Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Способы утилизации непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств. методы анализа парацетамола и я-аминофенола (Обзор литературы)
1.1. Характеристика непригодных к использованию лекарственных средств 11
1.1.1. Бракованные лекарственные средства 11
1.1.2. Лекарственные средства с истекшим сроком годности 12
1.1.3. Фальсифицированные лекарственные средства 13
1.2. Способы утилизации непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств 17
1.2.1. Сжигание 20
1.2.2. Слив в канализацию 24
1.2.3. Захоронение на свалках и оборудованных местах 24
. 1.2.4. Биологические способы уничтожения ксенобиотиков 26
1.2.4.1. Использование микроорганизмов для биодеструкции .27
1.2.4.2. Характеристика актинобактерий рода Rhodococcus 30
1.2.4.3. Использование иммобилизованных клеток микроорганизмов 32
1.2 А А. Механизмы микробного окисления 34
1.3. Методы анализа парацетамола и и-аминофенола 36
1.3.1. Идентификация парацетамола 36
1.3.2. Количественное определение парацетамола 38
1.3.3. Методы анализа гс-аминофенола 41
Экспериментальная часть
Глава 2. Объекты, материалы и методы исследования
2.1. Характеристика объектов, вспомогательных материалов,
оборудования и реактивов 45
2.2. Методы исследования 50
ГЛАВА 3. Идентификация продуктов биодеструкции парацетамола. разработка методик количественного определения парацетамола и я-аминофенола
3.1. Разделение парацетамола и возможных его метаболитов методом тонкослойной хроматографии 51
3.1.1. Выбор оптимальной системы растворителей для разделения парацетамола и возможных продуктов его биодеструкции 52
3.1.2. Способы детектирования 54
3.1.3. Чувствительность способов детектирования 56
3.1.4. Хроматографическое исследование возможных продуктов биодеструкции парацетамола 58
3.2. Разработка методик количественного анализа парацетамола и
и-аминофенола 59 3.2.1. Изучение условий проведения реакции и-аминофенола с и-иметиламинобензальдегидом 59
3.2.2. Определение гс-аминофенола в культуральных средах спектрофотометрическим методом 62
3.2.3. Количественное определение парацетамола методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 65
Выводы по главе 3 69
ГЛАВА 4. Биодеструкция лекарственных средств производньіх фенола (на примере парацетамола) актинобактериями рода rhodococcus
4.1. Скрининг активного штамма и выбор объекта биодеструкции из группы ЛС производных фенола 70
4.2. Изучение условий' биотрансформации парацетамола 72
4.3. Влияние вспомогательных веществ на скорость биодеструкции парацетамола и жизнеспособность бактерий Rhodococcus 76
4.4. Адаптация родококков к окислительному стрессу 82
4.5. Использование адаптированных родококков для биодеструкции парацетамола в таблетках и субстанции 84
4.6. Биодеструкция парацетамола иммобилизованными в полимерном криогеле родококками 88
4.7. Разработка технологической документации и ее апробация при утилизации парацетамола на ферментационной установке «Фермус -3» 93
Выводы по главе 4 95
ГЛАВА 5. Изучение свойств шлама, образующегося в процессе биодеструкции парацетамола
5.1. Физико-химические свойства шлама 96
5.2. Исследование токсичности и фитотоксичности шлама 100
Выводы по главе 5 102
Общие выводы 103
Список литературы
- Лекарственные средства с истекшим сроком годности
- Методы анализа парацетамола и и-аминофенола
- Выбор оптимальной системы растворителей для разделения парацетамола и возможных продуктов его биодеструкции
- Изучение условий' биотрансформации парацетамола
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время в Российской Федерации остро обозначилась проблема утилизации непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств — фальсифицированных, забракованных, с истекшим сроком годности или потерявших свои потребительские свойства по тем или иным причинам.
Все некачественные лекарства признаются фармацевтическими отходами и подлежат обязательному уничтожению [28, 123, 180]. Анализ случаев уничтожения таких лекарственных средств на территории Российской Федерации в период с 1997 по 2005 показал отсутствие единой системы проведения этой процедуры и централизованных мест их хранения.
Научно обоснованные методики утилизации лекарственных средств, за исключением наркотических и психотропных, пока не разработаны. Используемыми на практике способами уничтожения являются слив в промышленную канализацию, сжигание на открытом воздухе или захоронение на свалках [91], при этом часто не учитывают физико-химические, токсические свойства лекарственных веществ и протекающие в процессе уничтожения химические процессы. Поэтому исследования по совершенствованию существующих и поиску новых путей утилизации непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств является актуальным.
