Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Химический состав гриба чаги и препараты на его основе 9
1.1 Химический состав чаги 9
1.1.1 Химический состав водных извлечений из чаги 13
1.1.2 Спиртовые экстракты из чаги 16
1.2 Лекарственные препараты на основе чаги 20
1.2.1 Препарат «Бефунгин» 22
1.2.2.Чаговит иЧаголюкс 25
1.2.3 Спиртовые настойки из чаги 26
Глава 2. Материалы и методы 29
2.1 Получение и анализ водных извлечений из чаги 29
2.2 Объекты исследования 31
2.2.1 Экстракция шрота чаги спиртом 31
2.2.1.1 Получение спиртовых экстрактов из шрота чаги 31
2.2.1.2 Анализ спиртовых экстрактов из шрота чаги 32
2.2.1.3 Оптимизация условий экстракции шрота чаги спиртом 35
2.2.1.4 Анализ меланинов и осадков, выделенных из спиртовых экстрактов шрота чаги 36
2.2.1.4.1 Анализ меланина 36
2.2.1.4.2 Анализ садка 36
2.3 Получение и анализ хлороформных экстрактов из шрота чаги 48
2.4 Получение и анализ метилтретбутиловых экстрактов шрота чаги 51
2.5 Получение косметических средств на основе спиртовых экстрактов шрота чаги 51
2.6. Общие методы анализа 55
2.6.1 Определение содержания экстрактивных веществ, золы и меланина 55
2.6.2 Определение углеводов антроновым методом 55
2.6.3 Определение фенолов фотометрическим методом 56
2.6.4. Определение общего количества гемицеллюлоз 56
2.6.5 Тонкослойная хроматография липидов 57
2.6.6 Тонкослойная и бумажная хроматография фенольных веществ 58
2.6.7 Тонкослойная хроматография терпеновых веществ 58
2.6.8 Тонкослойная хроматография лактонов 59
2.6.10 ВЭЖХ анализ экстрактов шрота чаги 59
2.6.11 Определение антиоксидантной активности 60
2.6.12 Определение размеров глобул меланинов методом фотонно-корреляционной спектроскопии 60
2.6.13 Статистическая обработка данных 61
Глава 3 Обсуждение результатов 62
3.1 Экстракция шрота чаги спиртом 63
3.1.1 Два способа экстракции шрота чаги 63
3.1.2 Исследование меланинов и осадков, выделенных из спиртовых экстрактов шрота чаги 78
3.2 Экстракция шрота чаги хлороформом 98
3.3 Экстракция шрота чаги метилтретбутиловым эфиром 102
3.4 Разработка косметических средств на основе спиртовых экстрактов из шрота чаги 107
Выводы 110
Список использованных источников 112
Приложение 133
- Лекарственные препараты на основе чаги
- Получение и анализ хлороформных экстрактов из шрота чаги
- Получение косметических средств на основе спиртовых экстрактов шрота чаги
- Экстракция шрота чаги метилтретбутиловым эфиром
Введение к работе
Актуальность работы. В настоящее время фармацевтическая промышленность выпускает на основе водных извлечений из гриба чаги препарат Бефунгин. Отходом этого производства является шрот, состав веществ остающихся в нём не исследован. Водой из чаги экстрагируется около 25% сухих веществ гриба. В водном извлечении из чаги содержатся меланин, фенольные вещества, полисахариды и неорганические соединения. Меланин чаги проявляет высокую антиоксидантную активность и является основным действующим компонентом, обеспечивающим терапевтическую активность препарата Бефунгин и водных извлечений из чаги. Их применяют в афицинальной медицине для лечения онкологических заболеваний. Получение дополнительного выхода биологически активных веществ (БАВ), в том числе и меланина, из шрота чаги является актуальной задачей. Это позволит разработать на основе экстрактов из шрота чаги новые лекарственные препараты.
Цель работы: разработать способы экстракции шрота чаги и изучить состава и свойств полученных экстрактов.
Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:
- выявить оптимальный экстрагент и способ проведения экстракции шрота чаги;
- использовать математическое планирование эксперимента для получения максимального выхода БАВ в спиртовых экстрактах;
- изучить состав и свойства спиртовых и хлороформных экстрактов, а также экстракта, полученного с помощью метилтретбутилового эфира (МТБЭ экстракт);
- определить параметр для стандартизации лекарственных препаратов, разрабатываемых на основе экстрактов из шрота чаги.
Методы исследований. Для изучения экстрактов из шрота чаги использован широкий спектр методов, который соответствует современному состоянию науки. Применены: различные виды хроматографии, ИК и электронная - спектроскопия, кондуктометрия, фотон -корреляционная спектроскопия (ФКС), методы химического и физико-химического анализа, а также стандартные методики определения физико-химических характеристик получаемых экстрактов и выделяемых соединений. Для оптимизации процессов получения экстрактов применён модуль планирования эксперимента, метод латинских параллелепипедов первого порядка, пакета STATISTICA 6.0.
Результаты измерений и исследований обрабатывались с применением методов математической статистики с использованием пакета программ STATISTICA 6.0.
Научная новизна работы. Впервые разработаны способы получения экстрактов из шрота чаги с применением органических растворителей.
Впервые показано, что при смене способа экстракции шрота чаги этиловым спиртом возможно получение экстрактов с преобладающим содержанием в них либо меланинов, либо фенольных веществ, обеспечивающих их высокую антиоксидантную активность (АОА).
Установлены закономерности извлечения экстрактивных веществ из шрота чаги в зависимости от типа экстрагента, температуры, времени, способа экстракции.
Показано, что меланин, выделенный из спиртового экстракта шрота чаги, схож по строению с меланином водного извлечения из чаги, имеет глобулы большего размера и превосходит его по антиоксидантной активности в два раза.
Впервые применён комплексный подход к исследованию качественного состава БАВ в экстрактах, полученных из шрота чаги.
Практическая ценность работы. Разработаны способы получения спиртовых и хлороформных экстрактов из шрота чаги с высокими антиоксидантными свойствами (АОС), превышающими аналогичные свойства водных извлечений чаги и спиртовых настоек, выпускаемых фармацевтической промышленностью.
Показана возможность стандартизации лекарственных препаратов на основе шрота чаги по их АОА.
Определён количественный и качественный состав экстрактов, полученных из шрота чаги, способных обеспечить их высокую биологическую активность.
Разработаны и апробированы рецептуры косметических средств на основе спиртового экстракта из шрота чаги.
Реализация результатов. Полученные результаты могут быть реализованы на предприятиях фармацевтической и косметической промышленности, что позволит значительно расширить ассортимент эффективных препаратов обладающих АОС, а также - в процессе обучения студентов и магистров по специальностям, связанным с производством и использованием БАВ.
На защиту выносятся:
- экспериментальные данные, полученные при применении различных способов экстракции шрота чаги с помощью органических растворителей;
- результаты математического планирования эксперимента по оптимизации экстракции шрота чаги для получения максимального выхода БАВ в спиртовых экстрактах;
- экспериментальные данные о составе и свойствах спиртовых, хлороформных и МТБЭ экстрактов из шрота чаги.
Личный вклад автора состоит в выборе объектов и методов исследований, непосредственном проведении основных экспериментов, систематизации и интерпретации полученных результатов, формулировании научных положений и выводов.
Апробация работы и публикации. Результаты работы докладывались и обсуждались на: Общероссийской конференции молодых ученых с международным участием «Пищевые технологии» (Казань 2006г.); IX и X Международных конференциях молодых учёных «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань 2008 г. и 2009г.); II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань 2008г.), 2-ой Международной научно-практической конференции «Интеграция науки и производства» (Тамбов 2009г.); II Региональной научно-практической конференции «Синтез и перспективы использования новых биологически активных соединений» (Казань 2009г.); IV Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул 2009г.).
Работа поддержана грантом ФПФСР МФП НТС «УМНИК-09» 2009 г..
