действия протеаз желудочного сока может быть ограничена.
При попадании в желудок водное извлечение чаги попадает в среду с рН 1-3,5, при этом, in vivo, наблюдается седиментация дисперсной фазы изучаемой коллоидной системы. Попадая в желудок (рН 2) белки гидролизуются ферментами желудочного сока до пептидов. Необходимо подтвердить способность пепсинов желудочного сока проводить протеолиз белков водного извлечения чаги. Переход содержимого желудка в двенадцатиперстную кишку, приводит к изменению рН до 7,8, при этом, меланин должен переходить в растворённое состояние. Это должно облегчить протекание протеолиза ферментами поджелудочной железы
Так как в исследуемых объектах достаточно низкое содержание белка, большая часть которого находится в связанном с меланином, труднодоступном состоянии, количественное определение требуемого времени проведения протеолиза и соотношения субстрата и ферментов весьма затруднительно. Поэтому на первом этапе определение оптимальных параметров гидролиза осуществляли с помощью одного из традиционных методов анализа превращений белка - хроматографии. Протекание гидролиза регистрировали по накоплению аминокислот сначала с помощью бумажной хроматографии (рисунки 2.3-2.6). На хроматограммах видно, что уже при обработке желудочным соком анализируемого объекта наблюдается распад белков, в основном до крупных пептидов. Пептиды, образующиеся в ходе протеолиза водного извлечения чаги препаратом «желудочный сок» проявляются в виде фиолетовых пятен, расположенных близко к точкам нанесения. Аминокислоты практически не высвобождаются. После обработки препаратом «Энзистал» гидролиз протекает более полно и наблюдается распад белков и пептидов до аминокислот, проявившиеся на хроматограмме пятнами различного цвета.
Похожие диссертации на Свойства водных извлечений и меланинов чаги, полученных с применением СВЧ