Анализ исследований в области промышленной технологии
показывает, что наряду с совершенствованием имеющихся методов большое
внимание, особенно за рубежом, уделяется биологическим методам, за
которыми признается несомненный приоритет по показателям
эффективности и безопасности [92, 141].
Природные микроорганизмы используют для обезвреживания химических отходов, в первую очередь, нефтепродуктов [47], тяжелых
металлов [51, 150], полихлорированных фенолов, фосфорорганических [162] и других химических соединений [97, 101, 166, 170].
Ведутся активные поиски новых микроорганизмов, адаптированных к развитию в присутствии чужеродных веществ и вызывающих их биотрансформацию [152, 153, 168].
В качестве эффективных биодеструкторов ксенобиотиков могут быть использованы актинобактерии рода Rhodococcus, которые являются обычными компонентами техногенно-загрязненных сред обитания. Родококки способны усваивать многие труднодоступные для других микроорганизмов органические вещества, в том числе предельные и ароматические углеводороды, фенолы, гетероциклические соединения, что делает использование этой группы микроорганизмов перспективными при разработке биологического способа утилизации непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств. Помимо поиска микроорганизмов-деструкторов токсических веществ, необходимо также изучение влияния на человека и окружающую среду промежуточных и конечных продуктов их трансформации.
Цель и задачи исследования. Оценка возможности использования актинобактерии для биодеструкции непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств, производных фенола.
Для реализации поставленной цели необходимо решение следующих задач:
Провести скрининг активных штаммов актинобактерии рода Я/ю^/ососсг/з-биодеструкторов веществ, производных фенола, и выбрать среди исследуемых лекарственных средств модельное соединение.
Разработать способы идентификации и количественного определения продуктов его биодеструкции.
Установить оптимальные условия процесса биотрансформации.
На примере модельного соединения изучить динамику процесса биодеструкции.
Изучить свойства конечных продуктов биодеструкции (шлама).
На основе полученных результатов разработать технологические схемы и лабораторный регламент процесса утилизации непригодных к медицинскому применению лекарственных средств.
Научная новизна. На примере парацетамола показана возможность биологического способа биодеструкции непригодных к медицинскому применению лекарственных веществ (ЛВ) и их препаратов.
Путем скрининга 82 бактериальных штаммов в качестве деструкторов выбраны 2 штамма актинобактерий рода Rhodococcus. Установлены оптимальные условия процесса: состав среды культивирования; влияние вспомогательных веществ, входящих в состав таблеток парацетамола, на скорость его деструкции; адаптация родококков к фенолу, что расширяет перспективу их использования для биодеструкции других ЛВ, производных фенола. Получены биокатализаторы на основе иммобилизованных в полимерном криогеле поливинилового спирта клеток микроорганизмов, с участием которых идет значительное ускорение процесса биотрансформации парацетамола.
Разработаны методики анализа в культуральных средах: парацетамола методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и его основного метаболита и-аминофенола спектрофотометрическим методом, позволяющие контролировать динамику процесса.
Предложена схема трансформации парацетамола в процессе биодеструкции. Методом тонкослойной хроматографии доказано наличие в культуральных средах и-аминофенола, пирокатехина, гидрохинона, бензохинона и трех неидентифицированных веществ.
Изучены физико-химические свойства, токсичность и фитотоксичность конечных продуктов биодеструкции парацетамола (шлама).
Работа поддержана грантом РФФИ № 04-04-96057.
Практическая значимость. По результатам выполненных исследований разработан лабораторный регламент и представлены технологические схемы утилизации парацетамола. Процесс утилизации парацетамола с положительным результатом апробирован в ОАО «Пермфармация» с использованием ферментационной установки «Фермус — 3» с загрузкой, в 30 раз превышающей загрузку при выполнении эксперимента (акт от 20.11.07 г.).
Результаты работы используются в учебном процессе Пермской государственной фармацевтической академии: в лекционном курсе и на лабораторных занятиях слушателей ФДПО, интернов и студентов на кафедрах фармацевтической технологии и фармацевтической химии ФДПО и ФЗО (акты от 05.04.05 г. и 01.11.07 г.), включены в лабораторный практикум студентов очного отделения биологического факультета Пермского государственного университета (акт от 20.12.07 г.).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию. Номер государственной регистрации 01.9.50 007417.