По теме диссертации опубликовано 2 статьи в научных журналах, 8 тезисов докладов и получено 3 патента РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов, библиографического списка и приложения. В тексте приведены ссылки на 193 литературных источника. Работа изложена на 135 страницах машинописного текста, содержит 53 рисунка, 41 таблицу.
Лекарственные препараты на основе чаги
Чага — старинное излюбленное средство жителей северных и средних районов России для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний и даже рака. Чагу используют также при болезнях печени и желчных протоков, заболеваниях мочевыделительной системы и женской половой сферы, нервных расстройствах и сердечно-сосудистых заболеваниях. [86,87] В полевых условиях, в лесу пьют чай из чаги при расстройстве желудка, тяжести и болях в кишечнике. В некоторых районах жители вместо чая используют чагу. Было замечено, что в таких областях заболеваемость раком меньше, чем в соседних. Чагу используют как общеукрепляющее средство для повышения общего тонуса организма. Больного поят настоем чаги, если нужно снизить артериальное или венозное давление. Настоями чаги лечат пародонтоз, экзему, дерматит, псориаз. Ингаляциями с использованием чаги с травами снимают воспалительный процесс при опухолях гортани, что облегчает дыхание. Ссадины, порезы присыпают порошком чаги, чтобы прекратить нагноение раны. [88,89]
Чага нашла широкое применение и в официнальной медицине. Препараты чаги применяют при хронических гастритах, атонии кишечника, язве желудка для лечения полипозов. [90-102] В небольших дозах они улучшают течение обменных процессов в организме, являются биостимулятором. Препараты чаги замедляют рост опухолей различного происхождения и нормализуют деятельность желудочно-кишечного тракта. Настой чаги используют для лечения злокачественных опухолей различной локализации, если не показано хирургическое вмешательство или лучевая терапия. Настой улучшает общее состояние больного, замедляет развитие метастазов. Хорошие результаты получены при лечении чагой рака желудка, сопровождающегося понижением секреции желудочного сока. [91-100]
Отчетливое положительное действие чаги выявляется у больных раком пищевода четвертой стадии только при длительном ее применении и при сохранившейся у больных реактивности организма. Чага у таких больных вначале действует как тонизирующее средство, вызывая (за исключением крайне тяжело больных) отчетливое улучшение самочувствия и состояния. Стойкость этого улучшения видоизменяет клиническое течение заболевания, ведет к уменьшению или полному исчезновению болевых ощущений, а также к замедлению дисфагических явлений. Все это при длительном применении чаги приводит к удлинению жизни больных. [102-108]
Лечение больных раком молочной железы четвертой стадии позволяет прийти к заключению, что лечение чагой не только вызывает улучшение само чувствия, но при длительном ее применении ведет к замедлению распространения ракового процесса. Положительное действие чаги зависит от исходного состояния больных к началу лечения. [109-111]
При злокачественных опухолях гортани часто возникает реактивное воспаление окружающих опухоль тканей. В этих случаях целесообразно применять экстракт чаги в аэрозолях. Следует назначать чагу в виде ингаляций из расчета 40 г экстракта на 200 г воды. На курс лечения следует назначать 10 процедур с продолжительностью 5-6 минут. Как правило, после пяти ингаляций отмечается улучшение общего самочувствия, исчезают боли в области гортани, ликвидируется дисфагия, улучшается общее состояние, нормализуется сон, появляется аппетит, улучшается дыхание. [112-120]
Чага нетоксична, хорошо переносится и практически не имеет противопоказаний к применению. [117-119]
На сегодняшний день самым популярным препаратом на основе чаги является «Бефунгин». Это полугустой экстракт, получаемый при уваривании водных вытяжек чаги до содержания сухих веществ 20%, с введением в препарат солей кобальта и спирта.