Апробация работы. Результаты и основные положения диссертационной работы доложены на XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2004; 69-й научно-практической конференции «Медико-биологические проблемы Центрального Черноземья», Курск, 2004; V Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2004; IX Международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий. Экологический катализ», Новосибирск, 2004; XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2005; II Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биопотенциал», Пермь-Казань, 2005; II Всероссийской
9 научно-практической конференции «Техническая химия. Достижения и перспективы», Пермь, 2006; XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2006; XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2007; Научно-практической конференции, посвященной 70-летию Пермской государственной фармацевтической академии, Пермь, 2007.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, из них 6 статей (3 - в изданиях, рекомендованных ВАК).
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Обоснование условий биологического способа деструкции ЛВ,
производных фенола, на примере парацетамола как модельного соединения.
Способы оптимизации процесса деструкции парацетамола.
Методики анализа парацетамола и продуктов его биодеструкции в культуральных средах.
4. Результаты изучения свойств конечных продуктов деструкции
парацетамола.
5. Технологические схемы и лабораторный регламент процесса
биодеструкции парацетамола. ';
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 156 страницах компьютерного текста, содержит 44 таблицы, 24 рисунка, 4 схемы, 4 фотографии, включает введение, обзор литературы (глава 1), экспериментальную часть (главы 2-5), список литературы, содержащий 181 библиографический источник, из которых 46 на иностранных языках, и Приложение.
10 Принятые в работе сокращения
Лекарственные средства с истекшим сроком годности
Число случаев появления на фармацевтическом рынке поддельных препаратов растет во всем мире [25]. Подделкой лекарств занимаются как никому не известные производители, которые чаще всего не оформляют свою деятельность и производят лекарственные средства в условиях, не отвечающих нормативным требованиям, так и юридические лица, производящие ЛС на законных основаниях. Стоимость оригинальных ЛС, кроме затрат, связанных с их производством, включает в себя большие затраты на разработку, проведение доклинических и клинических исследований и др. Производители поддельных ЛС, не неся соответствующих затрат, получают сверхдоходы. Поддельные ЛС кроме финансового ущерба фирме-разработчику препарата и государству в виде неуплаченных налогов, могут принести вред здоровью человека, поэтому они представляют огромную опасность [32,126].
Выделяют четыре группы поддельных ЛС: к первой группе относятся ЛС, не содержащие действующих веществ в соответствии с составом, указанным в аннотации, так называемые «пустышки». Подделки этой группы с точки зрения негативного воздействия на организм можно считать самыми безобидными. Разумеется, если при их производстве были соблюдены элементарные санитарные правила. Однако и "пустышки" могут быть опасными в экстренных случаях, когда речь идет о необходимости срочного приема жизненно важного лекарства для тяжело больного человека.
Вторую группу составляют "лекарства", в которых действующее вещество присутствует, но не то, которое указано на упаковке. Такие подделки уже не так безобидны, так как содержащееся в нем вещество может оказаться противопоказанным для больного и тем самым спровоцировать новые проблемы со здоровьем.
В третьей группе подделок лекарственное вещество присутствует, но оно содержится в меньшем количестве, чем указано на этикетке (в отдельных случаях - в большем). По мнению экспертов, "производители" ограничиваются, как правило, введением 20-30% действующего вещества.
И, наконец, к четвертой группе фальшивок относятся ЛС, содержащие действующие вещества по составу и количеству соответствующие данным, приведенным на этикетке, но изготовленные не тем производителем, который указан, а как правило, не имеющим лицензии. Маскируется он чаще всего потому, что не может обеспечить соблюдения правил производства и, следовательно, необходимого качества препарата [3, 78].
Возможность попадания поддельных ЛС на рынок необходимо исключать как экономическими, так и правовыми способами. В нормативных актах и научной литературе, посвященной проблеме борьбы с поддельной продукцией, встречаются два термина: фальсификация и контрафакция. Очевидно, что для того, чтобы эффективно бороться с поддельными ЛС, необходимо придерживаться более строгого понятийного аппарата [32].
Всемирная организация здравоохранения в марте 1992 г. на симпозиуме ВОЗ/IFPMA так определила фальсифицированное ЛС: «Фальсифицированным (контрафактным) лекарственным средством является продукт, преднамеренно и противоправно снабженный этикеткой, неверно указывающей подлинность препарата и (или) изготовителя. Фальсификации могут подвергаться как оригинальные, так и воспроизведенные ЛС; контрафактные продукты могут включать в себя препараты, содержащие ингредиенты, соответствующие этикетке, не соответствующие этикетке, не содержащие активных ингредиентов или в фальсифицированной упаковке».