Измельченную на вальцовой дробилке чагу экстрагируют горячей водой (70С) методом противотока на батарее из трех диффузоров с продолжительностью настаивания в каждом диффузоре - 1,5 часа. К концентрированному водному извлечению прибавляют расчетное количество кобальта хлористого и упаривают извлечение до готовности при давлении 0,06 МПа и температуре 75+5С после чего в экстракт вводят расчетное количество спирта этилового и фасуют. Определение качества препарата в соответствии с требованиями временной фармакопейной статьи проводиться на содержание меланина и кобальта. Содержание хромогенного комплекса в препарате должно быть не менее 6,5%. [37]
Изучение токсичности экстракта чаги на кроликах, кошках, белых мышах и собаках выявило отсутствие токсического действия чаги в дозах даже до 1 г сухого вещества на 1 кг массы, тела животного, тогда как оптимальная терапевтическая; доза для больного составляет около 20 мг на 1 кг массы тела человека.
В.В. Яцкевич, изучив состояние периферической крови таких больных в процессе лечения отметила, что у ряда больных ухудшение показателей крови под влиянием Бефунгина приостанавливается, а чаще эти показатели; улучша ются; [121] . Биохимические исследования крови больных с раком IV стадии, выполненные Н;Л. Матиссон и П:А. Якимовым, выявили у этих-.больных пониженную активность каталазы и протеазы, причем активность ферментов продолжала снижаться; по мере прогрессирования заболевания. Во время; лечения препаратом Бефунгині наблюдалось повышение ферментативной активности; более выраженное в отношении каталазы. [122]
Нормализующее действие препарата чаги? на обменные процессы было выявлено ЗІВ:. Ивановой при исследовании белков крови: При продолжительном лечении. Бефунгином у больных с раком IV стадии без явлений кахексии: длительно сохранялся нормальный уровень,белкового обмена;. [123]і
По данным МЛ: Березиной; действие Бефунгина на корковые центры проявлялось в том, что скрытый период двигательных реакций; укорачивался, а имевшие место парадоксальные реакции исчезали. МЛ; Березина и П:К Булатов при про ведении электроэнцефалографических исследований выявили повышение вольтажа спонтанных биотоков коры - аль фа-ритма, исчезновение патологических медленных волн; дельта-ритма, что свидетельствует о повышении? функций корковых нейронов под влиянием экстракта чаги. При лечений препаратом. чаги происходило выравнивание кожнотемпературных асимметрийг что связано с нормализацией нервнойрегуляции кожных сосудов и;, следовательно, функционального состояния соответствующих отделов нервной системы. Исследования фармакологических проб (адреналиновая эфедриновая, пилокарпи новая и аспириновая) выявили сдвиги в сторону нормализации измененных под влиянием болезни вегетативных реакций. [30]
Получение и анализ хлороформных экстрактов из шрота чаги
Получение хлороформных экстрактов шрота чаги. В колбу на 250мл с обратным холодильником помещали 10 г, шрота чаги (влажность 30%, размер частиц 5-7мм), заливали 100мл хлороформа, кипятили в течение 1 и 2 часов. После этого экстракт отделяли от шрота фильтрованием. Выход экстракта составляет 96±3 мл. Анализ хлороформных экстрактов из шрота чаги. В хлороформных экстрактах, полученных при кипячении в течение 1 часа (К1) и в течение 2 часов (К2), определяли содержание экстрактивных веществ и антиоксидантную емкость по методикам, описанным в п. 2.6.1-2.6.3. Данные приведены в таблице 17 Полученные экстракты К1 и К2 исследованы методом ИК и электронной спектроскопии поглощения, ВЭЖХ, тонкослойной хроматографии описанным в п 2.6.9, 2.6.10. Полученные спектры и хроматограммы приведены на рисунках 45-48 и 16. трагента использовали хлороформ, объем фракции 25мл. Полученные фракции были проанализированы с помощью ВЭЖХ, хроматограммы представлены на рисунках 17,49. Характеристики ВЭЖХ фракций представлены в таблицах 18,19. Получение экстрактов шрота чаги с применением метилтретбутилового эфира. В колбу на 250мл с обратным холодильником помещали 10 г, шрота чаги (влажность 30%, размер частиц 5-7мм), заливали 100мл МТБЭ, кипятили в течение 2 часов. После этого экстракт отделяли от шрота фильтрованием. Выход экстракта составляет 96±3 мл. Анализ МТБЭ экстрактов из шрота чаги. В полученном экстракте определяли содержание экстрактивных веществ и АОЕ по методикам, описанным в п. 2.6.1-2.6.3, 2.6.11. Данные приведены в таблице 20.
Получение косметических средств на основе спиртовых экстрактов шрота чаги
Получение шампуня. Использована базовая часть рецептуры шампуня, который выпускает ОАО «Аромат». Рецептура приведена в таблице 21. Экстракт чаги - 70%спиртовый экстракт из шрота чаги - введен в водную фазу в процессе приготовления шампуня. Его концентрацию варьировали от 1 до 5%.
Смесь воды , NaCI, лимонной кислоты, раствора аллантоина и экстракта чаги подогревали до температуры 30-35С в процессе перемешивания. Скорость перемешивания 200 об./мин. до полного растворения ингредиентов (10 минут). Вводили необходимое количество кондиционирующей добавки, перемешивание осуществлялось 10 мин , температура 40С, добавляли необходимое количество Техароп и система перемешивалась до полного растворения (60 минут). Далее последовательно были добавлены все остальные ПАВ, консерванты и отдушки.
Определены нормируемые показатели шампуня - содержание хлоридов, пенообразующая способность, рН по [140-142]. В таблице 22 приведены эти показатели для шампуня с содержанием экстракта 4%.
Определена антиоксидантная активность водной фазы шампуня в зависимости от концентрации экстракта чаги. Полученные результаты приведены на рисунке 18.
Получение лосьона для лица. В емкость последовательно загружалась вода, водный раствор лимонной кислоты, этиловый спирт, глицерин и экстракт чаги, рецептура приведена в таблице 23. Определены АОЕ полученных лосьонов (рис 53)
Получение косметического геля. В емкость с расчетным количеством воды загружали 0,4% гелеобразователя-карбомера, перемешивали при комнатной температуре в течении 20 минут при 150 об/мин до полного растворения. Затем добавляли глицерин, экстракт шрота чаги и отдушка, перемешивается и постепенно вводится раствор NaOH. Рецептуры гелей представлена в таблице 24..
Получение дезодоранта-антиперспиранта. Все компоненты были добавлены в емкость и перемешаны. Скорость перемешивания 200 об./мин. до полного растворения ингредиентов (10 минут). Рецептура дезодоранта с экстрактом шрота чаги приведена в таблице 25
Определение содержания экстрактивных веществ в объектах исследования проведены по [142], содержание золы по [142]. Определение содержания меланина проведено по [143];
Количественное определение углеводов в объектах исследования проведено антроновым методом согласно [144,145].
В пробирки наливают по 3 мл антронового реактива и приливают 1 мл исследуемых растворов. Содержимое пробирок перемешивают и ставят на кипящую водяную баню с температурой 95-100 С ровно на 7 мин. Затем пробирки охлаждают до 20 С и определяют плотность сине-зеленой окраски на ФЭКе при X = 590 нм против контрольной пробы. Калибровочную кривую строят по растворам глюкозы (10-100 мкг/мл) — рисунок 2.13
Экстракция шрота чаги метилтретбутиловым эфиром
Известно, что метилтретбутиловый эфир (МТБЭ) обладает высокой экстракционной способностью. Его используют для экстракции из природных объектов простых фенолов. Установлено, что особенностью экстракции в МТБЭ является одновременное образование нескольких экстрагируемых комплексов. По сравнению с другими алифатическими эфирами, МТБЭ обладает более высокой экстракционной способностью и совершенно не образует перекисных соединений. [191,192]
Поскольку ранее было показано высокое содержание фенольных соединений в спиртовых экстрактах их шрота чаги, то была проведена экстракция шрота чаги МТБЭ. Показано, что при использовании данного растворителя удается извлечь до 0,0041 г сухих веществ (табл. 20). На основании УФ спектров можно сказать о наличии сложной смеси веществ различной природы и структурной организации (рис.50). %
С помощью ТСХ (рис. 51,52) было показано значительное количество веществ фенольной природы, (фенолкарбоновые кислоты), наличие веществ тер-пеновой (тритерпены, тетратерпены и сесквитерпены), иридоидной природы, небольшое количество полярных липидов.