В 2004 г. были внесены дополнения в ст. 4 Федерального закона от 22.06.98 № 86-ФЗ «О лекарственных средствах» (в ред. Федерального закона от 22.08.04 № 122-ФЗ). В них дано законодательное определение фальсифицированного лекарственного средства как лекарственного средства, сопровождаемого ложной информацией о составе и (или) о производителе ЛС. Здесь же введено понятие «недоброкачественное лекарственное средство» как ЛС, пришедшее в негодность, и (или) ЛС с истекшим сроком годности [112].
В проекте Специального технического регламента «О требованиях к безопасности ЛС, процессам их разработки, изготовления, производства, испытания, хранения, перевозки, реализации, применения и утилизации» от 31.07.2006 г. в ст. 3 [93] также дано определение ФЛС: «Фальсифицированный лекарственный продукт или активное вещество -продукт или вещество, преднамеренно сопровождаемое ложной информацией о составе и/или производителе».
Методы анализа парацетамола и и-аминофенола
Микроорганизмы поглощают углеводороды всей поверхностью клетки или через особые «каналы» в клеточных стенках. Известны два этапа транспорта углеводородов в клетку. Начальный осуществляется пассивно-диффузионным путем (без затрат энергии) и представляет собой молекулярную сорбцию углеводорода (молекулы проникают через всю клеточную стенку до плазматической мембраны без каких-либо изменений своей структуры). Следующий этап — метаболический процесс, при котором происходит активный транспорт углеводорода через цитоплазматическую мембрану (растворение его в липидах цитоплазматической мембраны). Согласно этому представлению, ферментные системы, ответственные за окисление углеводородов, не связаны с клеточной оболочкой, а локализованы в мембранных структурах клеток или цитоплазме. Значительная роль в процессе пассивно-диффузионного поглощения углеводородов принадлежит липидам внешних слоев клетки. Представители рода Rhodococcus обладают мощной липофильной клеточной стенкой, специфическим липидным компонентом которых являются миколовые кислоты - высокомолекулярные ациклические Р-оксикислоты с длинной алифатической цепью [111]. Благодаря этому, данные микроорганизмы способны легко поглощать гидрофобный субстрат.
Родококки растут на различных ароматических соединениях и при этом используют большинство классических путей метаболизма ароматического кольца: мета- и ортиорасщепление пирокатехина и ортио-расщепление пирокатехиновой, гентезиновой и гомогентезиновой кислот [158, 159, 173]. Они обладают способностью метаболизировать галогенированные ароматические соединения. Многие родококки способны усваивать фенол, как единственный источник углерода и энергии Rhodococcus sp. PI гидроксилируют фенол фенольной гидролазой с образованием пирокатехина [33, 79, 98]. Механизмы разрушения ароматических ксенобиотиков в литературе описаны достаточно подробно. Изучение их микробного метаболизма началось в 40-х г., когда W.C. Evans описал процесс окисления фенола и бензола почвенными бактериями [152]. Период наиболее интенсивного исследования этого процесса, пришедшийся на 60 и 70-е гг., завершился опубликованием ряда фундаментальных и обзорных работ по микробной деструкции аренов [4, 16, 40, 53]. Установлено, что метаболизм производных бензола начинается с одной из трех основных реакций — монооксигенирования ароматического кольца, диоксигенирования кольца или окисления боковой цепи при ее наличии.
Катаболизм алкилзамещенных аренов характеризуется разнообразием путей энзиматической атаки на молекулу ксенобиотиков. Так, биоконверсия толуола может происходить с последующим образованием бензилового спирта, бензальдегида, бензойной кислоты и пирокатехина, либо продуктов непосредственного гидроксилирования кольца. При изучении биотрансформации а-метилстирола установлено наличие достаточно большого числа различных промежуточных продуктов, образующихся в результате окисления как метильной группы, так и бензольного кольца. Описаны, как минимум, два пути микробной трансформации нитрофенолов: восстановительный (с образованием аминоароматических интермедиатов) и окислительный (с образованием оксифенолов). Для процессов окисления характерны различные варианты гидроксилирования кольца. Биодеструкция галоген-, амино-, сульфо- и ряда других замещенных аренов также изучена достаточно полно. Показано, что отщепление заместителей может происходить как до, так и после разрыва бензольного кольца. Разрушение молекул, содержащих несколько ароматических колец, осуществляется обычно путем их последовательного раскрытия [20, 34, 35].