Однако при всем разнообразии веществ перешедших в экстракт значения антиоксидантнои активности находятся на низком уровне (0,087Кл/мл). Это можно объяснить низким содержанием в экстракте веществ, проявляющих, АОА.
В качестве экстрагента для получения экстрактов на основе шрота чаги наиболее целесообразнее использование спирта, в связи с высоким выходом экстрактивных веществ (табл. 38).
Спиртовые экстракты из шрота чаги, полученные по способу 2, превосходят по АОА спиртовые настойки промышленного производства и препарат Бефунгин (2,76 ±0,05Кл/мл) в полтора раза. Меланины, выделенные из спиртовых экстрактов, имеют АОА также, в среднем, в полтора раза выше, по сравнению с меланинами, выделенными из препарата Бефунгин (46 ±2,5кКл/100гмеланина). [193]
Содержание экстрактивных веществ в хлороформном и МТБЭ экстрактах из шрота чаги на много ниже, чем в спиртовых экстрактах. По АОС хлороформный экстракт на 2 порядка превосходят МТБЭ экстракт, находится на уровне АОА 70% спиртового экстракта из шрота чаги и превышает АОА спиртовых настоек промышленного производства в 1,5 раза. Можно рекомендовать разработку антиоксиданти ых лекарственных препаратов на основе спиртового и хлороформного экстрактов, а также меланинов, выделенных из спиртовых экстрактов (табл. 27,28,38). Все представленные в таблице 39 экстракты различаются по спектру веществ, способных обеспечить их высокую биологическую активность. Спиртовые, хлороформный и МТБЭ экстракты из шрота чаги можно рекомендовать для создания средств обладающих другими видами терапевтической активности.
Как показано в таблице 39 спиртовые экстракты шрота чаги можно рекомендовать для производства лекарственных препаратов и БАВ, так как они содержат максимальное количество экстрактивных веществ. Хлороформные экстракты шрота чаги по качественному составу повторяют этанольные экстракты с отсутствием фенольных веществ и появлением нейтральных липидов. В МТБЭ экстрактах шрота чаги значительно шире представлены вещества фе-нольной природы, с его помощью удается экстрагировать такие флавонойды как кемпферол, морин, нортарнетин, кверцетин, мирицетин
На кафедре физической и коллоидной химии КГТУ совместно с доцентом Богдановой С.А. были разработаны рецептуры космецевтических средств: лосьон, шампунь, дезодоранта-антиперспирант и гель, обладающих выраженными антиоксидантными свойствами. В качестве антиоксидантной добавки в разрабатываемые рецептуры введен 70% спиртовый экстракт из шрота чаги (СЭШ). При разработке рецептур космецевтических средств варьировалась концентрация этой добавки.
Шампунь с содержанием в качестве антиоксиданта СЭШ Полученный шампунь представляет собой вязкую прозрачную жидкость бледно желтого оттенка. Определены нормируемые показатели - содержание хлоридов, пенооб-разующая способность, рН (табл 21,22.).
Полученный шампунь удовлетворяет всем нормируемым показателям. Определена АОА водной фазы шампуня в зависимости от концентрации СЭШ. В целом с ростом содержания СЭШ АОА образцов увеличивается. Обращает внимание на себя то обстоятельство, что АОА водной фазы шампуня, в котором содержится определенное количество меланина выше, чем для такого же содержания меланина в самом спиртовом экстракте шрота из чаги приблизительно в 10-20 раз. Такое увеличение АОА ранее наблюдалось с уменьшением концентрации меланина в составе шампуня и, возможно, связано с уменьшением размеров глобул меланина. Таким образом, наблюдается синергизм компонентов рецептуры шампуня с компонентом антиоксидантной добавки.