Shinji Takenaka, Susumu Okugawa и др. исследовали путь трансформации 4-аминофенола штаммом АК-5 Burkholderia sp. Механизм метаболизма устанавливали, основываясь на идентификации трех известных метаболитов с использованием газовой хроматографии и масс-спектрального анализа. Штамм АК-5 превращал 4-аминофенол в 1,2,4-тригидроксибензол или 1,4-дигидроксибензол. Активная 1,2-диоксигеназа расщепляет бензольное кольцо с образованием малеилуксусной кислоты. Фермент показал высокую диоксигеназную активность только в отношении 1,2,4-тригидроксибензола [179].
Таким образом, актинобактерии рода Rhodococcus являются перспективными для использования их при разработке биотехнологического способа утилизации непригодных к медицинскому использованию ЛС. В то же время в изученной нами литературе нет сведений об использовании родококков для утилизации ЛС, поэтому этот вопрос является актуальным и требует соответствующих научных исследований.
Важной проблемой применения микроорганизмов-деструкторов является необходимость точного прогноза результатов их ферментативной активности в отношении целевого соединения. Образование продуктов частичной трансформации, экотоксически не менее опасных, чем исходное соединение, при применении микробных культур должно быть полностью исключено.
Выбор оптимальной системы растворителей для разделения парацетамола и возможных продуктов его биодеструкции
Данные о микробной деструкции ЛВ в доступной литературе нами не обнаружены. Однако проводятся исследования по изучению микробной деструкции фенола и его производных, к которым относится 2,4 динитрофенол [146], хлорфенолы [142], бензойная кислота [147], салициловая кислота [165], [180]. Предположительно существует два типа метаболизма ароматических субстратов — аэробный и анаэробный. Аэробная биотрасформация простых ароматических соединений инициируется введением в молекулу одной или двух гидроксильных групп под действием моно- или диоксигеназ. Далее катехол подвергается орто- или мета-расщеплению ароматического кольца с образованием соответствующих производных муконовой кислоты. Эти не ароматические продукты дальше окисляются до воды и диоксида углерода. Если в бензольном кольце имеются заместители, то они могут преобразовываться и отщепляться как до, так и после раскрытия кольца. Разложение ароматических кислот может начинаться с неокислительного декарбоксилирования, приводящего к образованию фенолов, которые затем окисляются в линейные непредельные дикарбоновые кислоты [144]. Ведутся исследовательские работы по изучению анаэробных микробных сообществ, разлагающих аминобензойную и аминосалициловую кислоты и их изомеры [101].
Изучение процессов трансформации требует подходящих методов анализа образующихся при этом продуктов. Используемые методы анализа должны быть чувствительными и селективными, что позволит проводить опыты в малых объемах, при минимальных затратах времени и материалов.
Этим требованиям отвечают хроматографические и спектрофотометрические методы. На основе литературных данных биодеструкцию парацетамола можно представить схемой, которая применима к аэробным микроорганизмам, какими являются актинобактерии рода Wiodococcus.
Как показывают теория и практика, разрешающая способность системы растворителей максимальна в области значений Rf = 0,5 и уменьшается при изменении этой величины как в сторону старта, так и в сторону фронта [127, 131]. В связи с этим для хроматографического разделения исследуемой смеси веществ следует пользоваться системой растворителей, в которой зоны отдельных компонентов располагаются вблизи области оптимального значения Rf и в то же время хорошо разделяются между собой. Нами апробированы десять вариантов составов подвижных фаз, часть из которых взята из библиографических источников [63, 64, 128], другая выбрана в результате предварительных экспериментов: 1. Хлороформ-ацетон (9:1) 2. Хлороформ-ацетон (8:2) 3. Диоксан-ацетон-аммиак25%-хлороформ (47,5:5:2,5:45) 4. Бензол-диоксан- кислота уксусная ледяная (95:25:4) 5. Бензол-циклогексан- кислота уксусная ледяная (95:25:4) 6. Спирт этиловый 95%-аммиак 25%-вода (80:4:16) 7. Пиридин-петролейный эфир (1:2) 8. Хлороформ-спирт этиловый 95% (7:3) 9. Гексан-этилацетат (85:15) 10 Хлороформ-спирт этиловый 95% (8:2)
Подготовка камеры Указанные растворители отмеривали цилиндром и смешивали в колбе с притертой пробкой. Стенки камеры обкладывали фильтровальной бумагой для лучшего насыщения парами растворителя всего объема камеры, помещали в камеру подготовленную подвижную фазу и оставляли для насыщения на 30 мин.
Приготовление растворов хроматографируемых веществ Готовили 0,2% растворы парацетамола, и-аминофенола, пирокатехина, гидрохинона, бензохинона, фенола в спирте этиловом 95% и 0,2% раствор муконовой кислоты в водно-спиртовом растворе (1:1) при нагревании; 0,01 мл каждого из них содержит 20 мкг вещества.
Методика На линию старта (1,5 см от края пластинки) в отмеченные точки с помощью капилляров наносили 0,01 мл растворов парацетамола, гс-аминофенола, пирокатехина, гидрохинона, бензохинона, фенола и муконовой кислоты. Пробы высушивали на воздухе 10 мин и помещали вертикально в хроматографическую камеру, насыщенную парами подвижной фазы [131]. Затем пластинки вынимали и сушили на воздухе 10-15 мин (до удаления запаха подвижной фазы).
Изучение условий' биотрансформации парацетамола
Биотрансформацию парацетамола изучали в условиях периодического культивирования родококков в колбах Эрленмейера объемом 250 мл на шейкере (160 об/мин) при 28 С. В качестве посевного материала служила 48-часовая бактериальная культура Rhodococcus ruber ИЭГМ 77 и Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 767, предварительно выращенная на мясо-пептонном агаре и подготовленная, согласно стандартной методике, которую добавляли в количестве 3 мл с содержанием бактериальных клеток 10 клеток/мл.
В результате проведенных исследований установлено, что интенсивность процесса зависит от состава среды культивирования родококков. Парацетамол использовали в виде субстанции и готовой лекарственной формы - таблеток (ЗАО «Медисорб», Пермь), содержащих 0,2 г парацетамола и 10% вспомогательных веществ в каждой таблетке.
Предварительно в таблетках определяли содержание парацетамола в соответствии с НД. В работе для культивирования родококков использовали две минеральные среды «Киевская» («К») и «RS», состав которых приведен ранее (раздел 2.1).
Контролем служили растворы изучаемых лекарственных веществ в минеральных средах, не инфицированных бактериальной культурой. Продолжительность эксперимента составляла 25 суток. По данным микробиологического анализа через 3-е суток биодеструкции парацетамола наблюдалось резкое снижение численности клеток родококков в обеих средах культивирования, поэтому для продолжения процесса биодеструкции парацетамола добавляли свежий инокулят микроорганизмов. На протяжении всего эксперимента через каждые 5 суток в среду инкубирования родококков вносили свежую бактериальную суспензию. Выживаемость бактериальных клеток определяли по стандартной методике подсчета колониеобразующих единиц на плотных питательных средах [26, 70].
Как видно из рис. 4.1, при повторном внесении бактерий в минеральную среду «К» число жизнеспособных клеток родококков увеличивалось. Аналогичная картина наблюдалась и в случае использования среды культивирования «RS». Следует отметить, что биодеструкция парацетамола в таблетированной форме в среде «К» и особенно в среде «RS» происходила значительно быстрее, чем в субстанции, что может быть объяснено наличием вспомогательных веществ, которые могут служить дополнительным источником питания для актинобактерий. Динамику процесса биодеструкции оценивали по результатам количественного определения парацетамола и п-АФ. Содержание парацетамола определяли методом ВЭЖХ (раздел 3.2.3). Результаты количественного определения парацетамола в процессе биотрансформации в субстанции и таблетках в разных минеральных средах с использованием актинобактерий Rhodococcus ruber ИЭГМ 77 и Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 767 представлены в таблице 4.3 и 4.4 Приложения. На рис. 4.2 и 4.3 показано изменение содержания парацетамола, введенного в культуральную среду в виде субстанции и таблеток, при использовании актинобактерий R. ruber ИЭГМ 77 и Я erythropolis ИЭГМ 767 в среде «RS».
Параллельно в культуральных жидкостях определяли содержание «-АФ спектрофотометрическим методом по методике, основанной на реакции конденсации с и-диметштаминобензальдегидом (раздел 3.2.2).
Результаты количественного определения п-АФ в процессе биотрансформации парацетамола в субстанции и таблетках в разных минеральных средах клетками Rhodococcus ruber ИЭГМ 77 и Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 767 представлены в табл. 4.5 и 4.6 Приложения.
